Name: Oereenstemming super resolutie en elektronenmicroscopie op te lossen eiwit lokalisatie in Zebrafish Retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Leer een correlative microscopiemethode voor eiwitlokalisatie in het larvenretina van zebrafish met superresolutie en rasterelektronenmicroscopie. Deze techniek biedt inzicht in retinale ontwikkeling en subcellulaire structuren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering van ION en RGB: Swiss National Science Foundation Ambizione-SCORE verlenen PZ00P3 142404/1 en PZ00P3 163979.

alle experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de verklaring van de ARVO voor het gebruik van dieren in Ophthalmic en visie onderzoek en zijn goedgekeurd door de lokale autoriteiten.
 1. voorbereiding van de uiterst dunne secties op silicium-wafels <ol><li>monster fixatie <ol><li>bereid de kleefpoeders oplossing met 0,1% Glutaaraldehyde, 4% formaldehyde in 0,1 M cacodylate buffer. 
		Opmerking: Let op! Wees voorzichtig bij het werken met formaldehyde, Glutaaraldehyde en cacodylate buffer, passende persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen en werken in een zuurkast.</li>
		<li>Euthanaseren 5 dagen post bevruchting (5 dpf) zebrafish larven met tricaïne (ethyl 3-aminobenzoaat methanesulfonate, 0,4% w/v in PBS (phosphate buffer zoutoplossing, pH 7)) als eerder beschreven 15.</li>
		<li>Bevestigen de larven door onderdompeling in vooraf gekoeld kleefpoeders oplossing op ijs. Verwijderen van het hoofd en na een nacht bebroeden bij 4 ° C met zachte rockende.</li>
		<li>Ontleden de ogen door te korten van het weefsel rond het oog met fijne pincet en een microdissection scalpel (onder een verrekijker) in gekoeld kleefpoeders oplossing op een plaat 1% agarose-bedden. De ogen overbrengen in een buis met verse vooraf gekoeld fixeerspray.</li>
		<li>Wassen tweemaal in PBS (phosphate buffer zoutoplossing, pH 7.4) gedurende 5 minuten elk wassen bij kamertemperatuur (RT).</li>
	</ol></li> <li>Gelatine infiltratie en montage <ol><li>opwarmen 15 mL lokaal voedsel merk gelatine 12% w/v in PB (fosfaatbuffer, pH van de 0,1 M 7.4) bij 40 ° C. de PBS verwijderen en toevoegen van gelatine oplossing aan de buizen met de ogen. Tik op de tube zachtjes om te zorgen voor de gelatine infiltreert het monster en incubeer gedurende 10-30 min bij 40 ° C in een thermoblock met zacht schudden of in een waterbad.</li>
		<li>Vul 12 x 5 x 3 mm silicium of polyethyleen platte mallen te embedding met warme gelatine in een waterbad van 40 ° C. Toevoegen van twee ogen per schimmel met behulp van een precisiepipet, ze uitlijnen onder een verrekijker met behulp van een naald dissectie en laat de gelatine afkoelen bij kamertemperatuur voor 1 min en harden bij 4 ° C gedurende 20 min.</li>
		<li>Opnieuw trim de gelatine blok onder de binoculair aan één oog per blok met behulp van een scheermesje.</li>
		<li>Overbrengen in de ogen van de gelatine ingesloten 2,3 M sacharose in PB op ijs. Na een nacht bebroeden bij 4 ° C.</li>
		<li>Exchange om nieuwe 2,3 M sacharoseoplossing en sla bij 4 ° C of -20 ° C; na deze stap, monsters zijn klaar voor het segmenteren of kan worden achtergelaten bij-20 ° C voor enkele weken tot maanden.</li>
		<li>Trim opnieuw de gelatine blok bijna de grootte van het oog vóór de overbrenging naar een cryo-pin. Freeze in vloeibare stikstof en overdracht aan een cryo-ultramicrotome.</li>
	</ol></li> <li>Cryosectioning <ol><li>gesneden 110 nm dik-sections bij-120 ° C met een mes van de diamant in de cryo-ultramicrotome.</li>
		<li>Halen de secties met een vast lus met een druppel van 2% methylcellulose (in water) en een sacharoseoplossing 2,3 M (1:1). Secties overbrengen in een 7 x 7 mm silicium wafer. Secties bij 4 ° C worden opgeslagen totdat zij worden verwerkt.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunolabelling <ol><li>Wash wafels met PBS bij 0 ° C gedurende 20 minuten op vier druppels door het plaatsen van de wafeltjes ondersteboven op de druppels. Wassen in PBS 2 x 2 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Incubate 3 keer in 0,15% glycine in PBS, voor elke 1 min. 3 x voor 1 min wassen/wassen met PBS. Vooraf incubate met PBG (PBS met 0,5% bovien serumalbumine BSA en 0,2% gelatine type B) voor 5 min.</li>
	<li>Incubate met konijn anti-Tom20 (Zie de Tabel van materialen) in PBG (4 µg/mL) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Wassen 6 x voor 1 min/afwas in PBG. Vooraf incubate met PBG voor 5 min op RT. Incubate met anti-konijn Alexa 647 F(ab&#39;) 2 (Zie de Tabel van materialen) in PBG (7,5 µg/mL) voor 30 min.</li>
	<li>Wassen 6 x voor 1 min/afwas in PBG. 3 x 2 min in PBS wassen. Incubeer met DAPI (4 µg/mL) in PBS voor 10 s. wassen 2 x 2 min in PBS.</li>
</ol> 3. Super resolutie microscopie <ol><li>Incubate de wafer kort (10 s) door de plaatsing ervan op een druppel van een 1:1 oplossing van glycerol (80%) en imaging buffer met een zuurstof opruiming systeem (200 mM fosfaatbuffer met 10% glucose, 0,5 mg/mL glucoseoxidase, 40 µg/mL katalase, 15 mM bèta-mercaptoethylamine hydrochloride (HCL MEA), pH 8,0).</li>
