Gebruik van een Recombinant Mosquito Densovirus als een gen levering Vector voor de functionele analyse van genen in muggenlarven

Het algemene doel van deze procedure is het analyseren van de genfunctie van muggenlarven, waarbij recombinant muggen-densovirus wordt gebruikt voor genoverdracht. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over virale afleversystemen, zoals het overwinnen van de daarmee gepaard gaande extracellulaire en intracellulaire barrières. De belangrijkste voordelen van deze technieken zijn de eenvoudige manipulatie, een hoge transductie-efficiëntie, langdurig en robuust gebruik van expressies, en het vermogen om persistente effecten in vivo teweeg te brengen.

Dit werk heeft aangetoond dat specifieke kleine RNA's of doelgenen kunnen worden overgeëxpresseerd of neergeslagen in muggenlarven, met behulp van het ontwikkelde densovirus-afleversysteem. De implicaties van deze techniek breiden de toepassingen van de beschreven expressiestrategie uit om de biologie van muggen te onderzoeken, aangezien deze methode eenvoudige transducties van larven mogelijk maakt. De procedure zal worden gedemonstreerd door Pei-Wen Liu, een promovendus uit ons laboratorium.

Begin met het bestellen van de chemische synthese van volledige cDNA-sequenties voor de precursor-miRNA's, miRNA-sponzen en shRNA, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Nadat het bestelde DNA is ontvangen, worden de buisjes met DNA-blokken gecentrifugeerd om ervoor te zorgen dat al het gedroogde DNA zich onderin de buis bevindt. Resuspendeer het DNA vervolgens in DNase-vrij water om een uiteindelijke concentratie van 10 nanograms per microliter te bereiken.

Voeg zes µL XbaI toe om de plasmidbackbone en cDNA-sequenties te ligeren, en laat de reactie één uur bij 37 °C plaatsvinden. Defosforyleer vervolgens de 5'-uiteinden van de gelineariseerde plasmidbackbone met kalf-intestinale alkalische fosfatase, volgens de instructies van de fabrikant. Voor een efficiënte verpakking mag de genoomgrootte 4.400 nucleotiden niet overschrijden, wat overeenkomt met 110% van de lengte van het wild-type muggen-densovirusgenoom, of er kan een intronische microRNA-expressie van maximaal 400 nucleotiden in het Aedes aegypti-genoom worden geïntroduceerd.

Inactieve vervolgens de alkalische fosfatase door deze te verhitten tot 65 °C. Scheid daarna het DNA vervolgens op een 1% agarosegel en knip de gelstrip met de gelineariseerde backbone uit. Extraheer het DNA uit het gelstuk met een gel-extractiekit, conform de instructies van de fabrikant.

Ligteer na extractie het DNA-fragment in de backbone met behulp van T4 DNA-ligase. Gebruik vervolgens hitte-shock om de producten van de ligatiereactie te transformeren in competente DH5-alpha E.coli cellen. Plaats de getransformeerde bacteriën op een LB-agarplaat die 100 microgram per milliliter ampicilline bevat.

Kies de volgende dag een enkele kolonie van de plaat en maak een startcultuur met drie milliliters verrijkt medium dat 100 microgram per milliliter ampicilline bevat. Extraheer ten slotte het plasmide-DNA uit de bacteriële cultuur met een miniprep-kit, volgens de instructies van de fabrikant. Stuur een monster van het DNA naar een DNA-sequencingbedrijf voor verificatie.

Ligeer pre-miRNA of shRNA in de HpaI-site van de AaeDV NS1-coderende regio in de pUCA-plasmidbackbone, met behulp van de methoden die zijn aangetoond voor de kunstmatige intronische small-RNA-expressiecassette. Transformeer het DNA in Stbl3 competente E.coli-cellen in plaats van DH5-alpha-cellen. Plaats vervolgens de getransformeerde cellen op een LB-agarplaat met 100 micrograms per milliliter ampicilline en maak een startcultuur van een positieve kloon. Extraheer daarna het rAaeDV-plasmid uit de bacteriële cellen met een maxiprep-kit, volgens de instructies van de fabrikant.

Split op dag nul flessen met C6/36-cellen die 90 tot 95% confluent zijn in een verhouding van één op twee over 10 T-25 kweekflessen. Incubeer de flessen 18 tot 20 uur bij 28 °C totdat ze opnieuw een confluentie van 90 tot 95% bereiken.

