Name: Cryopreservatie van zebravis testis van hele Testes Needle ondergedompeld Ultra snelle koeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Leer de needle immersed vitrification-methode voor cryopreservatie van hele zebravis-testes. Dit protocol vereenvoudigt kiemcel-isolatie door eliminatie van spermatozoa na ontdooien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de National Research, ontwikkeling en innovatie Office van Hongarije (grant 116912 naar ÁH), het Bureau van de kosten (voedsel en landbouw kosten actie FA1205: AQUAGAMETE), de door Hungaricum Scholarship Programme (subsidie voor ZM) en de nieuwe Hongaarse nationale Excellence predoctoraal Fellowship (grant tegen EK).

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Hongaarse Animal Welfare wet.
1. reagens voorbereiding
<ol><li>Stamoplossingen<ol>
<li>Bereiden 1 M trehalose door 0.378 g trehalose dihydraat toe te voegen in 1 mL dH2O. Mix, goed tot het volledig oplost.</li>
		<li>Bereiden 1 M sacharose door toe te voegen 0.342 g van sacharose in 1 mL dH2O. Mix goed totdat het volledig oplost.</li>
		<li>Bereiden 1 M HEPES door 0.238 g HEPES toe te voegen aan 1 mL dH2O. Mix, goed tot het volledig oplost.</li>
		<li>20 mg/mL collagenase (290 U/mg) voor te bereiden door 100 mg 5 ml PBS toe te voegen. Meng totdat het oplost. Steriel filter via 0,2 µm filters. Aliquot 50 µL in 0,2 mL PCR buizen en bevriezen bij - 20 ° C.</li>
		<li>Bereiden van 15 mg/mL trypsine (~ 10000 U/mg) door 75 mg 5 ml PBS toe te voegen. Meng totdat het oplost. Steriel filter via 0,2 µm filters. Aliquot 50 µL in 0,2 mL PCR buizen en bevriezen bij - 20 ° C.</li>
		<li>Bereiden van 1 mg/mL DNase ik (~ 3000 U/mg) door toevoeging van 5 mg naar 5 mL PBS. Meng totdat het oplost. Steriel filter via 0,2 µm filters. Aliquot 50 µL in 0,2 mL PCR buizen en bevriezen bij - 20 ° C.</li>
		<li>0,4% trypan blauwe voorbereiden door 40 mg trypan blauw 10 ml PBS toe te voegen. Steriel filter via 0,2 µm filters. Aliquot 1 mL in buizen van 1,5 mL.</li>
		<li>Bereiden van 200 mg/L MS-222 (tricaïne methaan sulfonaat) door toevoeging van 200 mg MS-222 in 1 L voor dH2O. Mix goed totdat het volledig oplost. Bovendien, de MS-222 Bufferoplossing met natriumbicarbonaat aan een neutrale pH van 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oplossingen voor de verglazing<ol>
<li>Oplossing (ES) bereiden: bereiden van 2 mL van ES door het mengen van 121.5 µL van methanol (MeOH; 1,5 M), 220 µL van propyleenglycol (PG; 1,5 M), 200 µL van FBS (10%), 200 µL van trehalose stockoplossing (0.1 M), 50 µL van HEPES-stockoplossing (25 mM) en 1208.5 µL van L-15 in een 2 mL-buis.</li>
		<li>Verglazing oplossing (VS) voor te bereiden: bereiden van 2 mL van de VS door het mengen van 439 µL van PG (3 M), 426 µL van dimethylsulfoxide (Me2dus; 3 M), 200 µL van FBS (10%), 200 µL van trehalose stockoplossing (0.1 M), 50 µL van HEPES stock oplossing (25 mM) en 685 µL van L-15 in een 2 mL-buis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oplossingenvoor opwarming van de aarde<ol>
<li>Opwarming van de aarde oplossing 1 (WS1) bereiden: bereiden van 1,5 mL WS1 in een tube 2 mL door het mengen van 150 µL van FBS (10%), 450 µL van sacharose stockoplossing (3 M) en 900 µL van L-15.</li>
		<li>Opwarming van de aarde oplossing 2 (WS2) bereiden: bereiden van 1,5 mL WS2 in een tube 2 mL door het mengen van 150 µL van FBS (10%), 150 µL van sacharose stockoplossing (1 M) en 1200 µL van L-15.</li>
		<li>Opwarming van de aarde oplossing 3 (WS3) bereiden: bereiden van 1,5 mL WS2 in een tube 2 mL door mengen 150 µL FBS (10%) en 1350 µL van L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiden van spijsvertering oplossing: voor elk monster bereid 500 µL van de spijsvertering-oplossing door het mengen van 50 µL van collagenase stockoplossing (2 mg/mL), 50 µL van trypsine stockoplossing (1,5 mg/mL), 10 µL van DNase ik (20 µg/mL) en 390 µL van L-15 in een 2 mL tube.</li>
	<li>Dissectie's aanschaffen: schaar, microscissors, pincet, gebogen pincet en acupunctuurnaalden.</li>
</ol>2. de testes collectie
<ol><li>De vis euthanaseren door deze te plaatsen in een schotel met 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Voordat u verdergaat met de dissectie, ervoor te zorgen dat de kieuwen zijn gestopt met het verplaatsen en dat ten minste 10 minuten zijn verstreken sinds dat moment om dood door hypoxie.</li>
	<li>De vis drogen door het klopte op een papieren handdoek en breng dit aan de dorsale zijde op een ontleden mat.<ol>
<li>Ten eerste afgesneden de bekken- en borstvinnen vinnen voor gemakkelijker dissectie.</li>
		<li>Horizontaal snip de huid op de buik van de vis tussen de borstvinnen en snijd de huid en onderliggende spieren langs de buik tot de anaalvin.</li>
		<li>Open de lichaamsholte van de vis en de linker- en lichaam muur aan de dissectie mat pins met naalden. Opmerking: De teelballen bevinden zich boven de gastro-intestinale organen aan beide zijden van de blaas zwemmen (Figuur 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorkom besmetting en niet nemen de gastro-intestinale organen, maar zachtjes duw ze aan de ene kant en de testis uit de tegengestelde kant verwijderen. Teelballen zijn aangesloten op de muur van het lichaam dus verwijder ze zorgvuldig en snijd het aansluitende buikvlies door microscissors.</li>
	<li>Bovendien, om te voorkomen dat besmetting, ten eerste steriliseren de teelballen door ze in 70% ethanol voor 2 s, en vervolgens plaats hen in L-15 op een 96-wells-plaat op ijs. Opmerking: Als het nodig is, schoon-testikels uit vetweefsel en grote bloed vaartuigen juist onder de stereomicroscoop</li>
</ol>3. Ultra-snelle koeling van de zaadbalweefsel
<ol><li>Mark naalden met passende etiketten afhankelijk van het monster Typ en bereiden de evenwichtsinstelling (ES) en de verglazing oplossingen (VS).</li>
	<li>Overbrengen in de teelballen een grotere goed bord of schotel en pin twee tot drie teelballen (of meer afhankelijk van de grootte van de naald) op een steriele acupunctuur naald.<ol>
