Name: Behoud van Aedes aegypti muggen geïnfecteerd met Wolbachia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Leer het kweken van Aedes aegypti muggen met Wolbachia-infectie voor vectorbiologie en ziektebestrijding. Dit protocol ondersteunt onderzoek naar populatiebeheersing en virusoverdrachtsuppressie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij erkennen Heng Lin Yeap, Chris Paton Petrina Johnson en Clare Doig voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van onze kolonie onderhoud methoden en drie Anoniem reviewers voor hun suggesties die bijgedragen aan een verbetering van het manuscript. Ons onderzoek wordt ondersteund door een programma grant en de fellowship te AAH van de National Health en Medical Research Council en een vertaling van de Wellcome Trust verlenen. PAR is een ontvanger van een Australische regering onderzoek opleiding programma beurs.

Bloed voederen van muggen op menselijke proefpersonen werd goedgekeurd door de Universiteit van Melbourne menselijke ethische Commissie (goedkeuring #: 0723847). Alle vrijwilligers die op de hoogte gesteld schriftelijke toestemming.
1. de larvale fokken
Opmerking: Muggen worden gehouden op 26 ± 0,5 ° C en 50-70% relatieve vochtigheid, met een 12:12 h (licht: donker) fotoperiode voor dit onderhoudsprotocol kolonie. Deze voorwaarden zijn vergelijkbaar met de gemiddelde klimatologische omstandigheden in Cairns, Australië en binnen de optimale thermische bereik voor Ae. aegypti overleving en ontwikkeling44,45,46. Hoge temperaturen kunnen resulteren in het verlies van Wolbachia infecties van mug kolonies en moeten vermeden47. Wij behouden ten minste 500 exemplaren per bevolking om te minimaliseren van inteelt; behoud van kolonies van een kleinere omvang kan fitness gevolgen [Ross et al. ongepubliceerde] hebben. Onder deze omstandigheden en uitgaande adequate voeding is de gemiddelde generatietijd 28 dagen (Zie tabel 1).
<ol><li>Onderdompelen van de eieren op substraat in bakjes (figuur 1A) met 3 L water (omgekeerde osmosewater of leeftijd leidingwater, gegenereerd door het verlaten van leidingwater in bakjes voor 24 h vóór gebruik), ~ 300 mg visvoer (een geplet tablet, Zie Tabel van materialen) en een enkele korrels voor actieve droge gist voor het opwekken van broedeieren48.</li>
	<li>Een dag na het uitkomen, kunt een glazen pipet ongeveer 500 larven overbrengen in bakjes met 4 L water (figuur 1B), rekenen met behulp van een clicker counter. Twee gemalen vis eten tabletten toevoegen aan elke lade. Indien nodig, gebruik van containers van verschillende maten voor het opfokken van larven (figuur 1A), maar houden van larvale dichtheden lager dan 0.5 larven/mL om te voorkomen dat overbevolking.</li>
	<li>Dagelijks de schaaltjes controleren om ervoor te zorgen dat de larven voldoende voedsel; om de twee dagen ongeveer twee tabletten van voedsel aan de schaaltjes toevoegen. Verstrekken van voedsel ad libitum maar zorgen dat 0,5 mg/larve/dag is beschikbaar gedurende deze periode om ontwikkeling is synchroon en lichaam grootte strookt, anders kunnen de resultaten van experimenten worden verward (Zie vertegenwoordiger resultaten).</li>
	<li>Zorg om te voorkomen dat het overfeeding van larven, met name in kleinere steigerend containers met minder water oppervlakte en volume. Als het water ziet er troebel of als er belangrijke larvale sterfte, vervangt het door vers water; sterfte moet te verwaarlozen als larven zijn optimaal gevoed.</li>
</ol>2. erotische opkomst
Opmerking: Larven zullen beginnen te verpoppen vanaf vijf dagen na het uitkomen als goed gevoed en de meerderheid moet verpoppen door zeven dagen na het uitkomen. Volwassenen zal beginnen ongeveer twee dagen na verpopt opkomende als optimaal op 26 ° C gehouden (Zie Vertegenwoordiger resultaten). Larvale ontwikkeling wordt meestal beïnvloed door Wolbachia infecties als voldoende voedsel beschikbaar is23,39,49.
<ol><li>Zeven dagen na het uitkomen giet de hele inhoud van de lade door een fijn gaas (porie-grootte 0,4 mm). Houd de larvale gefilterd water voor later gebruik in ovicups (zie "Bloed voeden en Oviposition" sectie). Omkeren van de Maas en dompel het in een plastic container met 200 mL water over te dragen van de poppen. Zorgen voor extra voedsel als larven blijven.</li>
	<li>De volwassen opkomst kooien (Figuur 1 c) voor te bereiden door middel van twee kopjes 10% sacharoseoplossing (figuur 1F) en twee kopjes vochtige watten ter voorkoming van uitdroging (figuur 1E).</li>
