Oereenstemming super resolutie en elektronenmicroscopie op te lossen eiwit lokalisatie in Zebrafish Retina
10 november 2017
Dit protocol beschrijft het nodige eiwit subcellular localisatie om resultaten te verkrijgen op de zebravis netvlies door correleren super resolutie de lichte microscopie en elektronenmicroscopie afbeeldingen scannen.
Het algemene doel van deze microscopiemethode is om eiwitexpressie nauwkeurig te lokaliseren in relatie tot verschillende subcellulaire organellen in het larvale zebravisnetvlies door superresolutie en rasterelektronenmicroscoopbeelden te correleren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de retinale ontwikkeling en celstroomvelden te beantwoorden, zoals de studie van eiwitmislokalisatie in mutanten. Het grote voordeel van deze techniek is dat het superresolutie combineert met rasterelektronenmicroscopie om zeer nauwkeurige eiwitlokalisatiegegevens te verkrijgen binnen de structurele context van het monster.
De verzameling Tokuyasu-secties op siliconenwafers vergemakkelijkt de hantering aanzienlijk en het gebruik van platina-schaduw voor contrast geeft een goede topografie van het monster. Dus deze methode kan inzicht geven in larve zebravisnetvliesstudies. Een van de belangrijkste voordelen is dat het ook kan worden toegepast op vele andere biologische systemen, zoals identificatie van eiwitexpressie in muisweefsel.
Na het disseceren van de ogen uit gefixeerde zebravislarven volgens het tekstprotocol, warm 15 milliliter 12% lokale voedselmerkgelatine in PBS op tot 40 graden Celsius. Zuig vervolgens het PBS uit de oogbuisjes en voeg de gelatineoplossing toe. Tik zachtjes op de buis om ervoor te zorgen dat de gelatine het monster binnendringt en incubeer het 10 tot 30 minuten op 40 graden Celsius in een thermoblok met zachte schommeling of in een waterbad.
In een waterbad van 40 graden Celsius, vul 12 bij vijf bij drie millimeter siliconen of polyethyleen vlakke inbeddingsvormen met warme gelatine. Voeg vervolgens met een pipet twee ogen per mal toe en gebruik onder een binoculaire een dissectienaald om ze goed uit te lijnen. Laat de gelatine een minuut afkoelen op kamertemperatuur, plaats het vervolgens 20 minuten op vier graden Celsius om het te laten harden.
Gebruik onder de binoculaire een scheermes om de gelatineblok opnieuw bij te snijden zodat er één oog per blok past. Breng de gelatine-ingebedde ogen over naar 2,3 molaire sucrose in PBS op ijs. Incubeer de monsters gedurende één nacht op vier graden Celsius.
Vervolgens de monsters uitwisselen naar verse 2,3 molaire sucrose-oplossing. En het weefsel bewaren op vier graden Celsius, of min 20 graden Celsius voor opslag tot enkele maanden. Het gelatineblok opnieuw bijsnijden tot bijna de grootte van het oog voordat het naar een cryo-pin wordt overgebracht.
Bevriest vervolgens het blok in vloeibare stikstof en brengt het over naar een cryo-ultramicrotoom. Gebruik een diamantmes in de cryo-ultramicrotoom om 110 nanometer dikke secties te snijden bij min 120 graden Celsius. Haal de secties op met een draadlus die een druppel van 2%methylcellulose en 2,3 molaire sucrose-oplossing bevat.
Breng vervolgens de secties over naar een zeven bij zeven millimeter siliconenwafer. Om de wafers te wassen, pipet vier druppels en plaats de wafers ondersteboven op de druppels. Incubeer de wafers op de druppels bij nul graden Celsius gedurende 20 minuten.
Was vervolgens de wafers twee keer in PBS bij kamertemperatuur gedurende twee minuten per keer. Incubeer de monsters drie keer in 0,15%glycine in PBS gedurende één minuut per keer. Was vervolgens de monsters drie keer met PBS gedurende één minuut per wasbeurt.
Pre-incubeer het weefsel met PBG gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens konijnen-anti-Tom20 in PBG toe aan de secties. En incubeer de wafers bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
Was met PBG het weefsel zes keer gedurende één minuut per wasbeurt. Pre-incubeer vervolgens de monsters met PBG bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Vervang de PBG met Alexa 647 anti-konijn divalente Fab-fragmenten in PBG en incubeer gedurende 30 minuten.