<li>In de eerste plaats de testis bovenop gebogen pincet. Plaats de punt van de naald in het midden van de testis en trek voorzichtig de testis omhoog met de pincet.</li>
		<li>Na het prikken de testis, Trek voorzichtig het omhoog naar de top van de naald. Controleer of de teelballen van elkaar zijn gescheiden en dat zij niet eraf of glijdend van.</li>
		<li>Plaats de naalden met vastgezette teelballen in een tube 2 mL gevuld met L-15 tot verglazing (bij 25 ˚C; opslagtijd moet niet meer dan 1 h). Opmerking: De teelballen vastzetten op de naald moet gebeuren snel om te voorkomen dat de teelballen uitdrogen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Breng de naald met de teelballen in de oplossing en incubeer gedurende 5 min op 25˚C.</li>
	<li>Breng de naald in de verglazing oplossing en incubeer 30 s bij 25˚C.</li>
	<li>Verwijder de naald uit de verglazing oplossing, snel en zachtjes absorberen de resterende oplossing van het weefsel door een steriel papier handdoek. Wees voorzichtig om te voorkomen dat de teelballen vasthouden aan de papieren handdoek of eraf.</li>
	<li>Plaats de naald snel in vloeibare stikstof geplaatst in een doos van piepschuim. Opmerking: Deze stap snel om te voorkomen dat blootstelling van weefsel aan de vloeibare stikstof damp doen. Het gebruik van lage volumes van vloeibare stikstof ter voorkoming van kruisbesmetting van monsters.</li>
	<li>Houd de naald in vloeibare stikstof in een gesloten doos van piepschuim voor 5-10 min.</li>
	<li>Precool een geopende 4.5 mL cryotube en haar cap in hetzelfde vak.</li>
	<li>Na 5-10 min, elke naald overboeken naar een aparte cryotube onder het oppervlak van de vloeibare stikstof en sluit de cryotube. Let op: Gebruik altijd beschermende kleding (zoals geïsoleerde handschoenen) wanneer werken met vloeibare stikstof, zoals blootstelling tot ernstige bevriezing leiden kan.</li>
	<li>Plaats de cryotube op een metalen stok en plaats het in de cryobank bus zo snel mogelijk. Opslaan van de monsters in een busje opslag dewar tot verder gebruik.</li>
</ol>4. opwarming van de aarde Procedure
<ol><li>Elke naald afzonderlijk warm. Alle oplossingen van de opwarming van de aarde moet bij 25 ° C.</li>
	<li>Loskoppelen van de cryotube van de metalen stok en duik het in vloeibare stikstof zijn opgeslagen in een doos van piepschuim.</li>
	<li>Open het cryotube in de damp van de vloeibare stikstof (met pincet) en introductie van de naald in de vloeibare stikstof.</li>
	<li>Breng de naald zeer snel in de eerste oplossing voor opwarming van de aarde en incubeer gedurende 1 min (bij 25 ° C). Zorg ervoor dat de naald snel om te voorkomen dat de opwarming van de aarde in de lucht tijdens de overdracht overdragen.</li>
	<li>Breng de naald in de tweede oplossing voor opwarming van de aarde en incubeer gedurende 3 minuten (bij 25 ° C).</li>
	<li>Breng de naald in de derde oplossing voor opwarming van de aarde en incubeer gedurende 5 min (bij 25 ° C).</li>
	<li>Los de teelballen van de naald glijden ze naar beneden met een gebogen pincet. Plaats elke verwarmde testis individueel in een aparte put (96-wells-plaat) gevuld met 250 µL van L-15 aangevuld met 10% FBS. Zorg ervoor dat de putten worden aangeduid volgens het monster. Houd het goed plaat op ijs totdat alle monsters worden opgewarmd en tot verdere werkzaamheden.</li>
</ol>5. de weefsels spijsvertering
<ol><li>Bereiden 500 µL van de dissociatie-oplossing voor elk monster in aparte 2 mL tubes. Label de buizen volgens de code van de steekproef. Laat de oplossing bereid dissociatie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken.</li>
	<li>Voeg het verwarmde weefsel in de oplossing van de spijsvertering en snijd het in kleine stukjes door ten minste 30 bewegingen van kleine schaar.</li>
	<li>Incubeer de gesneden weefsel op een schudden plaat voor 90 min op 25 ˚C.</li>
	<li>Stop het spijsverteringsproces door toevoeging van 400 µL van L-15 en 100 µL van FBS (10% FBS v/v). Kort zwenk de kolf en laat 1 minuut bij kamertemperatuur inwerken.</li>
	<li>De verkregen oplossing wordt gefiltreerd door 50 µm filters in een 1,5 mL-buis. Label de buizen dienovereenkomstig.</li>
	<li>Centrifugeer de gefilterde oplossing bij 200 × g gedurende 10 minuten op 25 ˚C.</li>
	<li>Zorgvuldig Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 20 µL van L15 aangevuld met 10% FBS. Handmatig schud de buis totdat de pellet volledig is opgelost. Houd de celsuspensie op ijs of op 4 ˚C tot verder gebruik.</li>
</ol>6. levensvatbaarheid evaluatie en cel tellen
<ol><li>Meng 5 µL celsuspensie en 5 µL van 0.4% trypan blauw-oplossing in een tube van de PCR op passende wijze gelabelde 0,2 mL. Als verschillende volumes worden gebruikt, zorg ervoor dat de verdunningsverhouding van 1:1 blijft.</li>
	<li>Deze schorsing gedurende 1 tot 3 minuten bij kamertemperatuur (25 ° C) incuberen.</li>
	<li>Controleer de levensvatbaarheid van elk monster in een hemocytometer onder de Microscoop.</li>
	<li>Het aantal levende cellen (onbevlekt door trypan blue) in 15 velden. Bereken het totale aantal cellen in 20 µm van de celsuspensie. De schorsing is nu klaar voor alle downstream-toepassingen. Opmerking: Bij het optimaliseren van de procedure voor andere soorten met grotere lichaamslengte, gebruik testis fragmenten van gelijk gewicht. Testes van de ene persoon voor alle experimentele groepen gebruiken om te voorkomen dat individuele variabiliteit in de resultaten. In het geval van zebravis, we profiteerde van het feit dat links en rechts testis moet bevatten een gelijke (of vergelijkbaar) aantal geslachtscellen13 (Zie de vertegenwoordiger resultaten). De linker testis werd gehouden als een besturingselement terwijl de juiste testis verglaasd/opgewarmd was. Levensvatbaarheid percentage werd berekend het aantal cellen van de verglaasd/opgewarmd testis t.o.v. het aantal cellen van de verse testis geïsoleerd werd geïsoleerd.</li>
</ol>

