Name: Tellen van eiwitten in afzonderlijke cellen met adresseerbare Droplet Microarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Leer eiwitten tellen in afzonderlijke cellen met adresseerbare droplet-microarrays. Deze methode kwantificeert p53-expressie in kankercellen en onthult heterogeniteit in eiwitniveaus binnen cellpopulaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ASR ontworpen experimenten, protocollen ontwikkeld en geanalyseerd gegevens. SC en PS cel grootte experimenten uitgevoerd. ASR en OC schreef het manuscript. De auteurs willen nogmaals mijn dankbaarheid uitspreken de steun van Prof. David R. Klug voor het verstrekken van toegang tot apparatuur. De auteurs bedank de Imperial College geavanceerde Hackspace voor toegang tot de fabricage en prototyping faciliteiten.

<ol><li>Willison, K. R., Klug, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single+cell+and+single+molecule+proteomics+for+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).</li>
<li>Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+tools+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis tools for drug discovery and development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).</li>
<li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).</li>
<li>Salehi-Reyhani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+first+step+towards+practical+single+cell+proteomics%3A+a+microfluidic+antibody+capture+chip+with+TIRF+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection.</a> Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).</li>
<li>Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressable+droplet+microarrays+for+single+cell+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis.</a> Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).</li>
<li>Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).</li>
<li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).</li>
<li>Ramji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+kinase+signaling+assay+using+pinched+flow+coupled+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics.</a> Biomicrofluidics. 8 (3), 34104(2014).</li>
<li>He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+encapsulation+of+single+cells+and+subcellular+organelles+into+picoliter-+and+femtoliter-volume+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets.</a> Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).</li>
<li>Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+TIRF+microscopy+to+quantify+and+confirm+efficient+mass+transfer+at+the+substrate+surface+of+the+chemistrode%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode.</a> New J. Phys. 11 (31), 75017(2009).</li>
<li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+picoliter+droplet+array+for+parallel+real-time+polymerase+chain+reaction+based+on+double-inkjet+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing.</a> Lab Chip. 14 (18), 3603(2014).</li>
<li>Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Microarray+Based+on+Superhydrophobic-Superhydrophilic+Patterns+for+Single+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis.</a> Microarrays. 5 (4), 28(2016).</li>
<li>Yen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Pico-Liter+Droplet+Microarray+for+Ultrasensitive+Nucleic+Acid+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification.</a> ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).</li>
<li>Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floating+droplet+array%3A+An+ultrahigh-throughput+device+for+droplet+trapping%2C+real-time+analysis+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery.</a> Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).</li>
<li>Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Karthikeyan_Narayanan2/publication/257690809_Elucidating_drug_resistance_properties_in_scarce_cancer_stem_cells_using_droplet_microarray/links/554ac2700cf29752ee7c3360.pdf">Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray.</a> Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).</li>
<li>Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/-/content/articlelanding/2016/ra/c6ra06011k">Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings.</a> RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+nanoinjection+for+high-thoughput+chemiluminescence+immunoassay+on+multicapillary+glass+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate.</a> Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).</li>
<li>Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter-scale+protein+crystallization+and+screening+with+a+microfluidic+droplet+robot%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot.</a> Sci. Rep. 4, 5046(2014).</li>
<li>Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-in-oil+array+for+picoliter-scale+analysis+based+on+sequential+inkjet+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing.</a> Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).</li>
<li>Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22One+cell-one+well%22%3A+A+new+approach+to+inkjet+printing+single+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">"One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays.</a> ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).</li>
<li>Yusof, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet-like+printing+of+single-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+a+Chip+-+Miniaturisation+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inkjet-like printing of single-cells.</a> Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).</li>
<li>Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+2-dimentional+droplet+array+for+single-cell+reverse+transcription+quantitative+PCR+assay+with+a+microfluidic+robot%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot.</a> Sci. Rep. 5, 9551(2015).</li>
<li>Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23114283">Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications.</a> Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).</li>
<li>Kozak, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-volume+wall-less+immunoassays+using+patterned+planar+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates.</a> Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).</li>
<li>Yen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Pico-Liter+Droplet+Microarray+for+Ultrasensitive+Nucleic+Acid+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification.</a> ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).</li>
<li>Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2072-666X/2/2/179/htm">Microvalves and Micropumps for BioMEMS.</a> Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).</li>
<li>Lai, H. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+use+of+laser-based+lysis+for+cell+analysis+on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip.</a> J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).</li>
<li>Salehi-Reyhani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+advantages+and+constraints+in+miniaturized+capture+assays+for+single+cell+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis.</a> Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).</li>
<li>Brown, R. B., Audet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+techniques+for+single-cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Current techniques for single-cell lysis.</a> J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).</li>
<li>Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+effects+on+enzyme+activity+and+solubilization+of+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes.</a> BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).</li>
<li>Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/microfluidic-single-mammalian-cell-lysis-in-picolitre-droplets-2155-6210.S12-001.php?aid=14625">Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets.</a> J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).</li>
<li>Burgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+protein+copy+number+using+a+single-molecule-sensitive+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray.</a> Analyst. 139 (13), 3235(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Adresseerbaar Droplet Microarrays is een gevoelige en uitbreidbare methode voor het kwantitatief bepalen de absolute exemplaaraantal van eiwit in een enkele cel.
Beperking van het niveau van niet-specifieke binding is (NSB) kritisch in het protocol bij het bereiken van een limiet van detectie mogelijk zo laag. Eiwitten en andere biochemische soorten kan niet-specifiek binden aan een aantal interfaces aanwezig binnen de druppels — het dekglaasje aan oppervlak, het antilichaam ter plaatse en de ...

