Name: Gebruik van een Recombinant Mosquito Densovirus als een gen levering Vector voor de functionele analyse van genen in muggenlarven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Ontdek een methode voor genfunctie-analyse in muggenlarven met behulp van recombinant Aedes aegypti densovirus als genleveringssysteem. Dit systeem biedt hoge transductie-efficiëntie en langdurige genexpressie in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs erkennen financiële steun van de nationale sleutel onderzoek en ontwikkeling programma van China (2016YFC1200500 aan Xiao-Guang Chen), de nationale Natural Science Foundation van China (81672054 en 81371846), het onderzoeksprogramma van het Team van de natuurlijke Science Foundation van Guangdong (2014A030312016), en de wetenschappelijke en technologische programma van Guangzhou (201508020263). Wij erkennen dankbaar Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) voor het vriendelijk verstrekken de pUCA en p7NS1-GFP plasmiden en voor het kritisch lezen van dit manuscript.

alle protocollen werden goedgekeurd door de ethische commissie van zuidelijke medische universiteit.
 1. ontwerpen van een kunstmatige Intron Opmerking: de kunstmatige intron gebruikt in dit werk is 65 bp in lengte, en de volgorde is 5 &#39; - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 &#39;.
<ol><li>De Hpa plaats ik beperking site aan beide uiteinden van kunstmatige intron dus dat Hpa ik spijsvertering kan vrijkomen de intron van plasmiden (Zie Figuur 1).</li>
	<li>Plaats de twee Xba ik beperking sites in de intron dus dat Xba ik spijsvertering kan worden gebruikt voor het invoegen van de expressie van de kleine-RNA opeenvolgingen.</li>
	<li>Wordt de chemische synthese van full-length DNA-sequenties van de kunstmatige intron bestellen door een DNA-fabrikant. De synthetische DNA gemaakt is van klonen in een plasmide standaard pUC19. 
	Opmerking: De essentiële onderdelen van de kunstmatige intron omvatten diverse consensus nucleotide elementen, met inbegrip van een 5 &#39; donor splice site (DS) met de volgorde van de GUAAGAGU, een reeks (BPS) van de geconserveerde vertakkingspunt met de volgorde van de UACUAAC, een poly-pyrimidine tractus (PPT) met de reeks UCUUC(U) 10, en een 3 &#39;-acceptor splice site (AS) met de reeks GAUAUCCUGCAG ( Figuur 1). Twee Xba ik beperkingsplaatsen geïntroduceerd tussen de DS en BPS die kan worden gebruikt voor het invoegen van de expressie van de kleine-RNA-sequenties. De mogelijkheid om effectief splice deze kunstmatige intron van zoogdier- en mug cellen geweest eerder bevestigde 14.</li>
</ol> 2. Ontwerpen van een kunstmatige Intronic kleine RNA expressie Cassette Opmerking: voor overexpressie of knockdown van endogene miRNA, sequenties codering voorloper miRNA of een spons miRNA werden ingevoegd tussen de DS en BPS. Om te dienen als voorbeeld, werd een voorloper van de endogene miRNA van Ae. albopictus aal-laat-7 geselecteerd voor de bouw van recombinante virale vectoren voor miRNA overexpressie en knockdown. Een anti-let-7 spons is ontworpen volgens de eerder beschreven methoden 15. Om het neerhalen doelgenen in larven, ontwierpen we specifiek kunstmatige miRNA (amiRNA) of korte haarspeld RNA (shRNA) sequenties met behulp van online software 16 , 17; om te dienen als een voorbeeld, V-ATPase subeenheid een mRNA (toetreding neen. AY864912) werd geselecteerd als een doel-gen in deze studie. De amiRNA zal worden verwezen als amiVTP hierna. Alle details van de sequenties van pre-miRNA, shRNA, amiRNA en spons worden beschreven in de aanvullende tabel 1.
<ol><li>De chemische synthese van full-length cDNA sequenties van de voorloper van miRNAs, sponzen miRNA en shRNA met Xba bestel ik beperkingsplaatsen aan beide uiteinden van een DNA-fabrikant.</li>
	<li>Na ontvangst van de bestelde DNA, draai de buizen met DNA blokken op 10.000-14.000 x g voor 1 min om ervoor te zorgen dat alle DNA gedroogd is aan de onderkant van de buis.</li>
	<li>Resuspendeer de gedroogde DNA in DNase-gratis water om een eindconcentratie van 10 ng/µL.</li>