	<li>Als de poppen niet hoeft te worden gesorteerd op geslacht, plaats de hardplastic containers van poppen in de kooi en laat het deksel licht kier om de volwassenen te ontstaan in de kooi. U kunt ook plaats een omgekeerde trechter over de container om te minimaliseren van verdrinking. Zorgen dat alle volwassenen zijn ontstaan voordat u de container verwijdert uit de kooi om te voorkomen dat tegen trage ontwikkelaars selecteren.</li>
</ol>3. pop Sexing voor kruising
<ol><li>Als de poppen hoeft te worden gesorteerd op seks (bijvoorbeeldvoor outcross), de poppen vanuit larvale lade Pipetteer en scheiden de geslachten (Figuur 2) in kunststof containers (figuur 1A) met 200 mL water elke 24 h tot het gewenste aantal van elk geslacht is bereikt. Plaats van deksels op de recipiënten en laat hen gesloten.</li>
	<li>Volwassenen zal ontstaan in de containers; bevestigen hun geslacht voordat het vrijgeven van in kooien (figuur 2C). Verwijder alle volwassenen sexed ten onrechte met een aspirator binnen de 24u van opkomst voordat ze geslachtsrijp. Zodra de seksen hebben bevestigd, laat de volwassenen in kooien elke 24 h.</li>
	<li>
Verkrijgen van Wolbachia-besmette kolonies van een vergelijkbare genetische achtergrond op een natuurlijke populatie, genenoverdracht door toe te voegen Wolbachia-besmet vrouwtjes uit laboratorium koloniën te kooien van niet geïnfecteerde mannen afgeleid van eieren die zijn verzameld door ovitraps in het veld39, behoud van de voorgeschreven dichtheid van 500 exemplaren per bevolking.
	<ol>
<li>Herhaal de outcross voor ten minste drie opeenvolgende generaties tot kolonies die ten minste 87,5% genetisch vergelijkbaar aan de veld bevolking39. Kritische: Ervoor zorgen dat de seksen correct in dit stadium zijn (zie stap 3.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vrouwelijke Ae. aegypti zijn meestal vuurvaste aan verdere inseminatie binnen enkele uren na de paring50. Als outcross kolonies, kunnen de vrouwtjes en de mannetjes om te rijpen in aparte kooien voor twee dagen en dan de vrouwtjes in de mannelijke kooi gecombineerd om een gelijke kans voor alle mannetjes.</li>
</ol>4. bloed voeden en Oviposition
<ol><li>
Wacht ten minste drie dagen nadat het laatste vrouwtje gekomen voordat bloed voeding zodat u voldoende tijd om te rijpen. Bloed voeden de vrouwtjes binnen twee weken na opkomst om te voorkomen dat buitensporige sterfte, met name voor muggen met Wolbachia infecties die levensduur22,24,49nadelig te beïnvloeden. Verwijder de kopjes suiker de dag voorafgaand aan voeding ter verbetering van de voeding tarieven.
	<ol>
<li>Vraag een vrijwilliger hun onderarm invoegen in de kooi om de vrouwelijke muggen te voeden. De meeste vrouwtjes moeten voeden naar herverpakking binnen 5 min, maar om selectie tegen trage feeders, laat de onderarm in de kooi gedurende 15 minuten of totdat alle vrouwtjes zijn zichtbaar overvuld; een latex handschoen ter bescherming van de hand van beten is optioneel maar aanbevolen.</li>
		<li>Twee dagen na het voederen van bloed, plaats twee plastic bekers waarin larvale steigerend water en bekleed met een strook van schuurpapier (figuur 1G) (of filtreerpapier (Figuur 1 H)) in de kooi voor vrouwen om eieren te leggen. Gedeeltelijk dompelen de schuurpapier-strip in het water het om vochtig te houden. Verwijder andere bronnen van water om te voorkomen dat de vrouwtjes hun eieren te leggen buiten de oviposition cup. Opmerking: leidingwater kan worden gebruikt in de cups, maar water larvale-fokken moedigt oviposition51,52 en vrouwtjes zullen leggen hun eieren meer synchroon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. de eicelpunctie en conditionering
<ol><li>De vrouwtjes zal eieren leggen op het schuurpapier net boven de waterlijn; verzamelen en vervang de stroken schuurpapier dagelijks totdat er geen meer eieren worden gelegd. Merk op dat oviposition kan blijven voor maximaal een week.</li>
	<li>Gedeeltelijk droog het schuurpapier stroken door blotting hen zachtjes op een papieren handdoek voor 30 s, verzorgen niet te verjagen van de eieren. Vervolgens wikkel de strips in een blad van droog papieren handdoek en leg deze in een afsluitbare plastic zak (figuur 1I).</li>
	<li>Controleer de toestand van de eieren onder een ontleden Microscoop (Figuur 3). Als het schuurpapier stroken zijn te nat, eitjes kan voordat het wordt ondergedompeld in water (figuur 3B), maar als gedroogd te hard, eieren afglijdt (Figuur 3 c).</li>
	<li>De eieren kunnen worden geleverd op elk gewenst moment na drie dagen na collectie; alle eieren uit elke kolonie, verzameld over alle dagen, in dezelfde container van water om ervoor te zorgen dat de volgende generatie van een grote, random pool van individuen wordt bemonsterd uitkomen.</li>
	<li>Voor langdurige opslag, houden de eieren in een verzegelde container op een hoog (> 80%) luchtvochtigheid rond de 20 ° C. Onder deze omstandigheden kunnen de eieren zonder Wolbachia maandenlang met behoud van hoge hatch tarieven53,54worden opgeslagen.</li>
