Aanmaken en toepassen van een verwijzing ter vergemakkelijking van de discussie en de indeling van de eiwitten in een Diverse groep
August 16th, 2017
Het doel van dit protocol is het ontwikkelen van een verwijzing voor uiteenlopende eiwitten in een groep die ontbreekt aan coherente criteria voor nomenclatuur en classificatie. Deze referentie zal vergemakkelijken, analyses en discussie van de groep als geheel en kan worden gebruikt naast gevestigde namen.
Het algemene doel van deze procedure is om standaard spreadsheetsoftware te gebruiken om een referentie te ontwikkelen voor divergente eiwitten in een groep die geen coherente criteria voor nomenclatuur en classificatie heeft. Deze methode kan helpen bij het verduidelijken van relaties tussen verwante eiwitten met verwarrende of inconsistente nomenclatuur, zoals de cysteïne-gestabiliseerde alfa-bèta-superfamilie van verdedigingspeptiden die ongewervelde verdedigingen omvat. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige visuele weergave biedt van de eiwitten van belang.
Om te beginnen, identificeer de definiërende kenmerken van de eiwitgroep van belang. Bijvoorbeeld, de CS alfa-bèta vouwing in de oplossingsstructuur van insectenverdediging en hulp van phormia terraenovae definieert de CS alfa-bèta superfamilie. Deze vouwing omvat ook een kleiner motief genaamd de cysteïne-gestabiliseerde helix, dat wordt geïdentificeerd door CXXXC stroomopwaarts van een CXC.
De vier cysteïnes vormen twee disulfidebindingen. Om de CS alfa-bèta-motief te voltooien, wordt een derde disulfidebinding gevormd door een extra paar cysteïnes. Uiteindelijk is het van cruciaal belang om ten minste enkele belangrijke kenmerken te kennen die gerelateerd zijn aan de structuur of functie van het eiwit.
Zonder dit is er geen basis voor het genereren van een referentie. Voer nu deze definiërende kenmerken in een spreadsheet in. Gebruik kolommen voor de geconserveerde kenmerken en om de ruimtes tussen deze kenmerken weer te geven.
Houd de kolommen breed genoeg om nummers te passen en geef ze een consistente breedte. In de rijen beschrijf je de sequenties. Om een sequentie als kenmerk aan te geven, vul de kenmerkbox met kleur in, met behulp van de vulfunctie.
Vervolgens, om de ruimte tussen de kenmerken aan te geven, voer je het aantal aminozuren in het vak ertussen in. Voeg nu representatieve sequenties toe die eerder zijn vastgesteld als leden van de groep op basis van structurele databases en gepubliceerde resultaten. Voeg indien nodig kenmerken toe die waarschijnlijk een subgroep van sequenties zullen definiëren, zoals een extra cysteïne.
Als kenmerken ontbreken in een bepaalde sequentie, laat de box ongevuld en combineer deze met boxes die tussenliggende aminozuren vertegenwoordigen. Gebruik hiervoor de functie Samenvoegen en centreren. Zodra representatieve sequenties zijn ingevoerd, identificeer groepen van duidelijk verwante sequenties.
Vervolgens, vat de kenmerken van deze groepen samen. Wanneer het aantal aminozuren tussen kenmerken varieert, gebruik dan een streepje om een bereik aan te geven of slashes om een paar specifieke getallen aan te geven. Annoteer indien nodig creatief kenmerken die relevant kunnen zijn of niet vaak genoeg voorkomen om in de referentie op te nemen.
Bijvoorbeeld, omdat cysteïnes belangrijk zijn in de superfamilie, kan de aanwezigheid van extra cysteïnes worden gelabeld. Soms, wanneer nieuw geïdentificeerde sequenties aan de spreadsheet worden toegevoegd, vallen de sequenties van een soort in verschillende groepen van de superfamilie, zoals voor tardigraden. Eenmaal voltooid, kunnen de rijen van de spreadsheet worden gesorteerd om variatie binnen een soort of variatie tussen taxonomische groepen te benadrukken.
Deze demonstratie gebruikt de gratis beschikbare MEGA 6-software. Echter, andere software kan op dezelfde manier worden gebruikt. Om een nieuwe uitlijning te starten, selecteer Bewerken/Uitlijning bouwen onder het tabblad Uitlijnen.
Selecteer vervolgens Een nieuwe uitlijning maken, in het vak dat verschijnt en klik op OK. Selecteer vervolgens Eiwit. Selecteer nu Insert Sequence from File, in het Bewerken menu, om de sequenties te importeren. De sequenties moeten in FASTA-formaat zijn.
Achtergrondkleuren die verschillende aminozuurtypen weerspiegelen, worden standaard getoond en kunnen worden uitgeschakeld met een schakelaar, onder het menu Weergeven. Zodra alle sequenties zijn ingevoerd, klikt u op het buigzame armpictogram en vervolgens op Eiwit uitlijnen om de sequenties uit te lijnen met behulp van het muscle-algoritme. Als de melding, Niets geselecteerd voor uitlijning.
Selecteer alles? verschijnt, kiest OK. Sommige parameters kunnen worden gewijzigd in het pop-upvenster, maar voor deze demonstratie zijn de standaardinstellingen voldoende. Controleer nu de uitlijning op basis van de belangrijke kenmerken van de eiwitsuperfamilie.
De bovenste balk toont een sterretje op elke positie waarin het aminozuur volledig behouden is. De initiële uitlijning identificeert drie van de vier geconserveerde cysteïnes. Eén sequentie is duidelijk verkeerd uitgelijnd.