	<li>Verteren de plasmide ruggengraat en DNA sequenties met Xba ik bij 37 ° C gedurende 1 uur, en dan dephosphorylate van de 5 &#39; uiteinden van de ruggengraat gelineariseerde plasmide met kalf intestinale alkalisch fosfatase (CIAP) volgens de fabrikant &#39; s-protocol .</li>
	<li>Inactivering van CIAP door verwarming gedurende 60 minuten op 65 ° C.</li>
	<li>Uitvoeren van een 1,0% agarose gel en snijd de gelineariseerde ruggengraat. Pak vervolgens het DNA van het segment van de gel met een gel extractie kit na de fabrikant &#39; s instructies.</li>
	<li>Het fragment van DNA in de backboneby T4 DNA ligase (5 U/µL) bij 22 ° C gedurende 1 h. ligate</li>
	<li>Transformeren de producten van de reactie van de afbinding van stap 2.7 in bevoegde Escherichia coli (E. coli) cellen en plaat op een lysogenie Bouillon (LB) agarplaat met ampicilline (bij een concentratie van 100 µg/mL).
	<ol><li>Uitvoeren de transformatie via een warmte schok methode 18 en gebruik de juiste E. coli stam. Bijvoorbeeld, het gebruik van E. coli stam DH5α voor warmte schok transformatie.</li>
	</ol></li> <li>Pick een één kolonie uit stap van 2.8 en broeden in een cultuur van 3 mL verrijkt middellange met ampicilline (bij een concentratie van 100 µg/mL).</li>
	<li>Pak het plasmide DNA uit de bacteriële cultuur met behulp van een mini prep kit na de fabrikant &#39; s instructies. Het monster verzenden een DNA sequencing bedrijf. 
	Opmerking: Voor overexpressie of knockdown van endogene miRNA, de codering van de voorloper van miRNA of een spons miRNA sequenties werden ingevoegd tussen de twee Xba ik sites. Alle miRNA expressie of spons constructies moet korter zijn dan 400 bp (10% van de lengte van het virale genoom) als gevolg van de limiet van de verpakking van de virus- 19.</li>
</ol> 3. Het genereren van een rAeaDV bouwen door middel van klonen een miRNA of shRNA expressie Cassette in een plasmide Backbone Opmerking: pUCA, een besmettelijke kloon bestaande uit een pUCA plasmide die het genoom van de AaeDV (3,981 nt) 19, werd vriendelijk geleverd door Prof. Jonathan Carlson en is eerder beschreven in detail 11. p7NS1-DsRed spreekt een niet-structurele eiwitten 1 (NS1)-fusieproteïne rood fluorescerende eiwit (DsRed) van de p7 promotor en geweest 14 in detail elders beschreven. Een voorloper van de miR-941-1 mens specifiek 20 en de spons, een gecodeerde shRNA (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), werden ook subcloned in de AaeDV als een negatieve controle.
<ol><li>Het afbinden van de pre-miRNA, spons, shRNA of een cassette amiVTP expressie in de Hpa ik site van de regio AaeDV NS1-codering in de pUCA plasmide ruggengraat zoals beschreven in het protocol stap 2.4 tot en met 2.7.</li>
	<li>Het DNA transformeren in Stbl3 bevoegde E. coli cellen en selecteer een positieve kloon zoals beschreven in stap 2.8 tot en met 2.10.</li>
	<li>De rAaeDV-plasmide hierna, uittreksel uit de bacteriële cellen met behulp van een maxi prep kit na de fabrikant &#39; s instructies. 
	Opmerking: Stbl3 of Stbl4 E. coli cellen moeten worden benut voor rAaeDV DNA transformatie tot een minimum beperken van ongewenste ITR recombinatie. Een maxi prep moet worden gebruikt voor het uitpakken van de plasmide rAaeDV om te verkrijgen van een grote hoeveelheid DNA (&#62; 100 µg). Voordat het virus wordt gegenereerd, moet de integriteit van de volgorde van de plasmide rAaeDV altijd worden geanalyseerd door DNA sequencing 21.</li>
</ol> 4. Transfecting C6/36 cellen met rAaeDV plasmiden <ol><li>cultuur C6/36 cellen in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 opslagmedium met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine in een 28 ° C incubator.</li>
	<li>Plaat cellen in tien 25 cm 2 cultuur kolven op dag 0, 18-20 h voor transfectie door splitsing van 90-95% confluente cellen in een verdunning 1:2. 
	Opmerking: Door dag 1, de cellen moeten bereiken 90-95% samenvloeiing.</li>
	<li>Op dag 1, transfect de cellen met de serie rAaeDV plasmiden 22.