Het doel van deze methode is het bepalen van de variatie in overvloed van een doel-eiwit in een celpopulatie met eencellige resolutie. Eencellige analyse biedt een aantal voordelen die niet beschikbaar met traditionele ensemble biochemische methoden. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 in de eerste plaats werken op het niveau van eencellige kan vangen de rijke heterogeniteit van een celpopulatie die anders verloren zou gaan door de gemiddeld dat met traditionele ensemble biochemische technieken optreedt. De meerderheid van de biochemische methoden werkpaard werken met het grootste deel, waarbij, zoals ze vaak doen, miljoenen cellen om een resultaat te produceren. Natuurlijk, de gevolgen voor de beoordeling van de gehele cel populaties hangt af van een aantal factoren, bijvoorbeeld de heterogeniteit in eiwit expressie waar enkele belangrijke kenmerken van de verdeling van eiwit overvloed kunnen worden gemist. Vanuit een praktisch perspectief, de gevoeligheid van eencellige technieken vereist maken hen geschikt voor het werken met hoeveelheden van biologisch materiaal dat onvoldoende is voor zelfs de meer gevoelige bulk technieken om te kunnen functioneren. Een belangrijk voorbeeld hiervan is de studie van zeldzame celtypes zoals circulerende tumorcellen (CTCs) waar zelfs voor patiënten met een slechte prognostische vooruitzichten minder dan 10 CTCs zou aanwezig zijn in een één 7,5 mL bloed trekken. 6 hier presenteren we de methodologie die is vereist voor het uitvoeren van eencellige eiwit metingen met behulp van een verminderde volume antilichaam gebaseerde assay met druppels olie-afgetopte op een microarray antilichaam afgedrukt.
Microfluidic druppel perrons zijn hoge doorvoer, staat voor het genereren van duizenden druppeltjes per seconde, en geschikt voor isoleren, en zelfs kweken, afzonderlijke cellen in afzonderlijke druppels voor het uitvoeren van een breed scala van biochemische tests. Druppel gebaseerde technieken zijn geschikt voor eencellige analyse,7,8,9 met opmerkelijke recente voorbeelden, waaronder DropSeq10 en inDrop11, die aanzienlijk door de kracht van geholpen hebben amplificatie technieken. De beperkte hoeveelheid materiaal en geen methoden voor amplificatie voor eiwitten maken eencellige proteomics vooral een uitdaging.
Druppels kunnen worden geanalyseerd door een aantal methoden en fluorescentie microscopie is wijd verbeid gebruikt. Enkel molecuul technieken zoals de totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie kunt fluorescerende moleculen aan met ongeëvenaarde signal-to-noise verhouding worden gevisualiseerd. 12 als gevolg van de exponentiële afname van het vluchtig veld, alleen fluorophores in de nabijheid van de hoog aan de oppervlakte (volgorde van 100nm) zijn enthousiast maken TIRF een goede strategie voor het opsporen van kleine hoeveelheden van een doelmolecule in een complex mengsel. De inherente optische vectorafbeeldingsbestanden sterkte van TIRF helpt ook om te voorkomen dat wassen stappen en grenzen assay tijd en complexiteit. Echter TIRF vereist vlakke oppervlakken en voorbeelden van TIRF microscopie toegepast op druppels in stroom betrekking hebben op de vorming van een vlakke oppervlakte van die afbeelding. 13 daarom eencellige proteomic technieken vaak ontwerpen microfluidic chips rond oppervlak-geïmmobiliseerd vangen agenten in een microarray opmaken. 4 , 14