<ol><li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research%3A+Importance%2C+impact%2C+status%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li>
<li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li>
<li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li>
<li>Morris, J. P. IV, Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N%2CN-dimethylacetamide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li>
<li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogonial+transplantation+in+fish%3A+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+Part+D%3A+Genomics+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li>
<li>Gao, D., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cryoinjury+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cryoinjury in living cells.</a> ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).</li>
<li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress%2C+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li>
<li>Kása, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+%28Eurasian+perch%2C+Perca+fluviatilis%29+and+marine+fish+%28European+eel%2C+Anguilla+anguilla%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li>
<li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li>
<li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+needle+immersed+vitrification%3A+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li>
<li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+%28Coturnix+japonica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124(2013).</li>
<li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology%2C+viability%2C+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+%28Coturnix+japonica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Reprod.+Sci%22%5BJournal%5D)">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li>
<li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+%28Brachymystax+lenok%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li>
<li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li>
<li>Lujić, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li>
<li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22CryoLetters%22%5BJournal%5D)">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li>
<li>Marinović, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).</li>
<li>Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells%2C+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li>
<li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nati.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het voornaamste doel van deze studie was ondergedompeld Ultra snelle koeling procedure ontwikkeld voor aviaire en zoogdieren soorten10,11,12 te cryopreservatie van vis testis (zebravis als model aan te passen van de naald organisme). Allermeest naar de eerdere studies ten aanzien van cryopreservatie van genetische hulpbronnen van de zebravis waren voornamelijk gericht op cryopreservatie van zebravis sperma2</su...