	<ol><li>Verdun 10 µg DNA in 600 µL van RPMI-1640 medium in een microcentrifuge buis en meng voorzichtig. Ondertussen bereiden 600 µL van RPMI-1640 medium en 25 µL van transfectiereagens per transfectie.</li>
		<li>Incubate gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Dan, voeg 625 µL van het mengsel van 1640-transfectiereagens aan het mengsel van 1640-plasmide DNA.</li>
		<li>Broeden dit mengsel voor 20-30 min op RT. Voor transfectie, wassen de cellen tweemaal met 2 mL RPMI-1640 voedingsbodem.</li>
		<li>Na de RT-incubatie (stap 4.3.3), the1640-transfectie reagens DNA plasmide mengsel toevoegen aan op de maatkolf van 25 cm 2 cultuur en incubeer gedurende 6 uur bij 28 ° C.</li>
		<li>Op ongeveer 6 h na transfectie, verwijderen de transfectie media, wassen van de cellen tweemaal met 5 mL RPMI-1640 middellange en voeg vervolgens RPMI-1640 medium met 10% FBS. 
		Opmerking: rAaeDV toont hoge tarieven van de infectie (95%) in Ae. albopictus larven; in onze ervaring, in bijna 50% van de geïnfecteerde larven, de infectie was echter beperkt tot de primaire infectie sites (bijv anale mannetjesvissen en bristle cellen) zonder verspreiding 23. Daarom, als er een noodzaak om te infecteren larven in meerdere weefsels, een defecte recombinante virus uiting van fluorescerende eiwit moet mede besmette om de visualisatie van infectie sites. Bijvoorbeeld voor de productie van defecte recombinante virus uiting van DsRed, p7NS1-DsRed moet worden mede transfected met een plasmide helper in C6/36 cellen volgens de hierboven beschreven procedure (de verhouding van de concentratie cotransfection moet 2:1).</li>
	</ol></li></ol> 5. Oogst rAaeDV virionen van C6/36 cellen Transfected <ol><li>oogst de cellen 5 dagen na de transfectie. Verjagen en opschorten van de cellen in de gerechten door een 5 mL glas Druppelbuisje, pipetting omhoog en omlaag met het kweekmedium. Alle cel schorsingen overbrengen in steriele buizen van 15 mL.</li>
	<li>Bevriezen bij-80 ° C, of in een bad van droogijs/ethanol voor 30 min en vervolgens ontdooien bij 37 ° C. Vortex voor 1 min. Herhaal de procedure freeze-en-dooi 3 keer.</li>
	<li>Centrifugeren van het monster bij 4.800 x g gedurende 20 minuten op 4 °C.Collect het supernatant en gooi de pellet. Vervolgens passeren het supernatant een 0,22 µm wegwerp injectiespuit filter. Aliquot en winkel de laatste gezuiverde virion voorraden op -80 ° C. 
	Opmerking: Voorkomen herhaalde bevriezen-ontdooien cycli.</li>
</ol> 6. Kwantificeren van rAaeDV <ol><li>voorbereiden het DNA normen. Alle rAaeDV plasmiden met Hpa Linearize ik, en zuiveren de verteerd producten met een gel extractie kit 24.</li>
	<li>Bouw van de absolute kwantitatieve standaard curve en meten van de titer van virus volgens de eerder beschreven methoden 25.</li>
</ol> 7. Mosquito transductie <ol><li>Wash 100 1 st instar Ae. albopictus larven driemaal met gedeïoniseerd water, en breng vervolgens de larven in een bekerglas van 95 mL gedeïoniseerd water. Voeg 5 mL van de rAaeDV bestanden (eindconcentratie van 1,00 x 10 10 kopieën/mL).</li>
	<li>Voor 24 h bij 28 ° C, de larven drie keer met gedeïoniseerd water wassen, en vervolgens de larven ook terug overzetten naar de platen uit te broeden en diervoeders regelmatig.</li>
	<li>Toezicht op het niveau van de genexpressie doel in de larven met qPCR of westelijke vlek (vertegenwoordiger van de resultaten worden weergegeven in de figuren 3 en 4). 
	Opmerking: De fluorescentie signaal detectiemethode kan worden gebruikt om te isoleren van de geïnfecteerde larven nauwkeuriger. Bijvoorbeeld, u wilt opsporen fluorescerende signalen van larven besmet met recombinant virus uiting van DsRed, de larven kunnen worden geplaatst op een dia uitholling en waargenomen onder een omgekeerde fluorescentie Microscoop elke 8 h tot en met 2 dagen na infectie. Zodra de fluorescerende larven worden ontdekt, moeten worden gescheiden in afzonderlijke plastic test koppen te maken voor latere punt van voortdurende aandacht. Larven met meerdere weefsels besmet kunnen worden geïdentificeerd met behulp van deze methode.</li>
</ol>