	<li>Zoals sommige Wolbachia infecties sterk de levensvatbaarheid van de eieren met leeftijd49,55 verminderen, komen de eieren uit Wolbachia-besmet lijnen binnen een week na collectie om te voorkomen dat buitensporige sterfte voor de relevante stammen. Bloed voeden de vrouwtjes weer na één week als meer eieren nodig zijn.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Dag</td>
			<td colspan="3">Stap</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td colspan="3">Hatch eieren</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">Aantal larven in trays</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="3">Larven en poppen overbrengen naar de kolonie kooien</td>
		</tr>
<tr>
<td>17</td>
			<td colspan="3">Bloed voeden vrouwelijke volwassenen</td>
		</tr>
<tr>
<td>21</td>
			<td colspan="3">Beginnen met het verzamelen van eieren</td>
		</tr>
<tr>
<td>25</td>
			<td colspan="3">Afwerking, verzamelen van eieren</td>
		</tr>
<tr>
<td>28</td>
			<td colspan="3">Hatch eieren</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Overzicht van het onderhoudsschema van de kolonie Ae. aegypti op 26 ° C. De timing van de vrouwelijke bloed-voeding en het uitbroeden van de eieren is flexibel, maar de lange duur in deze fasen moeten worden vermeden, met name voor muggen geïnfecteerd met Wolbachia, om te minimaliseren van sterfte. Na dit schema minimaliseert selectie tegen muggen die snel of langzaam te ontwikkelen of oudere in alle levensstadia, mits de larven zijn optimaal gevoed.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig1.jpg"> Figuur 1: Apparatuur die wordt gebruikt voor het opfokken van Ae. aegypti in het laboratorium. (A) Plastic recipiënten die worden gebruikt voor broedeieren of fokken larven met volumes van 500, 750 en 5.000 mL (van links naar rechts). (B)-vak gebruikt voor het opfokken van larven bij een gecontroleerde dichtheid, gewoonlijk 500 larven in 4 L water. (C) 19,7 L en (D) 3 L kooien gebruikt voor huisvesting volwassenen. Een dichtheid van 25 volwassenen of minder per liter moet worden gehandhaafd om te bieden voldoende ruimte. (E) 35 mL beker met vochtige watten geleverd als een bron van water voor volwassenen. (F) 35 mL beker met sacharoseoplossing geboden door middel van een koord of tandheelkundige wick als een bron van suiker. (G-H) Bekers gevuld met larvale steigerend water en bekleed met een oviposition substraat van schuurpapier of filtreerpapier (G en H, respectievelijk). (ik) Zip-lock zak gebruikt voor opslag van schuurpapier stroken of filtreerpapier. Zwarte vlekken op schuurpapier zijn mug eieren. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig2.jpg"> Figuur 2: Laterale (A) en dorsale (B) uitzicht op poppen en volwassen Ae. aegypti (C) aan te tonen hun seksueel dimorfisme. Mannetjes zijn geplaatst aan de linkerzijde en de vrouwtjes aan de rechterkant in elk deelvenster. Wanneer optimaal gevoed, mannelijke en vrouwelijke poppen onderscheiden zich door grootte; vrouwtjes worden groter dan mannetjes (A) en hebben een relatief bolvormige kopborststuk in vergelijking met mannen hebben platter zijden (B). Mannelijke volwassenen zijn gemakkelijk onderscheiden van de vrouwtjes onder alle steigerend omstandigheden, vooral door hun plumose antennes en lange ook. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig3.jpg"> Figuur 3. Vier dagen oude Ae. aegypti eieren onder verschillende omstandigheden. (A) Intact eieren op schuurpapier stroken gehandhaafd op een hoog (> 80%) luchtvochtigheid, maar zonder zichtbaar vocht. Hatch tarieven moet boven 90% voor wild-type Ae. aegypti als goed onderhouden. (B) eieren, die uitkomen voor wordt ondergedompeld in water (vroegrijp broedeieren) worden gekenmerkt door een vrijstaande ei GLB en zichtbaar larve. Dit geeft aan dat de strip schuurpapier te vochtige werd gehouden. (C) eieren die zijn gedroogd te hard afglijdt, en door hun holle verschijning duidelijk zichtbaar zijn. Als het schuurpapier stijf wordt betekent dit ook dat de eieren mogelijk te droog. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Volgens het protocol hier gepresenteerd voor het onderhoud van Wolbachia-besmette Ae. aegypti moeten ervoor zorgen dat gezonde muggen van een constante kwaliteit worden geproduceerd voor experimenten en veld releases open. In tegenstelling tot andere protocollen die het prioriteren van de productie van massale hoeveelheden muggen (zie referentie57), zijn de methoden gericht op het maximaliseren van hun fitness, zowel binnen de generaties door ontspannen steigerend uitvoeringsvoor...