Was de monsters in PBG zes keer gedurende één minuut per wasbeurt. Was vervolgens de wafers drie keer met PBS gedurende twee minuten. Voeg DAPI en PBS toe aan de wafers en incubeer gedurende 10 seconden.
Was vervolgens de monsters twee keer met PBS gedurende twee minuten per keer. Plaats de wafer op een druppel van een één op één oplossing van 80%glycerol en beeldvormingsbuffer die een zuurstofverwijderingssysteem bevat en incubeer het kort. Breng de wafers, weefselzijde naar beneden, over op een verse druppel van de één op één mengsel van 80%glycerol en beeldvormingsbuffer op een glazen bodem-Petrischaal.
Gebruik een pipet van alle kanten om het grootste deel van de vloeistof onder de wafer te verwijderen. Gebruik vervolgens siliconenstroken om de wafer aan de bodem van de Petrischaal te bevestigen. Plaats de gemonteerde secties op een omgekeerd microscoop met een olie-immersieobjectief met een hoge numerieke apertuur.
Laat het monster vóór het beeldvormen gelijktijdig worden met de microscooptemperatuur om laterale en axiale drift te minimaliseren of te verminderen. Centreer het gebied van belang en verkrijg brede veld-epifluorescentiereferentiebeelden. Verander naar de superresolutie-bedrijfsmodus.
Stel de belichtingstijd van de camera in op 15 milliseconden en stel de elektronenvermenigvuldigingsversterking in op maximaal 300. Verlicht vervolgens het monster in epifluorescentiemodus met de 642 nanometerlaser met maximale laservermogen. Zodra de enkele molecuulflitsen goed gescheiden zijn in elk frame, zodat de kans klein is dat individuele signalen overlappen, verlaag de laservermogen tot bijna 1/3.
Neem het ruwe beeld op in epifluorescentie door minimaal 30.000 frames te verwerven. Gebruik vanuit de ruwe gegevens onder Tools, t-Series Analysis een detectiedrempel van 30 fotonen. Klik op Evalueren om een lokalisatie-gebeurtenislijst te genereren.
Klik onder Tools, in het Eventlist Processing-paneel op Maak afbeelding om het superresolutiebeeld te visualiseren door Gaussiaanse fitting, met een weergavepixelgrootte van vier nanometer. Verwijder de siliconenstroken en voeg een druppel PBS toe dicht bij de randen van de wafer om het op te tillen van de Petrischaal. Gebruik PBS om de wafer twee keer gedurende
Overzicht
Dit protocol beschrijft een microscopiemethode om eiwitexpressie in het netvlies van zebravislarven te lokaliseren door superresolutie- en scanning-elektronenmicroscopiebeelden te correleren. Deze techniek biedt inzicht in de ontwikkeling van het netvlies en cellulaire pathways.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van de eiwitlokalisatie is essentieel voor het bestuderen van cellulaire functies.
- Zebravissen zijn een waardevol model voor retina-onderzoek vanwege hun transparante embryo's.
- De combinatie van superresolutie met scanning elektronenmicroscopie verbetert de nauwkeurigheid van de beeldvorming.
- Deze methode kan worden aangepast voor andere biologische systemen, waaronder muisweefsels.
Doel van de studie
- Om een nauwkeurige lokalisatie van eiwitten in het netvlies van de zebravis te bereiken.
- Om eiwitmislokalisatie in retinale mutanten te onderzoeken.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het bestuderen van de retinale ontwikkeling.
Gebruikte methoden
- Het inbedden van zebrafish-ogen in gelatine voor het maken van coupes.
- Het gebruik van een cryo-ultramicrotoom voor het snijden van dunne coupes.
- Immunokleuring met specifieke antilichamen voor eiwitdetectie.
- Het verkrijgen van beelden middels superresolutie-microscopietechnieken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle lokalisatie van eiwitten binnen de structurele context van het netvlies.
- Verbeterde beeldvorming van subcellulaire organellen.
- Inzichten in de rol van specifieke eiwitten bij de ontwikkeling van het netvlies.
- Potentiële toepassingen in andere biologische onderzoeksgebieden.
Conclusies
- De methode biedt een krachtig instrument voor het bestuderen van de proteinlokalisatie.