<ol><li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.cppah.com/article/S1538-5442(09)00014-5/fulltext">Mosquito-borne diseases.</a> Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).</li>
<li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).</li>
<li>Roberts, D. R., Andre, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticide+resistance+issues+in+vector-borne+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+tropical+medicine+and+hygiene%22%5BJournal%5D)">Insecticide resistance issues in vector-borne disease control.</a> The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).</li>
<li>Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+risks+on+the+backs+of+the+poor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Balancing risks on the backs of the poor.</a> Nature medicine. 6, 729-731 (2000).</li>
<li>Volohonsky, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Expression+of+the+Anti-parasitic+Factor+TEP1+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS pathogens. 13, 1006113(2017).</li>
<li>Galizi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+sex+ratio+distortion+system+for+the+control+of+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito.</a> Nature communications. 5, 3977(2014).</li>
<li>Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+one+rabbit+out+of+the+hat%3A+Radiation%2C+transgenic+and+symbiont-based+approaches+for+sustainable+management+of+mosquito+and+tsetse+fly+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+tropica%22%5BJournal%5D)">More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations.</a> Acta tropica. 157, 115-130 (2016).</li>
<li>Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvised+microinjection+technique+for+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Indian+journal+of+medical+research%22%5BJournal%5D)">Improvised microinjection technique for mosquito vectors.</a> The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).</li>
<li>Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference-mediated+knockdown+of+a+GATA+factor+reveals+a+link+to+anautogeny+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).</li>
<li>Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+double-stranded+RNA+in+larvae+of+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%3A+implications+for+pest+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+insect+science%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control.</a> Journal of insect science. 13, (Online) 69(2013).</li>
<li>Ward, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+transducing+densovirus+pathogenesis+and+expression+in+Aedes+aegypti+and+Anopheles+gambiae+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae.</a> Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).</li>
<li>Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densoviruses+for+control+and+genetic+manipulation+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+virus+research%22%5BJournal%5D)">Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes.</a> Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).</li>
<li>Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+the+Aedes+albopictus+parvovirus+%28AaPV%29%2C+a+denso-like+virus%2C+for+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+invertebrate+pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes.</a> Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+non-defective+recombinant+densovirus+vectors+for+microRNA+delivery+in+the+invasive+vector+mosquito%2C+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus.</a> Scientific reports. 6, 20979(2016).</li>
<li>Ortega, M. M., Bouamar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+Designing+MicroRNA+Sponges%3A+From+Construction+to+Stable+Cell+Line%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line.</a> Methods in molecular biology. 1509, Clifton, N.J. 221-233 (2017).</li>
<li>BLOCKiT RNAi Designer. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/">http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/</a> (2017).</li>
<li>GE Dharmacon siDesign Center siRNA design tool. , Available from: dharmacon.gelifesciences.com/design-center/ (2017).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e253(2007).</li>
<li>Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densovirus+of+Aedes+aegypti+as+an+expression+vector+in+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+parasitology%22%5BJournal%5D)">Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells.</a> Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).</li>
<li>Hu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+human-specific+microRNA+miR-941%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Evolution of the human-specific microRNA miR-941.</a> Nature communications. 3, 1145(2012).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).</li>
<li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent%3A+primary+neurons%2C+siRNA%2C+and+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).</li>
<li>Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+AeDNA+containing+the+insect-specific+toxin%2C+BmK+IT1%2C+displayed+an+increasing+pathogenicity+on+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+tropical+medicine+and+hygiene%22%5BJournal%5D)">A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus.</a> The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).</li>
<li>Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serious+overestimation+in+quantitative+PCR+by+circular+%28supercoiled%29+plasmid+standard%3A+microalgal+pcna+as+the+model+gene%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene.</a> PloS one. 5, 9545(2010).</li>
<li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rAAV9+to+Overexpress+or+Knockdown+Genes+in+Mouse+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Het is belangrijk om te overwinnen twee van de belangrijkste belemmeringen die de bouw van de rAaeDV beperken. De eerste is de productie van defecte recombinante virussen. Er werd gemeld dat MDV kan worden gebruikt als een vector naar behoren uitspreken buitenlandse genen, zoals scorpion insect-specifieke neurotoxins20 en het GFP-eiwit middelgrote; maar ongeacht de bouw strategie, kunnen niet zodra de ORFs van MDV worden ingevoegd of door exogene genen vervangen, virionen vormen onafhankelijk tenzij een helper plasmide i...