Nieuwe trends in science en biotechnologie hebben geleid tot de oprichting van duizenden nieuwe mutant lijnen van muizen, Drosophila, zebravis en andere soorten gebruikt als modelorganismen transferoefeningen biomedische en andere wetenschappen1. Bovendien, als nieuwe technologieën worden ontwikkeld en beschikbaar, de nummers van mutant lijnen verhogen gestaag2. Dit leidt tot de noodzaak voor een veilige opslag van genetische hulpbronnen buiten de gemeenschappelijke praktijken van het houden van de kolonies kweken. Als een methode waarmee de veilige opslag van genetische hulpbronnen voor onbepaalde tijd, cryopreservatie biedt vele voordelen, zoals uitbreiding van reproductieve seizoen, omzeilt de behoefte aan continu onderhoud van broodstock, en het is meer kosten - en arbeid-efficiënte2.
Protocollen voor sperma cryopreservatie ontwikkeld tijdens de afgelopen verscheidene jaren2,3,4 bieden de mogelijkheid voor succesvolle opslag van zebravis mannelijke genetisch materiaal. Cryopreservatie van eieren of embryo's in vis is echter nog niet mogelijk als gevolg van hun complexe structuur en grote hoeveelheden dooier materiaal. Onlangs, de praktijk van transplantatie van primordiaal geslachtscellen (PGCs) of spermatogonial stamcellen (levens) biedt een rondweg om deze barrière door ontwikkelt zich tot functionele sperma en eieren na transplantatie5. Cryopreservatie van levens biedt daarom een nieuwe grens in het behoud van zeldzame en waardevolle genetische hulpbronnen.
Hoewel cryopreservatie vele voordelen biedt, het vriesproces van slow-tarief genereert verschillende omstandigheden die tot cel schade2 leiden kunnen. Het gaat hierbij om intracellulaire en extracellulaire ijsvorming, uitdroging, cryoprotectant toxiciteit en anderen. Intracellulair ijs schadelijk is voor de cellen, extracellulaire ijs kan leiden tot mechanische persing van de cellen, terwijl de diffusie van water uit de cellen tijdens vertragen-tarief bevriezing kan leiden tot uitdroging6. Onlangs, heeft de cryopreservatie van vis gameten7,8,9verglazing als een techniek waardoor de negatieve effecten van ijsvorming zijn toegepast. Het presenteert een ultra snelle koeling techniek waardoor de interne en externe media omzetten in een amorfe/glazig staat zonder crystalizing in ijs7,10. Succesvolle verglazing van testiculaire en ovarieel weefsel heeft aangetoond in aviaire en zoogdieren soorten10,11,12, dus het openen van mogelijkheden voor de toepassing in de vis, alsmede.
In deze studie presenteren wij de naald ondergedompeld verglazing (NIV) procedure voor cryopreservatie van hele zebrafish teelballen. We tonen een betrouwbare methode voor de isolatie van de zebravis beginnende kiemcellen zonder besmetting en een cryopreservatie proces dat relatief hoge bedragen van beginnende kiemcellen met een geringe aanwezigheid van andere cellen, met name van spermacellen levert. Tot de beste van onze kennis is dit de eerste studie om aan te tonen een gedetailleerde gevisualiseerde protocol voor ultra snelle koeling van vis gonadale weefsel en zebrafish germline cellen. Bovendien, herhaalbaarheid van de methode is aangetoond in vijf verschillende zebrafish stammen: AB wild type, casper (roy- / -; nacre- / -), leopard (leot1/t1), vasa [GS (vas::eGFP)] en Wilms tumor [GS (wt1b::eGFP 1)] transgene lijn.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz media (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Supplemented met L-glutamine</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methaansulfonaat (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Dihydraat</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Reanal</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Propyleenglycol</td><td>Reanal</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Reanal</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Collageenase</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tabletten voor bereiding van 200 ml PBS-oplossing</td></tr></tbody></table>