Aedes aegypti muggen zijn verantwoordelijk voor het overbrengen van enkele van de belangrijkste arboviruses in de wereld, met inbegrip van Zika, dengue en chikungunya1. Deze virussen worden een steeds ernstiger bedreiging vormt voor de gezondheid van de mondiale zoals de wijdverspreide distributie van Ae. aegypti in de tropen blijft uitbreiden van2,3,4. Vrouwelijke Ae. aegypti netcongestieproblemen voeden met menselijk bloed5 en dus de neiging om te leven dicht bij de mens, met name in stedelijke gebieden waar populaties dichtste zijn. Door deze nauwe samenwerking met de mens hebben ze ook aangepast om te broeden in kunstmatige habitat, inclusief banden, potten, dakgoten en water tanks6,7. AE. aegypti ook gemakkelijk aan te passen aan laboratorium omgevingen waar zij kunnen worden gehandhaafd zonder speciale eisen na wordt verzameld rechtstreeks uit het veld, in tegenstelling tot sommige andere soorten in de Aedes geslacht8, 9,10. Hun gemak van onderhoud ze wijd studeerde in het laboratorium in een brede waaier van velden heeft gezien, uiteindelijk gericht op het bepalen van de ziekten muggen kan doorgeven.
Traditioneel, afhankelijk arboviral controle sterk van het gebruik van insecticiden te verminderen mug populaties. Echter, er is steeds meer belangstelling in benaderingen waar gemodificeerde muggen zijn gekweekt in het laboratorium en vervolgens vrijgelaten in natuurlijke populaties. Vrijgegeven muggen kunnen genetisch gewijzigd worden11,12,13, biologisch14,15, door middel van bestraling16, chemische behandeling17,18, of met gecombineerde technieken19 onderdrukken van de bevolking van muggen of vervang ze door muggen die vuurvaste arboviral transmissie20.
Wolbachia zijn bacteriën die momenteel worden gebruikt als een agent van de biologische bestrijding voor arboviruses. Verschillende stammen van Wolbachia werden onlangs binnengebracht Ae. aegypti experimenteel met behulp van embryonale microinjection21,22,23,24. Deze stammen verminderen de capaciteit van de arboviruses te verspreiden en te repliceren in de mug, het afnemen van hun transmissie potentiële23,25,26,27,28 . Wolbachia infecties worden doorgegeven van moeder aan nakomelingen, maar bepaalde spanningen steriliteit induceren wanneer geïnfecteerde mannen met niet geïnfecteerde vrouwen22 paren. Wolbachia-geïnfecteerde mannen kunnen daarom worden vrijgegeven in grote hoeveelheden natuurlijke mug populaties, zoals onlangs is aangetoond in andere Aedes -soorten15,29te onderdrukken. Nochtans, aangezien Wolbachia ook remmen arboviral transmissie in Ae. aegypti, muggen kunnen ook worden vrijgegeven ter vervanging van de inheemse bevolking met armere vectoren. Ae. aegypti experimenteel geïnfecteerd met Wolbachia worden nu vrijgegeven in het veld in verschillende landen met behulp van deze laatste benadering14,30,31.
Wolbachia-gebaseerde benaderingen voor arboviral besturingselement afhankelijk van een goed begrip van de interacties tussen Wolbachia, de mug en het milieu. Wolbachia van nature in een breed scala van insecten, en de stammen binnengebracht muggen zijn divers in hun effecten32. Als nieuwe Wolbachia infectie typen in Ae. aegypti24worden binnengebracht, is het noodzakelijk te karakteriseren van elke stam voor hun effecten op de mug fitness, voortplanting en arboviral storing onder een aantal voorwaarden. Strenge experimenten in het laboratorium is dus vereist voor het beoordelen van het potentieel voor Wolbachia stammen om te slagen in het veld.
Open veld releases van Ae. aegypti met Wolbachia infecties kunnen vereisen vaak duizenden tot tienduizenden muggen per release zone worden gehouden elke week14,30,31. Het succes van de eerste releases kan worden verbeterd door het vrijgeven van muggen van een groot formaat om hun vruchtbaarheid33 en paring succes34,35te maximaliseren. Muggen moeten ook worden aangepast aan de omstandigheden die ze in het veld beleeft, maar op lange termijn laboratorium fokken kan er wijzigingen optreden in gedrag en fysiologie die veld prestaties36,37beïnvloeden kon, 38.
Beschrijven we een eenvoudig protocol voor het opfokken van Ae. aegypti in het laboratorium met behulp van basisuitrusting. Dit protocol is geschikt voor zowel wild-type en Wolbachia-besmette muggen, de laatste speciale aandacht vereisen kan omdat sommige Wolbachia spanningen aanzienlijke gevolgen voor de mug levensgeschiedenis traits39, hebben 40. de steigerend voorwaarden voorkomen dat overbevolking en concurrentie voor voedsel te produceren muggen met een consistent formaat, die essentieel is voor de vector competentie en fitness experimenten en zorgt ervoor dat de muggen gezond voor veld release41 zijn . Wij ook voorzorgsmaatregelen te nemen om laboratorium aanpassing en inteelt te minimaliseren door selectieve druk te verminderen en ervoor te zorgen dat de volgende generatie is gesampled uit een grote, random pool. Laboratorium omgevingen zijn duidelijk verschilt van veldomstandigheden echter, en op lange termijn onderhoud ontspannen omstandigheden kan verminderen de geschiktheid van muggen op introductie in het veld37,42,43 . Daarom steken wij vrouwtjes uit laboratorium lijnen voor veld-verzameld mannetjes regelmatig, wat resulteert in kolonies die genetisch vergelijkbaar voor experimentele vergelijkingen en die zijn aangepast aan de doelgroep veld bevolking39. De methoden vereisen geen speciale apparatuur en kunnen worden opgeschaald tot achterzijde tientallen van duizenden personen per week voor veld releases. Het protocol wordt ook de geschiktheid van muggen binnen en tussen generaties, een belangrijke overweging voor insecten die bestemd zijn voor de inrichting in natuurlijke populaties prioriteit. Het protocol is geschikt voor de meeste laboratoria die vereisen onderhoud van Ae. aegypti, met name voor experimentele vergelijkingen waar een consistente kwaliteit van muggen en relatability naar het veld zijn belangrijk.