Muggen overgebrachte ziekten zoals malaria, knokkelkoorts, zika koorts en gele koorts, zijn grote internationale volksgezondheidsproblemen die blijven ter verantwoording voor een belangrijke fractie van de mondiale infectieziekte last1,2. Conventionele insecticiden, die in reactie op vectoren zijn gebruikt, zijn een belangrijk onderdeel van duurzame geïntegreerde mug strategie voor toegangsbeheer voor de preventie van muggen overgebrachte ziekten. Echter, dergelijke strategieën hebben bewezen relatief inefficiënt of ongewenste als gevolg van de bijbehorende negatieve milieueffecten, alsmede de ontwikkeling van resistentie bij mug populaties3,4. Om deze redenen is er dringend behoefte aan alternatieve methoden van mug, controle, en het gebruik van transgene methoden voor de productie van steriele mannelijke muggen en de vrijlating van de pathogeen-resistente muggen hebben voorgedaan als veelbelovende nieuwe bestrijdingsstrategieën. Om controle effectieve nieuwe methoden, zoals veilige en effectieve methoden voor in vivo gene levering, de uitgebreide analyse van de genfunctie mug is vereist.
Directe microinjection van plasmide DNA, dubbele stranded RNA (dsRNA) of Klein Mengend RNA (siRNA) is de meest gebruikte in vivo gene leveringsmethode in muggen. In feite, de productie van transgene variëteiten van muggen nog steeds rekenen op een proces van embryo microinjection5,6,7. Microinjection heeft echter verschillende beperkingen. Ten eerste, deze techniek is technisch veeleisende en impliceert ingewikkelde procedures. Ten tweede veroorzaakt injectie een fysieke belediging van het embryo, larven, poppen en volwassen, die rechtstreeks van invloed op de levensvatbaarheid van het doelorganisme. Ten derde is het moeilijk om te immobiliseren muggenlarven voor microinjection, omdat de meeste in een aquatische habitats leven en bezitten een karakteristiek kronkelende beweging. Ten vierde, de grootte van 1st-2nd instar-larven is 10 - aan 20 keer kleiner dan die van 4th instar en oudere larven en de nagelriemen van de voormalige gevoeliger zijn. Deze functies maken het moeilijk om te manipuleren 1st-2nd instar-larven in vergelijking met oudere stadia. Gecombineerd, deze factoren dragen bij aan een verminderde na injectie overlevingspercentage voor larven (ongeveer 5%) in vergelijking met volwassenen8. Viral gebaseerde levering systemen zijn ontwikkeld om de bijbehorende extracellulaire en intracellulaire belemmeringen. Deze systemen hebben de voordelen van gemakkelijke manipulatie, hoge transductie efficiëntie, langdurige en robuuste niveaus van meningsuiting, en het vermogen te produceren permanente effecten in vivo. Daarom gebruikt de gene levering systemen met behulp van de retrovirussen, lentivirussen en adenovirussen wijd zijn inmammalian cellijnen en model soorten. Het Sindbis virale expressie systeem had eerder is gebruikt voor het analyseren van de genfunctie in de volwassen mug; Naast de bioveiligheid zorgen is de injectie echter nog steeds een noodzakelijk proces voor virale infectie9. Hoewel, de mondelinge levering door inweken larven in de dsRNA oplossing is eerder gemeld als een haalbaar leveringsmethode, is het niet geschikt voor kleine RNA functie-analyse10. Effectieve virale afleveringsmethoden moeten dus nog worden ontwikkeld voor muggen.