De druppels, zelf, kunnen worden gevormd in matrices op vlakke oppervlakken, zogenaamde druppel microarrays. 15 , 16 , 17 ruimtelijk ordenen druppels in arrays kan ze gemakkelijk kunnen worden gunstig geïndexeerd, gecontroleerd na verloop van tijd, individueel gericht en, indien nodig, ontvangen. Druppel microarrays kan het bereiken van een hoge dichtheid van micro-reactoren met duizenden elementen per spaander die vrijstaande of ondersteund door microwell structuren zijn. 18 , 19 , 20 zij kunnen worden gevormd door opeenvolgende afzetting door liquid handling-robots, inkjet spotters, neem contact op met microarrayers21,22,23,24,25, 26 , of ze kunnen zichzelf monteren op oppervlakken zoals superhydrophillic plekken patroon op een superhydrophobic ondergrond. 27 , 28 , 29
Met deze overwegingen in het achterhoofd, werden adresseerbare Droplet Microarrays (ADMs) ontworpen om de veelzijdigheid, ruimtelijke serverprocessor en verminderde hoeveelheid druppel microarrays combineren met de gevoeligheid van een enkel molecuul TIRF microscopie aan kwantitatief maatregel eiwit overvloed. 5 ADMs inschakelen eencellige analyse vormen een druppel microarray met enkele cellen over een microarray antilichaam, die vervolgens wordt afgetopt met olie om te voorkomen dat de verdamping. De volumes van de druppels zijn discrete om verlies van de steekproef, die anders zou kunnen worden bereikt door op de chip kleppen in continue stroom microfluidics te voorkomen. 30 de absolute hoeveelheid eiwit van het doel van een enkele cel is extreem klein; de beperkte omvang van de druppels staat echter voor relatief hoge lokale concentratie opdat zij worden gedetecteerd met behulp van een sandwich antilichaam assay - antilichaam is geblokkeerd in een afzonderlijke regio, of ter plaatse, op een oppervlak dat vangt eiwit die op zijn beurt bindt aan een fluorescently geëtiketteerde detectieantilichaam aanwezig in het volume van de druppel. Als een etiket-vrije benadering (d.w.z. eiwit doelstellingen niet hoeft direct worden geëtiketteerd), ADMs zijn algemeen toepasbaar zijn bij de analyse van cellen uit primaire bronnen, zoals verwerkte bloed, prima moeten aangeblazen en gedissocieerde tumor biopsieën, evenals cellen van cultuur en hun lysates.
Meten van de variatie in eiwit overvloed over een celpopulatie is belangrijk bij het bepalen van de heterogeniteit in reactie, bijvoorbeeld aan een drug en zal helpen bij het verstrekken van inzicht in de cellulaire functies en trajecten, beoordeling van de subpopulaties en hun gedrag, alsmede identificatie van zeldzame gebeurtenissen dat anders zou worden gemaskeerd door bulk methoden. Dit protocol beschrijft hoe kan produceren en gebruiken van microarrays van de adresseerbare druppel kwantitatief bepalen de overvloed van de transcriptie factor p53 in menselijke kankercellen en kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de rol van p53 in reactie op chemotherapeutische geneesmiddelen. Het doel eiwit wordt bepaald door de keuze van vastleggen en detectie van antistoffen en kan worden gewijzigd om meer of andere doelen. Instructies om te bouwen van een eenvoudige apparaat opnemen een concentrische mondstuk van algemene lab verbruiksartikelen aan handmatig array 10 nL druppels afgetopt met olie. De volledige experimentele proces wordt beschreven waarbij elke druppel is vervolgens geladen met een enkele cel, die vervolgens is lysed en de uitdrukking van eiwit met enkel molecuul resolutie met behulp van microscopie van TIRF vastgesteld.