cryopreservatie van zebravis testis van hele testes needle ondergedompeld ultra snelle koeling

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Huidige trends in science en biotechnologie leiden tot de oprichting van duizenden nieuwe lijnen in modelorganismen, waardoor de noodzaak voor nieuwe methoden voor de veilige opslag van genetische hulpbronnen buiten de gemeenschappelijke praktijken van het houden van de kolonies kweken. Het belangrijkste doel van deze studie was aan te passen de naald ondergedompeld verglazing (NIV) procedure om te cryopreserve hele zebrafish teelballen. Cryopreservatie van beginnende geslachtscellen door hele teelballen NIV biedt mogelijkheden voor de opslag van zebravis genetische hulpbronnen, vooral omdat na de transplantatie ze in zowel mannelijke als vrouwelijke gameten rijpen kunnen. Teelballen waren weggesneden, gevestigd op een acupunctuur-naald, geëquilibreerd in twee cryoprotective media (oplossing met 1,5 M methanol en 1,5 M propyleenglycol; en verglazing oplossing met dimethylsulfoxide van 3 M en 3 M propyleenglycol) en duik in vloeibare stikstof. Monsters werden opgewarmd in een reeks van drie oplossingen voor daaruit voortvloeiende opwarming van de aarde. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn (1) het ontbreken van spermatozoïden na vertering van verwarmde teelballen waardoor downstream manipulaties; (2) Ultra snelle koeling waardoor de optimale Gasbedwelming met behulp van weefsels vloeibare stikstof, dus het maximaliseren van de koeling en het verminderen van de vereiste concentratie van cryoprotectant, waardoor hun toxiciteit; (3) synchrone Gasbedwelming met behulp van verschillende teelballen cryoprotectant en vloeibare stikstof; en (4) herhaalbaarheid aangetoond door het verkrijgen van de levensvatbaarheid van boven de 50% in vijf verschillende zebrafish stammen.

Gemiddeld, het aantal beginnende kiemcellen geïsoleerd uit een enkele verse zebrafish testis varieerde tussen de 40.000 en 200.000 cellen afhankelijk van de grootte van de vis. Wanneer verteren verse zebrafish teelballen in alle 5 stammen, waren vroege-kiemcellen niet de enige cellen aanwezig in de cel suspensies (Figuur 2). Naast de beginnende geslachtscellen, werden talrijke spermacellen teruggevonden. Aan de andere kant, waren er veel minder spermacellen n...

Het belangrijkste doel van deze studie was aan te passen de naald ondergedompeld verglazing (NIV) procedure om te cryopreserve hele zebrafish teelballen. Daarnaast is de herhaalbaarheid van de methode in vijf verschillende zebrafish stammen was getest.

Cryopreservatie van zebravis testis van hele Testes Needle ondergedompeld Ultra snelle koeling