Mosquito densoviruses (MDVs) behoren tot de onderfamilie Densovirinae van Parvoviridae, en alle maar één vallen onder het geslacht Brevidensovirus11. MDV virionen zijn niet-gehuld en bestaan uit een genoom van single-stranded DNA (ssDNA) en een icosahedrale Eiwitmantel (20 nm diameter). Het virale genoom is ongeveer 4 kb in grootte en wordt gerepliceerd binnen de kernen van cellen van de gastheer. MDVs zijn relatief stabiel in de omgeving en een smalle host bereik weergeven met hoge specificiteit voor muggen. Deze virussen hebben het potentieel om te verspreiden en blijven natuurlijk mug populaties en bijna alle organen en weefsels van deze insecten, met inbegrip van de middendarm, Malpighian tubuli vet lichamelijk, de daaraan gehechte spiermassa, neuronen en speekselklieren12kunnen binnenvallen.
Intact MDV genomen kunnen worden subcloned in plasmide vectoren te produceren plasmide gebaseerde besmettelijke klonen; Wanneer deze klonen worden afgeleverd in cellen van de mug, het virale genoom wordt gewonnen uit de plasmide vector, en besmettelijke virale deeltjes worden geproduceerd. Omdat MDV een kleine ssDNA genoom heeft, besmettelijke klonen zijn gemakkelijk gebouwd en het virale genoom kunnen gemakkelijk gemanipuleerd11,,13. Deze kenmerken maken MDV een waardevolle agent voor de behandeling van de mug biologie. Echter, omdat bijna alle van het virale genoom is essentieel voor de virale proliferatie, het scheppen van recombinante virus door vervanging of toevoeging van buitenlandse genen veroorzaakt een verlies in virale verpakking en/of replicatie capaciteiten, waardoor een belemmering voor de ontwikkeling van MDVs als gene levering vectoren. Hierin, rapporteren we met behulp van een kunstmatige intronic kleine-RNA expressie-strategie te ontwikkelen van een niet-defecte rAaeDV in vivo RNA bezorgingssysteem dat heeft de voordelen van gemakkelijke plasmide constructie en het onderhoud van een functionele virus dat kan produceren stabiele en lange termijn expressie in gastheer cellen zonder de noodzaak voor wild-type virus. Bovendien, zorgt deze methode voor het gemakkelijk transductie van larven.
De protocollen voor de volgende stappen worden beschreven in deze studie: 1) ontwerp van rAaeDVs een intronic kleine-RNA expressie cassette, 2) de productie van recombinante virusdeeltjes de cel C6/36 verpakking te gebruiken codering lijn, 3) kwantitatieve analyse van cel-vrij rAaeDV genoom kopiëren nummers, en 4) infectie van Ae. albopictus larven door directe invoering van virus in het waterlichaam van de larvale habitat. Globaal, dit werk aangetoond dat specifieke kleine RNAs doelgenen kunnen worden overexpressie of neergehaald in met behulp van het ontwikkelde MDV uitvoeringssysteem muggenlarven.