<table><tbody><tr><td>Celcultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat-bufferoplossing met zout (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM met hoge glucose</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runder serum (FBS)</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Cellcultuurkolven</td><td>Corning</td><td>SIAL0639</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcontact Arrayer</td><td>DigiLab, UK</td><td>OmniGrid Micro</td><td></td></tr><tr><td>Microcontact pin</td><td>ArrayIt, USA</td><td>946MP2</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes (Nexterion)</td><td>Schott, Europa</td><td>1098523</td><td>Grootte (mm): 65,0 x 25,0; Dikte (mm) 0,17</td></tr><tr><td>p53-capturantilichaam</td><td>Enzo</td><td>ADI-960-070</td><td></td></tr><tr><td>p53-detectantilichaam, gelabeld met Alexa Fluor 488</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>voorraadconcentratie 200&mu;g/mL</td></tr><tr><td>Salina-natriumcitraatbuffer</td><td>Gibco</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Betaine</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>384-wellsplaat (klein volume)</td><td>Sigma</td><td>CLS4511</td><td></td></tr><tr><td>Stikstofgascilinder</td><td>BOC</td><td>Industriële kwaliteit, zuurstof-vrij</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Druppeltjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP2</td><td></td></tr><tr><td>Handmatige microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram Vario</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet</td><td>Origio, Denemarken</td><td>MBB-FP-L-0</td><td></td></tr><tr><td>Spuitpompen</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-210</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;L spuit</td><td>Hamilton</td><td>81020</td><td>Gasdicht, PTFE Luer-lock</td></tr><tr><td>1 mL spuit</td><td>Hamilton</td><td>81327</td><td>Gasdicht, PTFE Luer-lock</td></tr><tr><td>Siliconen isolator</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A-0.5</td><td>6x4 wel siliconen isolator met kleefstof</td></tr><tr><td>Lasersnijder</td><td>VersaLASE</td><td>VLS2.30 CO2 Laser 3W</td><td>voor lasersnijden van aangepaste isolatoren</td></tr><tr><td>1 mm dikke acrylplaat</td><td>Weatherall-UK</td><td>Clarex Precision Sheet 001</td><td>voor lasersnijden van aangepaste isolatoren</td></tr><tr><td>Kleefvel</td><td>3M</td><td></td><td>gebruikt om aangepaste isolatoren op microarrayed dekglasjes te bevestigen</td></tr><tr><td>Superlijm</td><td>Loctite</td><td>LOCPFG3T</td><td></td></tr><tr><td>1 mm ID/3,6 mm OD gesmolten silica buis</td><td>IDEX</td><td>FS-115</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/1/16&rdquo; OD PFA buis</td><td>IDEX</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>0,014&rdquo; ID/0,062&rdquo; OD PTFE buis</td><td>Kinesis</td><td>008T16-100</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/2,0 mm OD FEP buis</td><td>IDEX</td><td>1673</td><td></td></tr><tr><td>Runder serum albumine (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>Mineraalolie</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazuiver water</td><td>Millipore, Duitsland</td><td>MilliQ</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Microscopie &amp; Optica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF-microscoop met gecodeerde XY-standaard</td><td>Nikon, Japan</td><td>Nikon Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>Andor Technologies, Ierland</td><td>IXON DU-897E</td><td></td></tr><tr><td>Laseropwekkingsbron</td><td>Vortran, VS</td><td>Stradus 488-50</td><td></td></tr><tr><td>Optische lysislaserbron</td><td>Continuum, VS</td><td>Surelite SLI-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopfilterkubus voor TIRF</td><td>Chroma, VS</td><td>z488bp</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopfilterkubus voor optische lysis</td><td>Laser 2000, VK</td><td>LPD01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Open Source</td><td></td><td>Beeldanalysesoftware</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>versie 7.14 of hoger</td><td>Beeldanalysesoftware</td></tr></tbody></table>