<table><tbody><tr><td>Wild type Aedes aegypti</td><td></td><td></td><td>Verzameld van veldlocaties in Queensland, Australië, zie Yeap en anderen39 voor details</td></tr><tr><td>w Mel-geïnfecteerde Aedes aegypti</td><td></td><td></td><td>Verstrekt door Monash University. Zie Walker en anderen23 voor informatie over de stam</td></tr><tr><td>w AlbB-geïnfecteerde Aedes aegypti</td><td></td><td></td><td>Verstrekt door Monash University. Zie Xi en anderen21 voor informatie over de stam</td></tr><tr><td>w MelPop-geïnfecteerde Aedes aegypti</td><td></td><td></td><td>Verstrekt door Monash University. Zie McMeniman en anderen22 voor informatie over de stam</td></tr><tr><td>Instant gedroogde gist</td><td>Lowan</td><td></td><td>Stimuleert het uitkomen van eitjes. Te vinden in supermarkten. Andere merken kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>5 L plastic kuip</td><td>Quadrant</td><td>Q110950</td><td>Gebruikt voor het uitkomen en grootbrengen van larven. Andere producten kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Visvoer (Tetramin Tropical Tablets)</td><td>Tetra</td><td>16152</td><td>Wordt aan larven gegeven als voedselbron. Webadres: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE</td></tr><tr><td>Kunststof containers</td><td></td><td></td><td>Gebruikt voor het grootbrengen van larven. Elke kunststof container van meer dan 500 ml zou geschikt moeten zijn</td></tr><tr><td>Glazen pipette</td><td></td><td></td><td>Gebruikt voor het overbrengen van larven en poppen tussen containers. Webadres: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez</td></tr><tr><td>Clickerteller</td><td>RS Pro</td><td>710-5212</td><td>Gebruikt om te helpen bij het tellen van larven, poppen en eitjes. Webadres: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y</td></tr><tr><td>Kweekbakken</td><td>Gratnells</td><td></td><td>Gebruikt voor het grootbrengen van larven. Webadres: http://www.gratnells.com</td></tr><tr><td>Nylon gaas</td><td></td><td></td><td>Gebruikt om larven en poppen over te brengen naar containers met vers water. Andere merken kunnen worden gebruikt. Webadres: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white</td></tr><tr><td>Kerften</td><td>BugDorm</td><td>DP1000</td><td>Huisvest volwassen muggen. Alternatieve producten kunnen worden gebruikt. Webadres: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html</td></tr><tr><td>35 mL plastic beker</td><td>Huhtamaki</td><td>AA272225</td><td>Gebruikt om water of sucrose te geven aan volwassen muggen. Andere merken kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>35 mL plastic bekerdeksel</td><td>Huhtamaki</td><td>GB030005</td><td>Gebruikt om sucrose te geven aan volwassen muggen. Andere merken kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Wattenwol</td><td>Cutisoft</td><td>71841-13</td><td>Vochtige wattenwol wordt gegeven als waterbron voor volwassenen. Andere merken kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Witte suiker</td><td></td><td></td><td>Wordt gegeven als suikerbron voor volwassen muggen. Te vinden in supermarkten</td></tr><tr><td>Touw</td><td>M Recht Accessoires</td><td>C323C/W</td><td>Gebruikt om sucrose-oplossing te geven aan volwassenen. Andere merken kunnen worden gebruikt. Webadres: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/</td></tr><tr><td>Kunststof beker (groot)</td><td></td><td></td><td>Gebruikt als een eierlegbakje. Elke kunststof beker die 100 ml water kan bevatten, zou geschikt moeten zijn</td></tr><tr><td>Schuurpapier</td><td>Norton Master Painters</td><td>CE015962</td><td>Wordt gegeven als eierlegsubstraat. Alternatieve producten kunnen worden gebruikt, maar we gebruiken dit merk omdat het relatief geurloos is. Lichtere kleuren worden gebruikt voor contrast met eieren. Webadres: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Whatman</td><td>1001-150</td><td>Gebruikt als alternatief eierlegsubstraat. Andere merken kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Latex handschoenen</td><td>SemperGuard</td><td>Z560979</td><td>Voorkomt muggenbeten op handen tijdens bloedvoeding. Andere merken kunnen worden gebruikt. Webadres: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/</td></tr></tbody></table>