<table><tbody><tr><td>Centrifuge machine</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge System</td><td>Beckman Coulter</td><td>363118</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Gel Extraction Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit</td><td>Omega Biotech</td><td>D6904</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverd Agar</td><td>OXOID</td><td>LP0028A</td><td></td></tr><tr><td>FastAP Thermogevoelige alkalische fosfatase (1 U/&micro;L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest HpaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD1034</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest XbaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0684</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase (5 U/&micro;L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TransStbl3 Chemisch Competente Cel</td><td>Beijing Transgen Biotech</td><td>CD521-01</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin&nbsp;</td><td>Beijing Tiangen Biotech</td><td>RT501</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>MC5008</td><td></td></tr><tr><td>SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)</td><td>Beijing Tiangen Biotech</td><td>FP205</td><td></td></tr></tbody></table>

gebruik van een recombinant mosquito densovirus als een gen levering vector voor de functionele analyse van genen in muggenlarven

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is de meest gebruikte gene transfer techniek voor het analyseren van de functies van de gene in individuele muggen. Echter, deze methode vereist een meer technisch veeleisende operatie en impliceert ingewikkelde procedures, vooral wanneer gebruikt in larven als gevolg van hun geringe omvang, relatief dunne en breekbare cuticula en hoge mortaliteit, die de toepassing ervan te beperken. Daarentegen zijn virale vectoren voor gene levering ontwikkeld om te overwinnen van extracellulaire en intracellulaire belemmeringen. Deze systemen hebben de voordelen van gemakkelijke manipulatie, hoge gene transductie efficiëntie, onderhoud op lange termijn van genexpressie en de mogelijkheid tot blijvende effecten in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) zijn mug-specifieke, kleine single-stranded DNA virussen die effectief buitenlandse nucleic zuren in mug cellen leveren kunnen; de vervanging of het inbrengen van vreemde genen maken recombinante virussen meestal veroorzaakt echter een verlies van de capaciteiten van de verpakking en/of replicatie, die een belemmering voor de ontwikkeling van deze virussen als levering vectoren vormt.
Hierin, rapporteren we met behulp van een kunstmatige intronic kleine-RNA expressie-strategie te ontwikkelen van een niet-defecte recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo uitvoeringssysteem. Gedetailleerde procedures voor de bouw, de verpakking en de kwantitatieve analyse van de vectoren rAaeDV en larvale infectie worden beschreven.
Deze studie toont aan, voor de eerste keer, de haalbaarheid van de ontwikkeling van een niet-defecte recombinante MDV micro RNA (miRNA) expressie systeem, aldus verschaft een krachtig hulpmiddel voor de functionele analyse van genen in de mug en tot oprichting van een basis voor de toepassing van virale paratransgenesis voor het beheersen van muggen overgebrachte ziekten. Wij laten zien dat Aedes albopictus 1st instar-larven worden eenvoudig en effectief besmet kunnen door de introductie van het virus in het waterlichaam van de larven site fokken en dat de ontwikkelde rAaeDVs kan worden gebruikt om overexpress of neerhalen de expressie van een specifiek streefcijfer gen in larven, die een hulpmiddel voor de functionele analyse van muggen genen.

Strategieën voor rAaeDV bouw Een defecte rAaeDV vector werd gegenereerd om uit te drukken van het DsRed-gen in muggenlarven. De resulterende plasmide bevatte een NS1-DsRed fusion protein cassette met de VP eiwit verwijderd(Figuur 1). rAaeDV plasmiden met expressie constructies voor miRNA, zijn spons miRNA, shRNA en amiRNA ontworpen (afgebeeld in Figuur 1B). Bijvoorbeeld, werd ...

Wij rapporteren met behulp van een kunstmatige intronic kleine RNA expressie strategie te ontwikkelen van een niet-defecte recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo uitvoeringssysteem. Een gedetailleerde procedure voor de bouw, de verpakking en de kwantitatieve analyse van de rAaeDV vectoren evenals wat larvale infectie wordt beschreven.

Gebruik van een Recombinant Mosquito Densovirus als een gen levering Vector voor de functionele analyse van genen in muggenlarven

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Het algemene doel van deze procedure is het analyseren van de genfunctie van muggenlarven, waarbij recombinant muggen-densovirus wordt gebruikt voor genoverdracht. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over virale afleversystemen, zoals het overwinnen van de daarmee gepaard gaande extracellulaire en intracellulaire barrières. De belangrijkste voordelen van deze technieken zijn de eenvoudige manipulatie, een hoge transductie-efficiëntie, langdurig en robuust gebruik van expressies, en het vermogen om persistente effecten in vivo teweeg te brengen.Dit werk heeft aangetoond dat specifieke kleine RNA's of doelgenen kunnen worden overgeëxpresseerd of neergeslagen in muggenlarven, met behulp van het ontwikkelde densovirus-afleversysteem. De implicaties van deze techniek breiden de toepassingen van de beschreven expressiestrategie uit om de biologie van muggen te onderzoeken, aangezien deze methode eenvoudige transducties van larven mogelijk maakt. De procedure zal worden gedemonstreerd door Pei-Wen Liu, een promovendus uit ons laboratorium.Begin met het bestellen van de chemische synthese van volledige cDNA-sequenties voor de precursor-miRNA's, miRNA-sponzen en shRN

use-recombinant-mosquito-densovirus-as-gene-delivery-vector-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Omgekeerde genetische benaderingen hebben bewezen zeer nuttig voor het bepalen van welke genen de basis liggen van resistentie tegen pathogenen in vector muggen. Deze video protocol illustreert een methode die wordt gebruikt door de James lab dsRNA injecteren in vrouwelijke A. aegypti muggen die de dengue virus haven. De techniek voor het kalibreren van injectienaalden, het manipuleren van de injectie setup, en het injecteren van dsRNA in de thorax wordt geïllustreerd.