	<li>De wafeltjes (sectie naar beneden) overbrengen in een petrischaal voor glazen bodem (dikte 170 ± 5 µm) op een nieuwe daling van het 1:1 mengsel van glycerol (80%) en imaging buffer (zoals in stap 3.1).</li>
	<li>Verwijderen van alle kanten, met een pipet, allermeest naar de vloeistof onder de wafer. Gebruik van silicone strepen om te repareren het zegel aan de onderkant van de petrischaal. 
	Opmerking: Silicone strepen worden gemaakt uit twee componenten siliconen-lijm (3 x 12 mm).</li>
	<li>Afbeelding secties op een omgekeerde Microscoop met een hoge numerieke diafragma (bijvoorbeeld 160 X / nb 1,43; Zie de Tabel van materialen) olie onderdompeling super resolutie speciale doelstelling. Voorafgaand aan de beeldvorming, laat het monster equilibreer tot Microscoop temperatuur teneinde minimaliseren/laterale en axiale drift.</li>
	<li>Center van het interessegebied en eerste widefield epifluorescence referentie beelden te verwerven. Wijzig in de bewerkingsmodus super resolutie. De blootstellingstijd van de camera naar 15 ms aanpassen en instellen van het elektron te vermenigvuldigen (EM) winst tot het maximum van 300.</li>
	<li>Verlichten monster met de 642 nm continuous wave laser op maximale laser kracht (overeenkomend met ~2.8 kW/cm 2) in de epifluorescence modus. Zodra het enkel molecuul knippert zijn goed gescheiden in elk frame, zodat de kans op lage dat individuele signalen overlappen, stel de macht van de laser om ~0.7 kW/cm 2. Opnemen van de onbewerkte afbeelding in epifluorescence modus door het verwerven van een minimum van 30.000 frames. 
	Opmerking: Deze parameter All kan variëren afhankelijk van de verschillende exemplaren en labelen van dichtheden.</li>
	<li>Van de ruwe gegevens, het genereren van een gebeurtenissenlijst wederopbouw (lokalisaties van elke één molecuul knipperen in het ruwe beeld) met behulp van een drempel van de detectie van 30 fotonen (dient te worden aangepast volgens het monster) door te klikken op &#34; evalueren &#34; in de &#39; t-serie analyse &#39; onder &#39; Tools &#39;.</li>
	<li>Het super resolutiebeeld visualiseren door Gauss montage 16 toe te passen van een pixelgrootte van de rendering van 4 nm door te klikken op &#34; Create Image &#34; in de &#39; gebeurtenis lijst verwerking paneel &#39; onder &#39; Tools. &#39; 
	Opmerking: Voor het genereren van de super opgelost afbeelding de geïntegreerde software-tools van het systeem gebruikt in deze studie werden ingezet. Echter de beeldvorming beschreven super resolutie kan worden uitgevoerd op een ander enkel molecuul lokalisatie gebaseerd systeem en de gegevens kan worden verwerkt met opensource software gereedschappen als onweer 17.</li>
</ol> 4. Platina Shadowing <ol><li>verwijderen van silicium strepen en voeg een druppel PBS dicht bij de randen van het zegel aan het verheffen van de petrischaal. Wassen van de wafer 2 x 2 min in PBS, dan post repareren met 0,1% Glutaaraldehyde in PBS voor 5 min. 2 x gedurende 2 minuten wassen/wassen in PBS.</li>
	<li>Broeden de wafer tweemaal voor 5 min/incubatie in 1 druppel methylcellulose 2% in water op het ijs. De wafer invoegen in een centrifugebuis samen en centrifugeer bij 14,100 x g voor 90 s. Mount het op een SEM aluminium beginnetje met het uitvoeren van koolstof cement.</li>
	<li>Toevoegen van een laag van 2 tot en met 10 nm van platina/carbon op de steekproef door het roterende shadowing bij 8° met behulp van een elektron beam verdamping Apparaatinstellingen: 1.55 kV, 55 mA, 0.3 nm/s, en een hoek van 8°, rotatie niveau 4.</li>
</ol> 5. Scanning elektronen microscopie <ol><li>afbeelding secties met een scanning electron microscope op 1,5 kV, 2 mm werken afstand en lens met een In secundaire electron detector.</li>
</ol> 6. Uitlijning van licht- en elektronenmicroscopie beelden <ol><li>Open beide typen afbeeldingen met Fiji 18 door te klikken op &#34; bestand | Open &#34;. De canvasgrootte van het aanpassen door te klikken op &#34; afbeelding | Aanpassen | Canvasgrootte &#34; en beide beelden brengen in een stapel door te klikken op &#34; afbeelding | Stapels | Afbeeldingen stapelen &#34;. De stack opslaan als TIFF-bestandstype.</li>
	<li>In Fiji, een nieuwe TrackEM2 19-interface openen door te klikken op &#34; bestand | nieuw | TrackEM2 (nieuw) &#34;. De stapel met beide afbeeldingen importeren door rechts te klikken op het zwarte venster en selecteren &#34; Import stapel &#34;.</li>
	<li>Uitlijnen licht microscopie afbeelding naar elektronenmicroscopie afbeelding handmatig met bezienswaardigheden met behulp van een rechter muisklik op de afbeelding en selecteren &#34; uitlijnen | Uitlijnen van laag handmatig met bezienswaardigheden &#34;.
	<ol><li>Pick de Selecteer gereedschap (zwarte pijl) om toe te voegen van monumenten. De vorm van kernen gebruiken als referentie om te selecteren van de dezelfde randen in beide afbeeldingen (aanvullende figuur 1). Voeg meerdere punten (minimum drie punten moeten worden geselecteerd). Uitlijning met een affiene model toepassen door rechtermuisknop op te klikken en te selecteren &#34; transformatie toepassen | Affiene model &#34;.</li>
	</ol></li> <li>Laag transparantie wijzigen (Zie aanvullende figuur 1) te beoordelen van de kwaliteit van de uitlijning.</li></ol>