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

Cryopreservatie biedt de mogelijkheid om levende cellen en weefsels gedurende een onbeperkte tijd, althans in menselijke termen, bij lage temperaturen te bewaren. Vitrificatie is een vorm van cryopreservatie waarbij sprake is van ultrarapide afkoeling tot een glasachtige, amorfe toestand zonder de vorming van kristallijn ijs en de daarmee gepaard gaande beschadigingen. In deze video presenteren we het protocol voor de vitrificatie van volledige zebravis-testes, wat een veilige opslag mogelijk maakt totdat ze later kunnen worden gebruikt als bron van kiemcellen voor transplantatie in geschikte recipiënten.Het huidige vitrificatieprotocol heeft één significant voordeel ten opzichte van de protocollen voor langzame invriezing met betrekking tot manipulaties van kiemstamcellen. Dat is dat de spermatozoa na vitrificatie en opwarmen afsterven en zodanig worden aangepast dat ze niet aanwezig zijn in de celsuspensie. Daarom is isolatie van kiemcellen na het opwarmen niet nodig.En dat vergemakkelijkt de daaropvolgende manipulaties. Euthanaseer de vis door deze in een schaal met 200 mg/L MS-222 bij pH 7 te plaatsen. Voordat u voortgaat met de dissectie, moet u controleren of de kieuwen zijn gestopt met bewegen en dat er minstens 10 minuten zijn verstreken sinds dat moment om de dood door hypoxie te garanderen.Droog de vis door deze op een papieren handdoek te deppen en plaats de vis op de rugzijde op een dissectiemat. Verwijder eerst de bekken- en borstvinnen voor een eenvoudigere dissectie. Knip de huid op de buik van de vis horizontaal tussen de borstvinnen door en snijd de huid en de onderliggende spier langs de buik tot aan de anaalvin.Open de lichaamsholte van de vis en zet de linker- en rechterlichaamswand met naalden vast op de dissectiemat. De testikels bevinden zich boven de maag-darmorganen, aan beide zijden van de zwemblaas. Om contaminatie te voorkomen, mogen de maag-darmorganen niet worden verwijderd, maar moeten ze voorzichtig naar één zijde worden geduwd om de testikels aan de tegenovergestelde zijde te verwijderen.De teelballen zijn verbonden met de lichaamswand, dus verwijder deze voorzichtig en knip het verbindende peritoneum door met microschaartjes. Om contaminatie te voorkomen, worden de teelballen vervolgens gesteriliseerd door ze twee seconden in 70% ethanol te plaatsen, waarna ze in L-15 op een 96-wells plaat op ijs worden geplaatst. Markeer de naalden met de juiste labels, afhankelijk van het monstertype, en bereid de equilibratie- en vitrificatie-oplossingen voor.Breng de testikels over naar een plaat met grotere putjes of een schaal en spies drie of meer testikels, afhankelijk van de grootte van de naald, op een steriele acupuctuurnaald. Positioneer eerst de testikels bovenop gebogen pincetten. Plaats de punt van de naald in het midden van de testikel en trek de testikel voorzichtig met de pincetten omhoog.Trek na het doorprikken van de testis deze voorzichtig omhoog naar de bovenkant van de naald. Zorg ervoor dat de testes van elkaar gescheiden zijn en niet loslaten of naar beneden glijden. Plaats de naalden met de gefixeerde testes in een Tubulator Eppendorf-buis gevuld met L-15 tot aan de vitrificatie bij 25 graden.De bewaartijd mag één uur niet overschrijden. Breng de naald met de testikels over in de equilibratie-oplossing en incubeer gedurende vijf minuten bij 25 graden. Breng de naald over in de vitrificatie-oplossing en incubeer gedurende 30 seconden bij 25 graden.Verwijder de naald uit de vitrificatie-oplossing. Absorbeer de resterende oplossing snel en voorzichtig uit het weefsel met een steriel papieren handdoekje. Wees voorzichtig om te voorkomen dat de testes aan het papieren handdoekje kleven of eraf vallen.Plaats de naald snel in vloeibare stikstof in een styrofoombak. Houd de naald vijf tot 10 minuten in vloeibare stikstof in een gesloten styrofoombak. Pre-koel een geopende cryobuis van 4,5 milliliter en de bijbehorende dop in dezelfde bak.Na vijf tot 10 minuten wordt elke naald onder het oppervlak van vloeibare stikstof in een aparte cryobuis overgebracht en wordt de cryobuis gesloten. Plaats de cryobuis op een metalen houder en plaats deze zo snel mogelijk in de cryobank-container. Bewaar de monsters in een lade van de container tot aan het verdere gebruik.Warm elke naald afzonderlijk op. Alle opwarmingsoplossingen