behoud van aedes aegypti muggen geïnfecteerd met wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti muggen experimenteel geïnfecteerd met Wolbachia zijn in de verspreiding van arboviruses zoals dengue en chikungunya Zika-programma's wordt gebruikt. Wolbachia-geïnfecteerde muggen kunnen worden vrijgegeven in het veld te ofwel verminderen bevolking maten door incompatibele verparingen of te transformeren van populaties met muggen die vuurvaste tot overdracht van het virus. Deze strategieën om te slagen, moeten de muggen vrijkomen in het veld van het laboratorium kunnen concurreren met inheemse muggen. Echter, behoud van de muggen in het laboratorium kan leiden tot inteelt en genetische drift laboratorium aanpassing die kan verminderen hun fitness in het veld en de resultaten van experimenten kan verwarren. Om te testen de geschiktheid van verschillende Wolbachia infecties voor implementatie in het veld, is het noodzakelijk om muggen in een gecontroleerde laboratoriumomgeving over meerdere generaties. Beschrijven we een eenvoudig protocol voor het handhaven van Ae. aegypti muggen in het laboratorium, geschikt voor beide Wolbachia is-besmette en wild-type muggen. De methoden minimaliseren laboratorium aanpassing en uitvoering outcross te verhogen van de relevantie van de experimenten aan veld muggen. Bovendien worden kolonies bijgehouden onder optimale omstandigheden te maximaliseren hun geschiktheid voor open veld releases.