- Het kan helpen bij het ontrafelen van mechanismen van netvliesontwikkeling en ziekten.
- Toekomstige studies kunnen de toepassing uitbreiden naar andere weefsels en organismen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Nauwkeurige eiwitlokalisatie binnen subcellulaire contexten is cruciaal voor doelwitvalidatie en mechanische risicoreductie in de vroege fase van geneesmiddelenontwikkeling. Correlatieve superresolutie- en elektronenmicroscopie maakt een preciese mapping van eiwitexpressie ten opzichte van organellen mogelijk, wat hypothesetoetsing in ziekterelateerde systemen ondersteunt. Deze aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen door ambiguïteiten in eiwitfunctie en -lokalisatie op te lossen, in het bijzonder in complexe weefsels zoals het netvlies.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Validatie van Targets
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door eiwitexpressie in relatie tot mitochondriale membranen en cristae in kaart te brengen.
- Operationele waarde: Biedt structurele context voor het beoordelen van target engagement en subcellulaire mislokalisatie in ziektemodellen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door middel van directe visualisatie van eiwit-organelinteracties in het netvlies van zebravis.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare gegevens over eiwitlokalisatie met behulp van Tokuyasu-secties op siliciumwafers.
- Kwantitatieve output: Levert superresolutie-beeldgegevens op die geschikt zijn voor uitlijning met elektronenmicroscopie voor correlatieve analyse.
- Hergebruik van het platform: Aanpasbaar aan andere biologische systemen, inclusief weefsels van muizen, waardoor validatie van targets tussen verschillende soorten mogelijk is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Faciliteert de studie naar eiwitmislocalisatie in retinale mutanten, wat inzicht geeft in mechanistische pathways bij neurodegeneratie.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen discovery-imaging en preklinische validatie door ultrastructurele context te bieden voor eiwitexpressie.
- Risicogebaseerde beslissingen: Ondersteunt go/no-go-criteria door te verduidelijken of waargenomen fenotypes voortkomen uit werkelijke targetmodulatie of off-target-effecten.
Pipeline- & Workflowintegratie
De methode integreert in vroege discovery-workflows door ruimtelijk opgeloste proteïnedata te verschaffen die de selectie van targets en het ontwerp van assays informeren voorafgaand aan de lead-identificatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-toetsing via nauwkeurige eiwitlokalisatie in subcellulaire compartimenten, waardoor mechanistische ambiguïteit wordt verminderd.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk door middel van correlatieve beeldvorming die de antilichaamspecificiteit en signaalgetrouwheid valideert.
- Analytica: Genereert kwantitatieve lokalisatiemetrieken op basis van superresolutiegegevens, wat vergelijking tussen verschillende experimentele condities mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire bevindingen aan de cellulaire ultrastructuur, wat helpt bij de afstemming van biomarkers en pathway-validatie.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbaar beeldvormingsplatform dat toepasbaar is op meerdere weefseltypen en ziektestudies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische onzekerheid door eiwitsignalen te koppelen aan gevalideerde ultrastructurele referentiepunten.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor sectieering, kleuring en beeldvorming.
- Strategische waarde: Verhoogt het vertrouwen in de selectie van targets, waardoor fouten in een laat stadium door onjuiste mechanistische aannames worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt datagedreven prioritering van targets mogelijk op basis van de nauwkeurigheid van de subcellulaire lokalisatie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in cryosectie, immunofluorescentie en superresolutie-microscopie.
- Afhankelijk van toegang tot een cryo-ultramicrotoom, een superresolutie-microscoop en een scanning elektronenmicroscoop.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de procedures van monstervoorbereiding, kleuring en beelduitlijning.
- Aanpassing aan alternatieve modellen vereist validatie van de integriteit van de secties en de efficiëntie van de labeling.
- Praktische beperkingen omvatten de complexiteit van de monstervoorbereiding en de noodzaak van geoptimaliseerde labeling om artefacten bij superresolutie-imaging te voorkomen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Gelatin Infiltration, Mounting, and Cryosectioning
3:47
Immunolabeling
5:26
Super-resolution Microscopy
7:25
Platinum Shadowing and Scanning Electron Microscopy
8:48
Alignment of Light and Electron Microscopy Images
10:23
Results: Tom20 Protein Expression in the Zebrafish Retina
11:29
Conclusion