<ol><li>Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+Super-Resolution+Microscopy%3A+New+Dimensions+and+New+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities.</a> Chem Rev. , (2017).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Fölling, J., Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+photoactivated+localization+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy.</a> PLOS one. 8 (10), e77209(2013).</li>
<li>Paez-Segala, M. G., Sun, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation-resistant+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+CLEM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM.</a> Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).</li>
<li>Narayan, K., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beams+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Focused ion beams in biology.</a> Nat Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemistry+on+ultrathin+frozen+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+J%22%5BJournal%5D)">Immunochemistry on ultrathin frozen sections.</a> Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).</li>
<li>Suleiman, H., Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+protein+architecture+of+the+kidney+glomerular+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane.</a> eLife. 2, e01149(2013).</li>
<li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+3D+superresolution+fluorescence+and+electron+microscopy+reveal+the+relationship+of+mitochondrial+nucleoids+to+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).</li>
<li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+retina+in+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the retina in the zebrafish model.</a> Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).</li>
<li>Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliopathy+gene+cc2d2a+controls+zebrafish+photoreceptor+outer+segment+development+through+a+role+in+Rab8-dependent+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking.</a> Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).</li>
<li>Bachmann-Gagescu, R., Dona, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ciliopathy+Protein+CC2D2A+Associates+with+NINL+and+Functions+in+RAB8-MICAL3-Regulated+Vesicle+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Gen%22%5BJournal%5D)">The Ciliopathy Protein CC2D2A Associates with NINL and Functions in RAB8-MICAL3-Regulated Vesicle Trafficking.</a> PLOS Gen. 11 (10), e1005575(2015).</li>
<li>Mateos, J. M., Guhl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+contrast+of+ultrathin+cryo-sections+for+correlative+super-resolution+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy.</a> Sci Rep. 6, 34062(2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cardona, A., Saalfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS one. 7 (6), e38011(2012).</li>
<li>Wurm, C. A., Neumann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+distribution+of+mitochondrial+import+receptor+Tom20+is+adjusted+to+cellular+conditions+and+exhibits+an+inner-cellular+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).</li>
<li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17947990">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze methode combineert Super opgelost eiwit lokalisatie met context informatie om te bepalen van de precieze positie van eiwitten in een organel. Wij tonen hier de voltooiing van het experiment te visualiseren van de expressie van Tom20 in de buitenmembraan van het mitochondrium, en haar relatie tot andere organellen zoals kernen of buitenste segmenten van de fotoreceptor in het larvale zebrafish netvlies.
Tokuyasu cryo-segmentering vereist sommige opleiding aan het verwerven van goed bewaarde secties. Dit is echter een waarderingsgrondslag die werd toegepast in veel laboratoria met bewezen succes21. Overdracht van de secties aan de silicium wafer is zeer eenvoudig, en geen speciale overwegingen nodig zijn. Het gebruik van glycerol in de beeldvorming buffer is een zeer belangrijke stap om te voorkomen dat het drogen van de afdelingen. Voor super-resolutie beeldvorming worden de beste resultaten verkregen wanneer de wafer zeer dicht bij de bodem van het glas van de petrischaal is. De siliconen strepen helpen handhaven van de wafer in deze positie. Speciale zorg moet worden genomen tijdens het verwijderen van de strepen om te voorkomen beschadiging van de secties.
De dikte van de cryo-delen, ongeveer 100 nm, dunner dan de optische resolutie in de Z-dimensie, vergemakkelijkt bovendien de nauwkeurigheid van deze oereenstemming methode als het signaal van de microscopie super resolutie alleen uit deze dunne laag komt en de Scannende Elektronen Microscoop signaal is het weergeven van de topografie van het monster. Deze methode kan ook worden gecombineerd met multicolor beeldvorming. Echter, speciale moet worden gezorgd dat de steekproef kan worden beeld onder dezelfde omstandigheden (bijvoorbeeld imaging buffer) en cross talk voorkomen moeten worden.
Een beperking van de methode is de twee-dimensionale benadering, aangezien slechts een beperkt aantal seriële secties (ongeveer 3 tot 7 per wafel) kan worden verzameld. Dus, projecten in verband met volume analyse zou niet ideaal. Het is echter een methode die kan worden toegepast om te detecteren eiwituitdrukking in elk type weefsel door eenvoudige afdelen van het monster. Wij bieden een methode zonder gebruik van klassieke contrastmiddelen zoals uranyl-acetaat of lood citraat. Het contrast door platina shadowing zeer informatief topografische contrast biedt, maar in sommige gevallen membranen zijn moeilijk op te lossen. Dit kan problemen opleveren voor projecten die nodig hebt, bijvoorbeeld om te bepalen van de uitdrukking van de eiwitten in kleine blaasjes.
Ons protocol, gebaseerd op Tokuyasu cryo-secties, maakt gebruik van standaard uitrusting nodig om resultaten te verkrijgen van super resolutie en scanning electron microscopes. De collectie van secties (wafers) van silicium en het gebruik van platina voor contrast zijn de eenvoudige stappen om te zorgen voor stabiliteit en reproduceerbaarheid aan de bereiding van de monsters.