Om een verkeerd uitgelijnde sequentie te herstellen, markeer de streepjes en druk op de Delete-toets zonder per ongeluk aminozuren te verwijderen. Beweeg vervolgens de aminozuren in hun juiste uitlijning door spaties toe te voegen. Na het handmatig uitlijnen van de sequentie, merkt u op dat het laatste cysteïne van het CXXXC-motief gedurende de hele uitlijning is behouden.
Handmatige aanpassing is vaak nodig om prioriteit te geven aan de belangrijkste kenmerken van de sequenties. De spreadsheet-uitlijning van de eerder vastgestelde CS alfa-bèta superfamilie onthulde vijf basispatronen van bindingsvorming. De nieuw geïdentificeerde tardigrade-sequenties vielen in het volledige spectrum van deze patronen.
Vervolgens werden fylogenetische analyses gebruikt om te onderzoeken hoe deze groep eiwitten zich mogelijk heeft ontwikkeld. De sequenties zijn echter over het algemeen kort en sterk gedivergeerd. Daarom waren de resulterende bomen slecht opgelost en boden ze weinig inzicht.
De meervoudige sequentie-uitlijning werd geoptimaliseerd met behulp van de referentie, maar er was nog steeds een slechte resolutie in de maximum-likelihood-analyse en in de Bayesiaanse fylogenetische analyse. De meeste clades hadden slechts een lage mate van ondersteuning. Er waren echter vijf kleine groepen ondersteund in ten minste een van de twee bomen.
Sequenties met verschillende cysteïne-nummers binnen een taxonomische groep kunnen nauwer verwant zijn dan sequenties met hetzelfde patroon uit verschillende groepen. Na het bekijken van deze video, zou je een goed begrip moeten hebben van hoe spreadsheetsoftware te gebruiken om
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol heeft tot doel een referentie te creëren voor divergente eiwitten binnen een groep die momenteel gebrek heeft aan coherente nomenclatuur en classificatiecriteria. Door de relaties tussen verwante eiwitten te verduidelijken, zal deze referentie discussies en analyses van de groep verbeteren.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Eiwitchassificatie
- Biologische nomenclatuur
- Defensieve peptiden
Achtergrond
- De cysteïne-gestabiliseerde alpha-beta-superfamilie omvat verschillende defensieve peptiden.
- Inconsistente nomenclatuur bemoeilijkt de studie van verwante eiwitten.
- Standaard spreadsheetsoftware kan worden gebruikt voor visuele weergave.
- Definërende kenmerken helpen bij het identificeren van eiwitgroepen.
Doel van Studie
- Om een coherente referentie te ontwikkelen voor divergente eiwitten.
- Om een beter begrip en communicatie over eiwitrelaties te bevorderen.
- Om te helpen bij de classificatie van eiwitten met verwarrende nomenclatuur.
Gebruikte Methoden
- Gebruik van standaard spreadsheetsoftware voor dataorganisatie.
- Identificatie van definerende kenmerken van eiwitgroepen.
- Visuele weergave van eiwitten om relaties te verduidelijken.
- Focus op de cysteïne-gestabiliseerde alpha-beta-structuur en bijbehorende motieven.
Belangrijkste Resultaten
- Een duidelijke referentie voor divergente eiwitten werd vastgesteld.
- Relaties tussen eiwitten werden visueel weergegeven.
- Verwarrende nomenclatuur werd aangepakt door middel van systematische classificatie.
- Inzichten in de cysteïne-gestabiliseerde alpha-beta-superfamilie werden verkregen.
Conclusies
- Het protocol biedt een waardevol hulpmiddel voor eiwitchassificatie.
- Het verbetert het begrip van eiwitrelaties binnen de groep.
- Deze methode kan worden toegepast op andere eiwitfamilies die gebrek hebben aan coherente nomenclatuur.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Protein classification challenges can impede target validation and comparative analyses across discovery programs, especially when nomenclature and sequence diversity obscure functional relationships. Establishing a reference framework that prioritizes structural and activity-related features enables more reliable placement of new sequences and supports cross-functional R&D discussions. This approach enhances predictive confidence and portfolio decision-making for protein families with high sequence divergence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Clarifies functional relationships among divergent proteins for robust target validation.
- Enables systematic interrogation of sequence-activity relationships within protein superfamilies.
- Supports biological de-risking by highlighting conserved structural motifs relevant to mechanism.
- Facilitates portfolio triage by providing a coherent framework for new sequence integration.
Screening & Assay Development
- Prepares validated reference sets for downstream assay development and screening workflows.
- Improves reproducibility and standardization by anchoring assays to conserved sequence features.
- Enables scalable evaluation of novel sequences against established structural benchmarks.
- Supports reliable compound evaluation by clarifying sequence-function context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sequence classification with disease-relevant structural features when applicable.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling consistent annotation.
- Reduces mechanistic ambiguity in translational studies involving diverse protein families.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying evolutionary and functional relationships.
Pipeline & Workflow Integration
This reference-based method integrates into the discovery continuum from early target identification through lead optimization, especially for protein families with complex sequence diversity.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by mapping conserved features across divergent sequences.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility by standardizing sequence annotation and alignment.
- Analytics: Delivers quantitative outputs for comparing sequence features and supporting statistical analyses.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and preclinical continuity when structural motifs are disease-relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable classification framework adaptable to new protein groups and evolving datasets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in protein classification.
- Operational Value: Standardizes sequence annotation, improving reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying sequence-function relationships.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of protein-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein structure, sequence analysis, and spreadsheet-based annotation.
- Needs access to sequence databases, alignment tools, and visualization software.
- Demands cross-team agreement on feature prioritization and annotation standards.
- May require adaptation for different protein families or taxonomic groups.
- Manual curation and iterative revision are necessary to maintain reference accuracy and relevance.