moeten een temperatuur van 25 °C hebben. Verwijder de cryobuis uit de metalen houder en dompel deze onder in vloeibare stikstof die bewaard wordt in een piepschuimdoos.Open de cryobuizer in de stikstofdamp met een pincet en laat de naald in de vloeibare stikstof zakken. Verplaats de naald zeer snel naar de eerste opwarmingsoplossing en incubeer gedurende één minuut. Zorg ervoor dat de naald snel wordt overgebracht om opwarming in de lucht tijdens de overdracht te voorkomen.Plaats de naald in de tweede opwarmingsoplossing en incubeer deze gedurende drie minuten. Plaats de naald vervolgens in de derde opwarmingsoplossing en incubeer deze gedurende vijf minuten. Verwijder de testikels van de naald door ze met gebogen pincetten naar beneden te schuiven.Plaats elke opgewarmde testis individueel in een aparte put gevuld met 250 µL L-15, aangevuld met 10% FPS. Zorg ervoor dat de putten zijn gelabeld volgens het monster. Houd de wellplaat op ijs totdat alle monsters zijn opgewarmd en tot aan verdere verwerking.Bereid 500 µL van de dissociatierestoplossing voor voor elk monster in afzonderlijke buisjes van twee milliliter. Label de buisjes volgens de code van het monster. Incubeer de bereide dissociatieoplossing gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Voeg het opgewarmde weefsel toe aan de digestie-oplossing en knip het in kleine stukjes met ten minste 30 knippewegsels van een kleine schaar. Incubeer het weefsel 90 minuten bij 24 °C op een schudplaat. Stop het digestieproces door 400 µL L-15 en 100 µL 10% FPS toe te voegen.Schud de oplossing kort en incubeer deze gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Filtreer de verkregen oplossing door 50-micron filters in een buisje van 1,5 milliliter. Label de buisjes dienovereenkomstig.Centrifugeer de gefilterde oplossing bij 200 G gedurende 10 minuten bij 25 °C. Verwijder voorzichtig het supernatans en resuspendeer het pellet in 20 µL L-15, aangevuld met 10% FPS. Schud de buis handmatig tot het pellet volledig is opgelost.Houd de celsuspensie op ijs of bij vier graden tot aan verder gebruik. Meng vijf microliters celsuspensie en vijf microliters 0,4% trypaanblauwoplossing in een geschikt gelabelde 0,2 milliliter PCR-buis. Als er andere volumes worden gebruikt, zorg er dan voor dat de verdunningsverhouding van één op één behouden blijft.Incubeer deze suspensie gedurende één tot drie minuten bij 25 °C. Controleer de levensvatbaarheid van elk monster in een hemocytometer onder een microscoop. Tel het aantal levende cellen dat niet is gekleurd door trypaanblauw in 15 velden.Bereken het totale aantal cellen in 20 µL van de celsuspensie. De suspensie is nu klaar voor elke verdere toepassing. Gemiddeld varieert het aantal vroegstadium kiemcellen dat uit één verse zebravisteis wordt geïsoleerd tussen 40.000 en 200.000 cellen, afhankelijk van de grootte van de vis.In alle zebrafish-lijnen die in deze studie zijn gebruikt, leverde het huidige vitrificatieprotocol gemiddelde overlevingspercentages van 50% en hoger op. Dit wijst op een gunstige levensvatbaarheid en reproduceerbaarheid van het gepresenteerde protocol. Bij het verteren van verse zebrafish-testikels in alle vijf de stammen werden, naast kiemcellen in een vroeg stadium, ook talrijke spermatozoa aangetroffen.Na digestie van cryobewaarde testikels waren er aanzienlijk minder spermatozoa aanwezig, wat erop wijst dat zij dit vitrificatieprotocol niet overleven en zeer waarschijnlijk tijdens het digestieproces worden geëlimineerd. Het in deze studie gepresenteerde vitrificatieprotocol met naaldimmersie biedt verschillende voordelen bij de cryobehoud van testikelstukjes. Ten eerste kunnen meerdere stukjes aan één naald worden bevestigd, waardoor ze gelijktijdig kunnen worden blootgesteld aan cryoprotectanten en vloeibare stikstof.Bovendien maakt deze methode het mogelijk dat er zeer lage hoeveelheden cryoprotectanten aan de weefselstukjes worden gebonden. Hierdoor kunnen de koel- en opwarmingssnelheden hoger liggen. Een significant voordeel is dat spermatozoa dit protocol niet overleven, waardoor de celsuspensies uiteindelijk verrijkt zijn met spermatogonia, wat de daaropvolgende toepassingen zal vergemakkelijken.Eén ding dat echter in rekening moet worden gebracht, is de mogelijkheid van kruisbesmetting via stikstof. Daarom mag vloeibare stikstof bij het gebruik van deze methode niet worden hergebruikt.