Methoden ter bepaling van de subcellular localisatie van eiwitten en hun relatie tot de verschillende compartimenten van de cel zijn essentiële instrumenten om hun functies en de mogelijke interacties te begrijpen. Super resolutie microscopie in combinatie met elektronenmicroscopie biedt dergelijke informatie1. Grondtoestand uitputting microscopie gevolgd door individuele molecuul terugkeer (GSDIM) is een super resolutie microscopie technologie compatibel met een breed scala van biologisch en genetisch gecodeerde fluorophores2 en behaalt een laterale resolutie tot 20 nm 3. de opneming van methoden met een hogere resolutie dan standaard diffractie-limited microscopie verbetert de nauwkeurigheid van de correlatie4,5,6. Met het oog op de beste correlatie van eiwit expressie met een specifieke subcellular compartiment en aan het verminderen van de hoeveelheid onzekerheid7 het gebruik van dezelfde uiterst dunne sectie voor licht- en elektronenmicroscopie wordt aanbevolen. Onder de verschillende vectorafbeeldingsbestanden methoden, Tokuyasu cryo-sectie protocol vereist geen uitdroging of hars inbedding en, bovendien, behoudt de antigenicity van veel epitopes en biedt goede weefsel ultrastructuur8. Verschillende methoden hebben aangetoond dat de toepasbaarheid van deze secties in oereenstemming licht- en elektronenmicroscopie (CLEM)4,,5,,9,10.
De zebravis netvlies is een waardevol model om te studeren ziekten bij de mens mechanismen gezien haar zeer geconserveerde structuur en functie in de gewervelde dieren en visuele ontwikkeling. In bepaalde, retinale researchdieren display dezelfde architectuur als de zoogdieren researchdieren, met een basale SYNAPS, een apico-basally langwerpige kern, clustering van de mitochondriën in de meer apicale innerlijke segment en een buitenste segment bestaat uit membraan schijven in de meest apicale positie11. Eiwit localization voor de diverse cellulaire compartimenten is geconserveerde tussen zebravis en menselijke, waardoor onderzoek naar de biologische functie van menselijke ziekte-relevante eiwitten12,13.
Hier presenteren we een protocol ter voorbereiding van larvale zebrafish netvlies monsters voor het oplossen van de lokalisatie van de eiwitten mitochondriaal buitenmembraan Tom20 door oereenstemming super resolutie licht- en elektronenmicroscopie. De methode is gebaseerd op het verzamelen van cryo-secties (wafers) van silicium en verkrijgen van contrast door topografische informatie geproduceerd na toepassing van een dunne laag platina. Deze stappen zijn duidelijke technische verbeteringen in termen van gemak van gebruik, reproduceerbaarheid, en tijd om uit te voeren van de experimenten. We hebben onlangs aangetoond dat de toepasbaarheid van de methode voor het opsporen van nucleaire poriën en eiwitten mitochondriaal in muis weefsel14.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#158127</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde EM Grade</td><td>EMS, USA</td><td>#16220</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate</td><td>Merck</td><td>#8.20670</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, peqGOLD Universal</td><td>VWR International GmbH</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Flat embedding molds</td><td>BEEM Flat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Local food brand gelatin</td><td>Dr.Oetker</td><td>Extra Gold</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck</td><td>#1.07687</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>#M-6385</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>#G-7126</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin type B</td><td>Sigma</td><td>#G-6650</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applichem</td><td>#A6588.0050</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>Si-Mat Silicon Materials</td><td></td><td>Type: P/Boron; Orientation &lt;111> ON; Growth method: CZ; Resistivity:1-30 ohm/cm; Surface: polished; Laser cut at 7 x7 mm</td></tr><tr><td>Cryo-pin</td><td>Baltic Preparation</td><td>#16701950</td><td></td></tr><tr><td>Wired loop "Perfect loop"</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicone stripes</td><td>Picodent</td><td>Twinsil 22</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G8270</td><td></td></tr><tr><td>glucoseoxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G7141</td><td></td></tr><tr><td>catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C40</td><td></td></tr><tr><td>beta-Mercaptoethylamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M6500</td><td></td></tr><tr><td>anti-Tom20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#sc - 11415</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 fragment donkey anti rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno-Research</td><td>#711-606-152</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ROCHE, Switzerland</td><td>#10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#49782</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom petri dish</td><td>Ibidi, Germany</td><td>u-Dish 35mm, high glass bottom, #81158</td><td></td></tr><tr><td>SEM aluminium stub</td><td>Agar Scientific</td><td>#G301F</td><td></td></tr><tr><td>Conducting carbon cement Leit-C</td><td>Plano, Germany</td><td>AG3300</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Knife (Cryo Immuno)</td><td>Diatome</td><td>DCIMM3520</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica EM FCS</td><td></td></tr><tr><td>Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3D</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>160x 1.43 TIRF objective</td><td>Leica Microsystems</td><td>11523048</td><td></td></tr><tr><td>SEM - Zeiss Supra 50 VP</td><td>Zeiss</td><td>Supra 50 VP</td><td></td></tr><tr><td>FIB-SEM - Zeiss Auriga 40</td><td>Zeiss</td><td>Auriga 40</td><td></td></tr></tbody></table>