Injectie van dsRNA in Vrouw A. aegypti Mosquitos

Omgekeerde genetische benaderingen hebben bewezen zeer nuttig voor het bepalen van welke genen de basis liggen van resistentie tegen pathogenen in vector muggen. Deze video protocol illustreert een methode die wordt gebruikt door de Dimopoulos lab dsRNA injecteren in Anopheles gambiae muggen die de malariaparasiet haven. De techniek het manipuleren van de injectie installatie en het injecteren van dsRNA in de thorax wordt geïllustreerd.

Protocol voor RNAi Testen in volwassen muggen (A. gambiae)

Oligonucleotiden kunnen worden gebruikt om de website speciaal een single nucleotide van getransfecteerde doelwitgenen vervanger in...

Transfectie en mutagenese van Target genen in cellen Mosquito door Locked Nucleic Acid-gemodificeerde oligonucleotiden

In dit protocol combineren we RNAi-gemedieerde gensilencing...

RNAi-gemedieerde Gene Knockdown en<em&gt; In Vivo</em&gt; Urineproductie Assay in het volwassenenonderwijs Vrouw<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Muggen

Source: Liu, P., et al. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the process of isolating recombinant Aedes aegypti densovirus (rAaeDV) from infected mosquito-derived epithelial cells. The infected cells are collected and exposed to repeated freeze-thaw cycles for lysis. Lysate is centrifuged, and the supernatant containing viral particles is filtered, aliquoted, and...

Harvesting Recombinant Aedes aegypti Densovirus from Infected Cells

Bron: Liu, P., et al. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (2017)Deze video demonstreert het gebruik van recombinante muggendensovirussen die microRNA coderen om specifieke genen in muggenlarven stil te leggen. Geïnfecteerde larven in een vroeg stadium produceren functionele microRNA's die de expressie van doelgenen onderdrukken voor vervolgstudies.

Door recombinant densovirus gemedieerde gen silencing in muggenlarven

In this video, we demonstrate the delivery of gene drive construct into the embryo of Anopheles gambiae mosquito through embryo microinjection technique. This procedure allows for integration of  delivered DNA construct, through homologous recombination, into the germline cells to generate transformed mosquito population.

Mosquito Embryo Microinjection: A Technique to Deliver Exogenous DNA into Embryo Yolk of Anopheles Gambiae to Generate Germline Mutations

Hier beschrijven we een werkwijze voor het remmen van genfunctie in ziektedragers muggen door het gebruik van chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes die worden opgenomen door larven.

Chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes gemedieerde gen silencing in Disease Vector muggenlarven

RNA-interferentie (RNAi) is een uiterst waardevol hulpmiddel voor het onthullen van genfunctie. De mogelijkheid om genen te targeten met behulp van RNAi tijdens pre-adulte stadia is echter beperkt in de belangrijkste menselijke malariavector Anopheles gambiae. We beschrijven een RNAi-protocol om genfunctie te verminderen via directe injectie tijdens de popontwikkeling.

RNAi Trigger delivery in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Poppen

Dit protocol beschrijft een microinjection methodologie die we hebben gestandaardiseerd en gebruikt jarenlang voor bepaalde hoeveelheden van nucleïnezuren rechtstreeks naar de Hemolymfe van muggen en huis vliegt. Dit protocol resulteert in minimale injectie sterfte en laat dosis gecorreleerd metingen van vruchtbaarheid.

Reproduceerbaar dsRNA Microinjection en Oviposition Bioassay in muggen en huis vliegt

Het bipartiete GAL4-UAS systeem is een veelzijdig instrument voor modificatie van genexpressie op een gecontroleerde spatiotemporale manier die functionele genetische analyse in Anopheles gambiae mogelijk maakt. De beschreven procedures voor het gebruik van dit systeem zijn een semi-gestandaardiseerde kloonstrategie, seksing en screening van poppen op fluorescerende eiwitmarkers en embryofixatie.

Gebruik van het GAL4-UAS-systeem voor functionele genetica in Anopheles gambiae

Ontdek een methode voor genfunctie-analyse in muggenlarven met behulp van recombinant Aedes aegypti densovirus als genleveringssysteem. Dit systeem biedt hoge transductie-efficiëntie en langdurige genexpressie in vivo.

Gebruik van een Recombinant Mosquito Densovirus als een gen levering Vector voor de functionele analyse van genen in muggenlarven (Video) | JoVE Journal

Gebruik van een Recombinant Mosquito Densovirus als een gen levering Vector voor de functionele analyse van genen in muggenlarven

Meer video's verkennen