Transfect op dag één de cellen met de gegenereerde rAaeDV-plasmiden. Om dit te bereiken, wordt 10 micrograms DNA verdund in 600 microliters RPMI-1640-medium en wordt de oplossing voorzichtig gemengd. Bereid ondertussen 600 microliters RPMI-1640-medium en 25 microliters transfectiereagens per transfectie voor.

Incubeer de cellen met het DNA gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 625 microliters van het RPMI-1640 transfectiereagensmengsel toe aan het plasmid DNA-mengsel en incubeer dit mengsel gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Was na incubatie de cellen twee keer met RPMI-1640 medium en voeg vervolgens het transfectiemengsel toe aan elke T-25 kweekfles.

Incubeer de cellen in het transfectiemengsel gedurende zes uur bij 28 °C. Verwijder na zes uur het transfectiemedium, was de cellen twee keer met vijf milliliter RPMI-1640 medium en voeg vervolgens vers RPMI-1640 medium toe dat 10% FBS bevat. Vijf dagen na transfectie worden de cellen in de schaaltjes losgemaakt en gesuspendeerd door met een glazen pipet van vijf milliliter het kweekmedium herhaaldelijk op en neer te pipetteren.

Breng de celsuspensies uit elke kolf over naar een eigen steriele buis van 50 milliliter. Om een virus met een hoge drempelafhankelijkheid te oogsten, is het noodzakelijk om de cellen vijf dagen na transfectie in stand te houden. Vries de afzonderlijke buizen in bij -80 °C of in een bad van droogijs en ethanol gedurende 30 minuten.

Ontdooi deze vervolgens snel bij 37 °C en vortex de celsuspensie gedurende één minuut. Verzamel daarna het supernatant van het gecentrifugeerde monster en discard het pellet. Leid het supernatant vervolgens door een wegwerpspuitfilter van 0,22 µm.

Portioneer en bewaar de uiteindelijke gezuiverde virionvoorraden bij -80 °C. Was 100 eerste-instar A. albopictus larven drie keer met gedemineraliseerd water. Breng de larven vervolgens over in een bekerglas met 95 milliliter gedemineraliseerd water.

Voeg vijf milliliter van de rAaeDV-stocks toe en incubeer de larven gedurende 24 uur bij 28 °C. Voor een succesvolle infectie van de larven is het essentieel dat zij 24 tot 36 uur worden blootgesteld aan de infectieuze viruspartikels om hoge infectieratio's te garanderen. Was de larven na de incubatie drie keer met gedeïoniseerd water en breng de larven vervolgens terug naar de platen. Voer de larven regelmatig. Monitor de expressieniveaus van het doelgen in de larven met behulp van kwantitatieve PCR of western blot via standaardtechnieken.

In dit voorbeeld werden 100 larven in het eerste stadium geanalyseerd op hun endogene miRNA-expressie na infectie met het recombinante virus dat de aal-let-7 expressiecassette bevat die overexpressie vertoont.

De efficiëntie van het anti-let-7 construct wordt rechts getoond, waarbij de knockdown-capaciteiten worden benadrukt. Om de knockdown-efficiëntie van het V-ATPase mRNA door de rAaeDV-vectoren te monitoren, werden in totaal 100 larven in het eerste stadium behandeld met gelijke hoeveelheden rAaeDV van verschillende typen door het virus toe te voegen aan het water van het larvenhabitat. De V-ATPase mRNA-niveaus werden aanzienlijk verlaagd door een miRNA-expresserende rAaeDV en door een intronische shRNA-expresserende rAaeDV.

Onze resultaten valideren een intronische expressiestrategie die een nieuw paradigma biedt, waarmee de beperkingen van muggen-densovirussen met een defect genoom kunnen worden overwonnen om een efficiënte aflevering van vreemde genen in muggen mogelijk te maken. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een intronische microRNA-expressiecassette van maximaal 400 nt in het genoom van het Aedes aegypti densovirus kan worden ingevoegd. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoek naar de productie van niet-defecte recombinante muggen-densovirussen die microRNA's en de doelgenen kunnen overexpresseren of downreguleren om functionele analyses van muggengenen uit te voeren.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe het ontwikkelde afleversysteem voor het muggen-densovirus kan worden gebruikt om genfuncties in muggenlarven te analyseren.