oereenstemming super resolutie en elektronenmicroscopie op te lossen eiwit lokalisatie in zebrafish retina

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Presenteren we een methode om te onderzoeken de eiwit subcellular localisatie in het larvale zebrafish netvlies door het combineren van de lichte microscopie van super resolutie en scanning elektronen microscopie. De sub diffractie limiet resolutie functionaliteit voor super-resolutie lichte microscopen kunnen verbeteren van de nauwkeurigheid van de gecorreleerde gegevens. Kort, 110 nanometer dik cryo-secties worden overgedragen aan een silicium wafer en, na immunofluorescentie kleuring, zijn beeld door de lichte microscopie van super resolutie. De secties worden vervolgens bewaard in methylcellulose en platina schaduw vóór imaging in een Scannende Elektronen Microscoop (SEM). De beelden van deze twee microscopie modaliteiten worden gemakkelijk samengevoegd met behulp van weefsel bezienswaardigheden met open sourcesoftware. Hier beschrijven we de aangepaste methode voor het larvale zebrafish netvlies. Deze methode geldt echter ook voor andere soorten weefsels en organismen. We laten zien dat de aanvullende informatie verkregen door deze correlatie is in staat om de uitdrukking van mitochondriale eiwitten in verband met de membranen en cristae mitochondria alsmede over andere compartimenten van de cel te lossen.

De expressie van het eiwit Tom20, een subeenheid van de translocase mitochondriale buitenmembraan complexe20, werd bepaald, in dunne secties van larvale zebrafish netvlies, door de lichte microscopie van super resolutie (Figuur 1) en deze informatie was aangevuld met de topografische signaal verkregen door het scannen van elektronenmicroscopie na platina schaduwen van dezelfde baanvakken. Deze oereenstemming gegevens bevestigen de lokalisatie van een proteïne in samenwerking met een bijzondere compartiment, de mitochondriale buitenmembraan en bovendien vindt u informatie over de relatie van het eiwit met andere organellen van de cel.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56113/56113fig1.jpg"> 
Figuur 1: CLEM op zebrafish netvlies. A. lage vergroting widefield afbeelding van een 5 dpf zebrafish retinale sectie kernen gekleurd met DAPI (cyaan). B. Scanning elektronen microscopie van hetzelfde gebied. C. hogere vergroting widefield beeld van frame in B. kernen gekleurd met DAPI (cyaan) en Tom20-mitochondriale kleuring verschijnt in het rood. D. Widefield afbeelding van dezelfde sectie bij hogere vergroting. Het patroon van Tom20 expressie is bij de clusters van de mitochondriën. E. expressie van Tom20 (rode stippen) gedetecteerd door GSDIM microscopie. Kernen gekleurd met DAPI (cyaan). F. dezelfde sectie als E oereenstemming super resolutie combineren en scanning elektronen microscopie. Tom20 kleuring (rode stippen) wordt weergegeven op de mitochondriale cluster (M) de buitenste membranen van de mitochondriën. Fluorescentie DAPI signaal in de kernen (N) komt overeen met de topografie van het SEM-beeld. G. hoge vergroting afbeelding van frame in F. De scanning elektronen microscopie afbeelding biedt context naar de GSDIM afbeelding (rode stippen). Mitochondriale cristae duidelijk zichtbaar zijn en de Tom20 kleuring is gelokaliseerd aan de buitenste membranen van de mitochondriën. De membranen van de buitenste segment het researchdieren (OS) zijn duidelijk opgelost. Afbeelding pixel grootte 5 nm. Schaal bars: A, B en C: 10 µm; D: 2 µm; E en F: 1 µm en G: 0,2 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/56113fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Aanvullende figuur 1: uitlijning van de figuren van licht- en elektronenmicroscopie. A. Screenshot vanuit TrackEM2-interface met SEM-beeld en genummerde bezienswaardigheden (geel) langs verschillende kernen. B. Screenshot vanuit TrackEM2-interface met fluorescentie beeld en genummerde bezienswaardigheden (geel) langs verschillende DAPI gekleurd kernen. Wijzigen van de transparantie van de laag de schuifregelaars op het linker bovenste gedeelte van het menu kunnen worden gebruikt. Schaal bar: 1 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/Supplementary_Figure_1.tif">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Dit protocol beschrijft het nodige eiwit subcellular localisatie om resultaten te verkrijgen op de zebravis netvlies door correleren super resolutie de lichte microscopie en elektronenmicroscopie afbeeldingen scannen.