cryopreservation-zebrafish-spermatogonia-whole-testes-needle-immersed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit is een high-throughput sperma cryopreservatie protocol voor zebravis. Sperma gecryopreserveerde gebruik van dit protocol is een gemiddelde van 25% in de daaropvolgende vruchtbaarheid vitro fertilisatie en is stabiel gedurende vele jaren.

Een high-throughput-methode voor zebravis sperma cryopreservatie en In Vitro Bevruchting

Dit is een methode voor het genereren van gynogenetische diploïde zebravissenembryo's (embryo's waarvan de enige genetische bijdrage van de moeder afkomstig is) door de tweede meiotische deling onmiddellijk na bevruchting met ultraviolet-geïnactiveerde sperma te blokkeren. EP-embryo's zijn niet volledig homozygoot vanwege recombinatie tijdens de eerste meiotische deling, maar ze zijn wel homozygoot op alle loci die niet door recombinatie van hun centromeer zijn gescheiden.

Het maken van Gynogenetic Diploïde zebravis in het begin van Pressure

In this video, we describe the procedure for vitrification of harvested rabbit embryos at desired development stage using ethylene glycol and dimethyl sulfoxide as cryoprotectants and cryogenic straw as the carrier system. The vitrified embryos have high survival rate and can be stored for an extended period until use.

Rabbit Embryo Vitrification Using Cryogenic Straw:  An Ultra-Rapid Cooling Technique to Preserve Rabbit Embryos for Long-term Storage

De zebravis is een krachtig modelsysteem voor ontwikkelingsbiologie en onderzoek naar menselijke ziekten vanwege hun genetische overeenkomsten met hogere gewervelde dieren. Dit protocol beschrijft een methodologie om haploïde zebravis-embryo's te creëren die kunnen worden gebruikt voor forward screen-strategieën om recessieve mutaties in genen die essentieel zijn voor vroege embryogenese te identificeren.

Productie van Haploid zebravis embryo&#39;s door<em&gt; In Vitro</em&gt; Bemesting

Het gebruik van zebravissen voor cardiovasculair onderzoek breidt zich uit naar onderzoek naar volwassen harten. Voor deze toepassingen is snelle en eenvoudige isolatie van hartweefsels essentieel om postmortale veranderingen te voorkomen en om een voldoende aantal monsters te verkrijgen. Hier beschrijven we een snelle en reproduceerbare methode voor het dissecteren van harten van volwassen zebravissen.

Herstel van de Adult zebravis Harten voor High-throughput Toepassingen

Herhaalde bloedmonsters zijn noodzakelijk en belangrijk in dieronderzoek. We ontwikkelden een nieuwe, niet-dodelijke en betrouwbare methode voor herhaalde bloedopname bij volwassen zebravissen en pasten deze methode toe op de studie van bloedbiochemie, inclusief glucosemetabolisme.

Herhaalde bloedafname voor Blood Tests in Adult zebravis

Een gewijzigde protocol voor ploïdie manipulatie maakt gebruik van een heat shock naar een één-cyclus kraam in cytokinese induceren in de vroege embryo. Dit protocol wordt gedemonstreerd in de zebravis, maar kan voor andere soorten.

Ploïdie Manipulatie van zebravis embryo&#39;s met Heat Shock 2 Treatment

Hier presenteren we een protocol voor fluorescerende antilichaamgemedieerde detectie van eiwitten in hele preparaten van zebravissen embryo's en larven.

Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven

Nucleaire oppervlaktespreads zijn een onmisbaar hulpmiddel voor het bestuderen van chromosoomgebeurtenissen tijdens meiose. Hier demonstreren we een methode om meiotische chromosomen voor te bereiden en te visualiseren tijdens profase I van zebravissen spermatocyten.

Bereiding van Meiotic Chromosome Spreads van Zebrafish Spermatocyten

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het scheiden van folliculaire cellen en oöcyten in eierstokfollikels van zebravissen, wat het onderzoek naar de ontwikkeling van eierstokvissen bij zebravissen zal vergemakkelijken.

Scheiding van folliculaire cellen en oöcyten in ovariële follikels van zebravissen

CRISPR-Cas-technologieën hebben een revolutie teweeggebracht op het gebied van genoombewerking. Het vinden en isoleren van de gewenste kiembaanbewerking blijft echter een groot knelpunt. Daarom beschrijft dit protocol een robuuste methode voor het snel screenen van F0 CRISPR-geïnjecteerd zebravissperma op kiembaanbewerkingen met behulp van standaard PCR-, restrictieverterings- en gelelektroforesetechnieken.

Screening van sperma op de snelle isolatie van kiembaanbewerkingen bij zebravissen

Leer de needle immersed vitrification-methode voor cryopreservatie van hele zebravis-testes. Dit protocol vereenvoudigt kiemcel-isolatie door eliminatie van spermatozoa na ontdooien.

Cryopreservatie van zebravis testis van hele Testes Needle ondergedompeld Ultra snelle koeling

Meer video's verkennen