Figuur 4 toont de gevolgen van suboptimaal voeding voor de ontwikkeling van het larven Ae. aegypti . Wanneer containers beschikbaar met 0,25 mg voedsel per larve per dag of minder, de ontwikkeltijd verhoogt voor zowel mannen als vrouwen, en is minder synchrone dan in recipiënten voorzien van 0.5 mg van voedsel. Als voldoende voedsel niet gedurende de looptijd van larvale ontwikkeling wordt geleverd, kan dit een negatief effect hebben op het onderhoud...

Aedes aegypti muggen geïnfecteerd met Wolbachia worden vrijgegeven in natuurlijke populaties te onderdrukken van de overdracht van arboviruses. We worden methoden beschreven aan achterzijde Ae. aegypti met Wolbachia infecties in het laboratorium voor experimenten en veld release, voorzorgsmaatregelen nemen om laboratorium aanpassing en selectie te minimaliseren.

Behoud van Aedes aegypti muggen geïnfecteerd met Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Het algemene doel van dit protocol is om het onderhoud van Aedes aegypti-muggen die zijn geïnfecteerd met Wolbachia te beschrijven. Deze muggen worden wereldwijd uitgezet om de transmissie van dengue en andere virussen te onderdrukken. Ons protocol voor het fokken van Aedes aegypti-muggen kan worden gebruikt door alle onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het gebruik van muggen voor experimenten of programma's ter bestrijding van ziekten.Deze methode kan ook worden gebruikt voor het fokken van genetisch gemodificeerde muggen voor programma's ter beheersing van muggenpopulaties, inclusief programma's waarbij gebruik wordt gemaakt van het uitzetten van steriele insecten. De principes van deze aanpak kunnen ook worden toegepast op het fokken van andere ziektevectorsoorten. Huisvest de muggen voor dit protocol bij ongeveer 26 °C en een relatieve luchtvochtigheid van 50 tot 70% met een equatoriale fotoperiode.Als ze bij hogere temperaturen worden gekweekt, kunnen de Wolbachia-infecties verloren gaan, dus oververhit de kolonies niet. Houd ongeveer 500 muggen per populatie aan om inteelt te minimaliseren. Het gebruik van dit protocol met adequate voeding zal resulteren in generaties van

maintaining-aedes-aegypti-mosquitoes-infected-with-wolbachia

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video beschrijft een methode voor het zuiveren van Wolbachia pipientis van een Anopheles gambiae cellijn en vervolgens het kweken van de endosymbiont in cel-vrij medium. Een test voor de levensvatbaarheid van de bacterie is aangetoond.

Behoud van Wolbachia in Cell-vrij medium

Om populatieonderdrukking van Aedes aegypti te bereiken met behulp van het RIDL® (Release of Insects carrying a Dominant Lethal) systeem, moeten grote aantallen mannelijke muggen worden vrijgelaten. Dit vereist het gebruik van massaopfoktechnieken en -technologie om betrouwbare systemen te bieden om het maximale aantal mannelijke muggen van hoge kwaliteit te verkrijgen.

Massaproductie van genetisch gemodificeerde Aedes aegypti voor veldreleases in Brazilië

Het gepresenteerde protocol kan de vectorcompetentie van Aedes aegypti-muggenpopulaties voor een bepaald virus, zoals Zika, in een containmentomgeving bepalen.

Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus

Beschreven is een tijd- en ruimtebesparende methode om eieren te tellen en de broedsnelheden van individuele muggen te bepalen met behulp van 24 putweefselkweekplaten, die de schaal en snelheid van vruchtbaarheids- en vruchtbaarheidstesten aanzienlijk kunnen verhogen.

Verbeterde vruchtbaarheid en vruchtbaarheidstest voor Aedes aegypti met behulp van 24 well tissue kweekplaten (EAgaL-platen)

Dit protocol beschrijft micro-injectieprocedures voor Culex quinquefasciatus embryo's die zijn geoptimaliseerd om te werken met CRISPR/Cas9 genbewerkingstools. Deze techniek kan efficiënt site-specifieke, erfelijke, kiembaanmutaties genereren die kunnen worden gebruikt voor het bouwen van genetische technologieën in deze onderbelichte ziektevector.

Embryo micro-injection technieken voor efficiënte site-specifieke mutagenese in Culex quinquefasciatus

Een protocol om de microsporidische parasiet Edhazardia aediste cultuuren. De parasiet wordt doorgevoerd van de ene generatie Aedes aegypti muggen naar de volgende via horizontale overdracht in het larvestadium, gevolgd door verticale transmissie in het volwassen stadium. Levende sporoplasma's overleven op lange termijn in geïnfecteerde eieren.

Voortplanting van de Microsporidische Parasiet Edhazardia aedis in Aedes aegypti Muggen

De steriele insectentechniek (SIT) wordt gebruikt om specifieke, medisch belangrijke muggenpopulaties te beheersen die bestand kunnen zijn tegen chemische controles. Hier beschrijven we een methode voor massale opfok en voorbereiding van steriele mannelijke muggen voor vrijlating in een operationeel SIT-programma gericht op de Aedes aegypti-mug .

Bestraalde en gemarkeerde mannelijke Aedes aegypti-muggen voorbereiden voor vrijlating in een operationeel steriel insectentechniekprogramma

Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de paringsconcurrentie van mannelijke Aedes aegypti met fluorescerende kleurstof als marker. Vrouwelijke muggen worden blootgesteld aan zowel gemarkeerde als ongemarkeerde mannetjes voor copulatie. Na de paring worden hun spermathecae onderzocht onder een fluorescentiemicroscoop om hun paringspartner te bepalen.

Met behulp van de fluorescerende kleurstof, Rhodamine B, om paringsconcurrentievermogen bij mannelijke Aedes aegypti-muggen te bestuderen

Vier methoden werden gebruikt om intracellulaire Wolbachia te detecteren, die elkaar aanvulden en de detectienauwkeurigheid van Wolbachia-infectie van Aedes albopictus-afgeleide Aa23 en Aa23-T genezen van inheemse Wolbachia-infectie met behulp van antibiotica verbeterden.

Detectie van Wolbachia Stam wAlbB in Aedes albopictus cellijnen

Het huidige protocol beschrijft hoe gemeenschappelijke levensparametergegevens bij Aedes aegypti-muggen kunnen worden gemeten, waaronder vruchtbaarheid, vleugelgrootte, vruchtbaarheid, geslachtsverhouding, levensvatbaarheid, ontwikkelingstijden, mannelijke bijdrage en levensduur van volwassenen. Deze metingen kunnen worden gebruikt om de fitheid van transgene muggen te beoordelen.

Kwantificering van fitnesskosten bij transgene Aedes aegypti-muggen

Cellijnen zijn nuttig bij studies naar intracellulaire organismen die niet buiten hun gastheercellen kunnen worden gekweekt. Hoewel met Wolbachia geïnfecteerde lijnen veel ontdekkingen mogelijk hebben gemaakt, kan de heterogeniteit binnen deze lijnen leiden tot variabele experimentele resultaten. We presenteren een protocol voor het genereren van eencellige klonen en continue culturen van met Wolbachia geïnfecteerde JW18-cellen.

Generatie van monoklonale culturen uit met Wolbachia geïnfecteerde Drosophila melanogaster JW18-cellijn

Leer het kweken van Aedes aegypti muggen met Wolbachia-infectie voor vectorbiologie en ziektebestrijding. Dit protocol ondersteunt onderzoek naar populatiebeheersing en virusoverdrachtsuppressie.

Behoud van Aedes aegypti muggen geïnfecteerd met Wolbachia

Meer video's verkennen