Oereenstemming super resolutie en elektronenmicroscopie op te lossen eiwit lokalisatie in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Het algemene doel van deze microscopiemethode is om de eiwitexpressie in relatie tot verschillende subcellulaire organellen in het netvlies van zebrafishlarven nauwkeurig te lokaliseren door superresolutie- en scanningelektronenmicroscopiebeelden te correleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van netvliesontwikkeling en cellulaire signaalpaden, zoals de studie naar eiwitmislokalisatie in mutanten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het superresolutie combineert met scanningelektronenmicroscopie om zeer nauwkeurige eiwitlokalisatiegegevens te verkrijgen binnen de structurele context van het monster.Het verzamelen van Tokuyasu-coupes op siliconen wafers vergemakkelijkt de hantering aanzienlijk, en het gebruik van platina-schaduwwerping voor contrast biedt een goede topografie van het monster. Daarom kan deze methode inzicht verschaffen bij studies naar de retina van zebravislarven. Een van de belangrijkste voordelen is dat deze methode ook kan worden toegepast op vele andere biologische systemen, zoals de identificatie van eiwitexpressie in muisweefsel.Nadat de ogen uit gefixeerde zebravislarven zijn gedissekeerd volgens het tekstprotocol, worden 15 milliliter 12% lokale voedingsmerk gelatin in PBS opgewarmd tot 40 graden Celsius. Aspireer vervolgens de PBS uit de buisjes met ogen en voeg de gelatinoplossing toe. Tik voorzichtig tegen de buis om ervoor te zorgen dat de gelatin het monster infiltreert, en incubeer dit gedurende 10 tot 30 minuten bij 40 graden Celsius in een thermoblock met zachte schudbewegingen of in een waterbad.Vul in een waterbad van 40 °C siliconen of polyethyleen vlakke embeddingmallen van 12 bij 5 bij 3 millimeter met warme gelatine. Voeg vervolgens met een pipet twee ogen per mal toe en gebruik onder een binoculaire microscoop een dissectienaald om ze correct uit te lijnen. Laat de gelatine één minuut op kamertemperatuur afkoelen en plaats deze vervolgens 20 minuten bij 4 °C om te laten uitharden.Trim het gelatineblok onder de binoculair opnieuw bij met een scheermesje, zodat elk blok één oog bevat. Overbreng de in gelatine ingebedde ogen naar 2,3 molair sucrose in PBS op ijs. Incubeer de monsters gedurende de nacht bij vier graden Celsius.Vervang vervolgens de monsters door een verse 2,3 molaire sucrose-oplossing. Bewaar het weefsel bij vier graden Celsius, of bij minus 20 graden Celsius voor bewaring tot meerdere maanden. Trim het gelatineblok opnieuw tot bijna de grootte van het oog voordat het naar een cryo-pin wordt overgebracht.Bevries vervolgens het blok in vloeibare stikstof en breng het over naar een cryo-ultramicrotoom. Snijd met een diamantmes in de cryo-ultramicrotoom secties van 110 nanometer dik bij minus 120 °C. Pak de secties op met een metalen lus die een druppel van een 2% methylcellulose- en 2,3 M sucrose-oplossing bevat.Breng vervolgens de coupes over naar een siliciumwafer van zeven bij zeven millimeter. Om de wafers te wassen, pipetteert u vier druppels en plaatst u de wafers ondersteboven op de druppels. Incubeer de wafers op de druppels bij nul graden Celsius gedurende 20 minuten.Was de wafers vervolgens twee keer met PBS bij kamertemperatuur gedurende telkens twee minuten. Incubeer de monsters drie keer in 0,15% glycine in PBS gedurende telkens één minuut. Was de monsters daarna drie keer met PBS gedurende één minuut per wasbeurt.Pre-incubeer het weefsel vijf minuten met PBG. Voeg vervolgens rabbit anti-Tom20 in PBG toe aan de coupes. Incubeer de wafers gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Was het weefsel zes keer gedurende één minuut per wasbeurt met PBG. Pre-incubeer de monsters vervolgens vijf minuten bij kamertemperatuur met PBG. Vervang de PBG door Alexa 647 anti-konijn bivalente Fab-fragmenten in PBG en incubeer gedurende 30 minuten.Was de monsters zes keer gedurende één minuut per wasbeurt in PBG. Was de wafers vervolgens drie keer gedurende twee minuten met PBS. Voeg DAPI en PBS toe aan de wafers en laat dit 10 seconden incuberen.Was de monsters vervolgens twee keer gedurende twee minuten met PBS. Plaats de wafer op een druppel van een één-op-één oplossing van 80%glycerol en beeldvormingsbuffer die een zuurstofvrijmakingssysteem bevat en incubeer deze kort. Breng de wafers met de weefselzijde naar beneden over naar een verse druppel van het één-op-één mengsel van 80%glycerol en beeldvormingsbuffer op een glazen Petrischaal.Gebruik een pipet aan alle zijden om het grootste deel van de vloeistof onder de wafer te verwijderen. Gebruik vervolgens siliconenstrips om de waferten vast te zetten op de bodem van de Petrischaal. Plaats de gemonteerde secties op een omgekeerde microscoop met een olie-immersieobjectief met een hoge numerieke apertuur.Laat het monster vóór het beeldvormen equilibreren naar de microscooptemperatuur om laterale en axiale drift te minimaliseren of te verminderen. Centreer het gebied van interesse