tellen van eiwitten in afzonderlijke cellen met adresseerbare droplet microarrays

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Vaak cellulaire gedrag en cellulaire reacties worden geanalyseerd op het bevolkingsniveau waar de reacties van veel cellen samen worden gebundeld als een gemiddelde resultaat maskeren de rijke eencellige gedrag binnen een complexe bevolking. Eencellige eiwit detectie en kwantificering technologieën hebben een opmerkelijke invloed gemaakt in de afgelopen jaren. Hier beschrijven we een praktische en flexibele eencellige analyse platform gebaseerd op adresseerbare druppel microarrays. Deze studie beschrijft hoe de absolute moleculen van doel eiwitten met eencellige resolutie kan worden gemeten. De tumor suppressor p53 is het meestal gemuteerde gen in menselijke kanker, met meer dan 50% van de totale kankergevallen vertoont een patroon van niet-gezonde p53 uitdrukking. Het protocol wordt beschreven stappen voor het maken van 10 nL druppels waarbinnen één menselijke kankercellen worden geïsoleerd en de exemplaaraantal van p53 proteÃ¯ne wordt gemeten met een enkel molecuul resolutie precies bepalen de variabiliteit in expressie. De methode kan worden toegepast op elk celtype met inbegrip van primaire materiaal om te bepalen van de absolute exemplaaraantal van elke doelgroep proteïnen van belang.

De absolute basale eiwit exemplaaraantal van p53 werd bepaald met de resolutie van de eencellige in een menselijke Colón kanker cellijn, BE cellen. We laten zien hoe p53 expressie kan variëren in de verschillende ordes van grootte en tonen een zwak positieve correlatie tussen de cel grootte en eiwit exemplaaraantal binnen de rust BE-celpopulatie.
Adresseerbaar Droplet Microarrays worden gevormd wanneer waterige druppels zijn afg...

Hier presenteren we adresseerbare druppel microarrays (ADMs), een druppel array gebaseerde methode kunnen bepalen van absolute eiwit overvloed in afzonderlijke cellen. We laten de mogelijkheid van ADMs te karakteriseren de heterogeniteit in de expressie van de tumor suppressor eiwit p53 in een menselijke kanker cellijn zien.

Tellen van eiwitten in afzonderlijke cellen met adresseerbare Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Het algemene doel van dit experiment is het bepalen van het absolute eiwit-kopienummer van een doeleiwit met single-cell resolutie. Single-cell technieken maken een beter begrip mogelijk van het gedrag van een eiwit in relatie tot het centraal dogma en dragen bij aan een nauwkeurige kwantificering van de gereguleerde genexpressie. Werken op single-cell niveau kan de rijke heterogeniteit van de celpopulatie vastleggen, die anders verloren zou gaan door de middeling die optreedt bij traditionele biochemische technieken.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden vanwege de gevoeligheid van single-cell assays of de beperkte hoeveelheid eiwit in elke cel. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we een single-cell eiwitassay wilden uitvoeren waarbij gemakkelijk monsters konden worden genomen voor verdere analyse stroomafwaarts. Begin deze procedure door chips te maken en antilichaam-microarrays te printen zoals beschreven in het tekstprotocol.Om de apparatuur voor te bereiden, schuift u een stuk fused silica-tubing van 100 mm lengte, 150 µm binnendiameter en 360 µm buitendiameter in een stuk PFA-tubing van 40 mm lengte, 1 mm b

counting-proteins-in-single-cells-with-addressable-droplet-microarrays

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Druppel op basis van microfluïdische platforms zijn veelbelovende kandidaten voor high throughput experimenten, omdat zij in staat zijn om goedkoop te genereren picoliter, self-gecompartimenteerde schepen op kHz tarieven. Door integratie met snelle, gevoelige en een hoge resolutie fluorescentie spectroscopische methoden, kunnen de grote hoeveelheden informatie uit die in deze systemen efficiënt kunnen worden geëxtraheerd, aangewend en gebruikt.

Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

We beschrijven een digitale eindpuntassay voor het kwantificeren van nucleïnezuren met een vereenvoudigde (analoge) uitlezing. We meten bulkfluorescentie van druppelgebaseerde digitale assays met behulp van een standaard qPCR-machine in plaats van gespecialiseerde instrumenten en bevestigen onze resultaten door middel van microscopie.

Eenvoudige Bulk uitlezing van Digital nucleïnezuur kwantificering Testen

Dit protocol beschrijft de vervaardiging van een grootschalige multiplex tweedimensionale DNA of antilichaam-array, met potentiële toepassingen in cell signaling studies en biomarker detectie.

Flow-patroon Begeleide Fabrication van High-density Barcode Antibody Microarray

Er wordt een gevoelige en nauwkeurige methode beschreven voor de kwantificering van celvrije microRNA's met behulp van een kleurstof-gebaseerde chemie en druppel digitale PCR-technologie.

Circulerende MicroRNA Kwantificering Met behulp van DNA-bindende Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

We tonen een module chiptechnologie voor het uitvoeren van cross-country-reactivity-vrije multiplexed sandwich-immunoassay door simpelweg twee dia's uitlijnen. Een apparaat module wordt gebruikt voor het op betrouwbare wijze overbrengen van reagentia van microarray-naar-microarray. De module-chip kan worden gebruikt voor alle biochemische reacties vereisen colocalization van verschillende reagentia zonder kruisbesmetting.

Snap Chip voor cross-country-reactivity-gratis en Spotter-gratis Multiplexed Sandwich-immunoassay

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van de labeling homogeniteit voor elke soort eiwit in een complexe eiwitSteekproef op het niveau van één molecuul.

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Het algemene doel van het protocol is om meer dan een miljoen geordende, uniforme, stabiele en biocompatibele femtoliter druppels voor te bereiden op een 1 cm2 vlakke substraat die kan worden gebruikt voor celvrije eiwitsynthese.

Een Femtoliter Droplet Array voor massively parallelle eiwitsynthese van enkele DNA-moleculen

Hier presenteren we een protocol voor het meten van absolute mitochondriale (mt) DNA-kopienummer en mtDNA-deletie heteroplasmieniveaus in enkele cellen.

Het meten van eencellig mitochondriaal DNA-kopienummer en heteroplasmie met behulp van digitale druppelpolymerasekettingreactie

Deze methode kwantificeert microbiële abundantie met behulp van een 96-well plaatformaat om kolonievormende eenheden (CFU's) te vergulden en wordt toegepast op het Drosophila-microbioom in hele vlieghomogenaatmonsters. CFU's worden geteld met een geautomatiseerde beeldanalysesoftware die hier wordt geleverd.

Snelle kolonievormende eenheidstelling in 96-wells plaatformaat toegepast op het Drosophila-microbioom

Het protocol beschrijft een geavanceerd microfluïdisch platform om de cytokinesecretiedynamiek van individuele menselijke perifere mononucleaire bloedcellen kwantitatief te meten. Het platform meet tot drie cytokines parallel (IL-6, TNFα en IL-1β) voor elke individuele cel die wordt gestimuleerd met lipopolysaccharide als voorbeeld.

Microfluïdische benadering om gelijktijdige en sequentiële cytokinesecretie van individuele polyfunctionele cellen op te lossen 

Leer eiwitten tellen in afzonderlijke cellen met adresseerbare droplet-microarrays. Deze methode kwantificeert p53-expressie in kankercellen en onthult heterogeniteit in eiwitniveaus binnen cellpopulaties.

Tellen van eiwitten in afzonderlijke cellen met adresseerbare Droplet Microarrays

Meer video's verkennen