en neem referentiebeelden via breedveld-epifluorescentie. Schakel over naar de superresolutie-modus.Stel de belichtingstijd van de camera in op 15 milliseconden en zet de elektronvermenigvuldigingsversterking op het maximum van 300. Verlicht vervolgens het monster in epifluorescentiemodus met de 642 nanometer laser op maximale lasersterkte. Zodra de knipperingen van de enkelvoudige moleculen in elk frame goed gescheiden zijn, zodat de kans op overlap van individuele signalen gering is, wordt de lasersterkte verminderd tot bijna 1/3.Registreer het ruwe beeld in epifluorescentie door minimaal 30.000 frames vast te leggen. Gebruik vanuit de ruwe gegevens onder Tools, t-Series Analysis een detectiedrempel van 30 fotonen. Klik op Evaluate om een lijst met lokalisatiegebeurtenissen te genereren.Klik onder Tools, in het paneel Eventlist Processing, op Create Image om de superresolutie-afbeelding via Gaussian fitting te visualiseren, waarbij een rendering-pixelgrootte van vier nanometer wordt toegepast. Verwijder de siliconenstrepen en voeg een druppel PBS toe dicht bij de randen van de wafer om deze uit de Petrischaal te tillen. Nadat de wafer twee keer gedurende telkens twee minuten met PBS is gewassen, wordt deze vijf minuten gefixeerd met 0,1% glutaraldehyde in PBS.Was de sample vervolgens nog twee keer gedurende twee minuten per wasbeurt in PBS. Incubeer de wafer twee keer gedurende vijf minuten per incubatie in één druppel 2% methylcellulose in water op ijs. Plaats de wafer vervolgens in een centrifugebuis en centrifugeer 90 seconden bij 14 100 ×g.Monteer na het centrifugeren de wafer op een aluminium SEM-stub met behulp van geleidend koolstofcement. Breng met een elektronenstraalverdampingsapparaat een laag platina-koolstof van twee tot 10 nanometer aan op het monster via rotatie-schaduwwerking met de volgende instellingen. Beeld de secties met een scanning elektronenmicroscoop bij 1,5 kilovolt, een werkafstand van twee millimeter en met een in-lens secundaire elektrondetector.Gebruik Fiji om zowel de licht- als de elektronenmicroscopiebeelden te openen door op Bestand, Openen te klikken. Pas de grootte van het canvas aan door op Afbeelding, Aanpassen, Canvasgrootte te klikken. Maak vervolgens van beide beelden een stack door op Afbeelding, Stacks, Beelden naar Stack te klikken.Open in Fiji een nieuwe Track EM2-interface door op Bestand, Nieuw, Track EM2 nieuw te klikken. Importeer de stack met beide afbeeldingen door met de rechtermuisknop op het zwarte venster te klikken en Importeer stack te selecteren. Lijn de lichtmicroscopie-afbeelding handmatig uit op de elektronenmicroscopie-afbeelding met behulp van referentiepunten door met de rechtermuisknop op de afbeelding te klikken en Uitlijnen, Laag handmatig uitlijnen met referentiepunten te selecteren.Kies het Select-instrument om oriëntatiepunten toe te voegen. Gebruik de vorm van de kernen als referentie om dezelfde randen in beide afbeeldingen te selecteren en om meerdere punten toe te voegen. Pas de uitlijning toe met een affien model door met de rechtermuisknop te klikken en Apply transform, Affine Model te selecteren.Pas tot slot de transparantie van de laag aan om de kwaliteit van de uitlijning te beoordelen. Dit paneel toont een breedveldbeeld bij lage vergroting van een retinasectie van een zebravis vijf dagen na bevruchting. Hetzelfde gebied wordt hier getoond middels scanning-elektronenmicroscopie.Deze beelden met hogere vergroting tonen Tom20-kleuring in rood met clusters bij de mitochondriën. De expressie van Tom20 wordt hier getoond zoals gedetecteerd met GSDIM-microscopie. In dit beeld combineert dezelfde sectie correlatieve superresolutie- en scanning elektronenmicroscopie.Tom20-kleuring is zichtbaar binnen de mitochondriale cluster aan de buitenmembranen van de mitochondriën. Het fluorescerende DAPI-signaal in de kernen komt overeen met de topografie van de SEM-afbeelding. Deze SEM-afbeelding biedt context voor de Tom20-kleuring in de GSDIM-afbeelding.Mitochondriale cristae zijn duidelijk zichtbaar en de Tom20-kleuring is gelokaliseerd op de buitenmembranen van de mitochondriën. De membranen van het buitenste segment van de fotoreceptoren zijn duidelijk zichtbaar. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de labelings- en beeld acquisitieparameters zo goed mogelijk te optimaliseren.Alleen optimaal gelabelde monsters zijn geschikt voor superresolutie. Monsters mogen op geen enkel moment tijdens de labelprocedure uitdrogen. Deze procedure kan worden uitgebreid naar dubbele immunofluorescentie-labeling, waardoor de lokalisatie van twee verschillende eiwitten binnen een specifieke structuur mogelijk wordt.In het geval van complexere monsters wordt het gebruik van fiduciaire markeringen aanbevolen om een nauwkeurige uitlijning van de beelden te verkrijgen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u correlatieve studies uitvoert voor het lokaliseren van eiwitten in relatie tot de verschillende organellen van de cel in een complex weefselmonster met superresolutie-precisie.

correlative-super-resolution-electron-microscopy-to-resolve-protein

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Demonstreren we een protocol om chimere zebravis embryo's te genereren voor live-imaging cellulaire gedrag tijdens de embryogenese.

Transplantatie van GFP-expressie blastomeren voor Live Beeldvorming van het netvlies en de ontwikkeling van de hersenen in chimère zebravis embryo&#39;s

Dit artikel beschrijft een aanpak voor zebravis netvliezen microdissect met en zonder retinale pigmentepitheel bevestigd, van een tot drie dagen postfertilization embryo's.

Microdissectie van de zebravis embryonale oogweefsels

In deze video worden de technieken voor multicolor confocale time-lapse imaging en gerichte cel ablatie verstrekt. Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van meerdere celtypen van belang te...

Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation

Een methode om een ​​doelwit eiwit expressie voorwaardelijk knockdown in de volwassen zebravissen netvlies wordt beschreven, wat inhoudt intravitreally injecteren van antisense morpholinos en electroporating ze in het netvlies. De daaruit resulterende eiwitten neergeslagen voor meerdere dagen, waardoor het testen van de eiwit rol in de regenereren of intact netvlies.

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

We introduceren een efficiënte methode om retinale ganglioncellen (RGC's) bij volwassen zebravissen retrograad te labelen.

Retrograde Labeling van retinale ganglioncellen in Adult zebravis met fluorescente kleurstoffen

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Lichtbladfluorescentiemicroscopie is een uitstekend hulpmiddel voor het beeldvormen van embryonale ontwikkeling. Het maakt het mogelijk om lange time-lapse films van levende embryo's op te nemen in bijna fysiologische omstandigheden. We demonstreren de toepassing ervan voor het beeldvormen van de oogontwikkeling van zebravissen over brede ruimtelijk-temporele schalen en presenteren een pijplijn voor het samenvoegen en deconvolutie van multiview datasets.

Met behulp van Light Sheet fluorescentiemicroscopie met Afbeelding zebravis Eye Development

Dit protocol toont sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op cryosecties van in het beginstadium zebravis-embryo's die precieze colokalisatie analyses in specifieke celpopulaties mogelijk maken.

Sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op Gecryode zebravis-embryo's

Deze protocollen werden ontwikkeld om de corticale lens morfologie, structurele integriteit van de zebravis lens hechtingen in vaste en live lenzen te analyseren en om de positie van de zebravis lens Nucleus te meten langs de voorste-posterior as.

Beoordeling van zebravis lens Nucleus lokalisatie en Sutural integriteit

Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.

4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

Dit protocol schetst de gedetailleerde stappen van het pre-embedden van immuno-elektronenmicroscopie, met een focus op het verkennen van synaptische circuits en eiwitlokalisatie in het netvlies.

Onderzoek naar retinale circuits en moleculaire lokalisatie door pre-embedding immuno-elektronenmicroscopie

Leer een correlative microscopiemethode voor eiwitlokalisatie in het larvenretina van zebrafish met superresolutie en rasterelektronenmicroscopie. Deze techniek biedt inzicht in retinale ontwikkeling en subcellulaire structuren.

Oereenstemming super resolutie en elektronenmicroscopie op te lossen eiwit lokalisatie in Zebrafish Retina

Meer video's verkennen