Name: In Situ MHC-tetrameer kleuring en kwantitatieve analyse om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van CD8 Antigen-specifieke T-cellen in weefsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer in situ MHC-tetrameer kleuring met immunohistochemie om antigen-specifieke CD8 T-cellen in weefsels te lokaliseren, kwantificeren en fenotyperen. Deze methode biedt inzicht in ruimtelijke verdeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door Public Health Service verleent van de National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

1. dag 1: verse weefsel segmenteren en primaire incubatie <ol><li>gebruik een scalpel aan verse weefsel in kleine (ongeveer 0.5 cm breed door 0.5 cm hoog) stukjes gesneden. Afzonderlijk lijm van elk weefsel naar een zuiger en insluit met 4% laag-smelt agarose 3-5 mL in PBS. Label de zuiger met de informatie van de weefsel met behulp van een sticker. Zet het in een gekoeld houder in een ijsemmer te stollen.</li>
	<li>Inschakelen de microtoom en de dikte van de secties naar 200 µm. installeren een scheermesje op de microtoom en steek de zuiger gemonteerd met weefsel in het bad microtoom.</li>
	<li>Bereiden met fosfaat gebufferde zoutoplossing met heparine (PBS-H) door toevoeging van 100 µg/mL of 18,7 U/mL heparine aan PBS voor het behoud van het RNA en toe te staan van de toepassingsmogelijkheden van ISH stroomafwaarts. Vul de microtoom bad, die betrekking hebben op het ingesloten weefsel, met 100-120 mL gekoeld, steriele PBS-H. PBS-H ijsblokjes toevoegen aan het bad om de temperatuur bij 0 - 2 ° C. Start de microtoom en knip het weefsel in secties van 200 µm. 
	Opmerking: Het is belangrijk om te houden van de weefsels gekoeld op ijs te minimaliseren van cellulaire activiteit binnen de weefsels en omdat verse weefsel gemakkelijker aan sectie is wanneer het is gekoeld. PBS alleen kan worden gebruikt als er geen plannen voor downstream ISH zijn.</li>
	<li>Als alternatief voor weefsels die doen niet goed met een microtoom (bijvoorbeeld darm en Long), gesneden gebruik een scalpel of scheermesje te snijden het weefsel in dunne reepjes als dicht mogelijk tot 200 µm.</li>
	<li>Label het deksel van 24-well weefselkweek platen met de experimentele voorbeeldgegevens en plaats de weefsel kamers in de overeenkomstige putten. Gebruik een penseel over te dragen van de secties aan een weefsel kamer instellen in de put van een 24-well weefselkweek plaat met 1 mL gekoeld PBS-H. 
	Nota: Herbruikbare weefsel kamers moeten worden gemaakt alvorens aan te vangen kleuring. Weefsel kamers kunnen worden gemaakt met behulp van een module-cap tube voor 14 mL polypropyleen ronde onderkant en draad mazen. Gebruik een scherp scheermesje af te snijden de onderkant van een 14 mL polypropyleen ronde onderkant module-cap buis. Knip het gaas in een cirkel aan het gat aan de onderkant van de buis. Verwarm de wire mesh cirkel met behulp van een Bunsenbrander, totdat het gloeiende. De wire mesh cirkel zeer snel vastgelegd en duwen de buis op de Maas. Controleer of de gaas is goed op de onderkant van de buis aangesloten en vervolgens zorgvuldig afgesneden van de bovenkant van de buis op de 3 mL merk met behulp van een scherp scheermesje. Zet maximaal 3 weefselsecties in elke kamer van het weefsel, of maximaal 1 cm 2 van weefsel per putje. Houden van ten minste één lege goed tussen putten met verschillende antilichaam combinaties te voorkomen van kruisbesmetting.</li>
	<li>Doorgaan op primaire tetrameer en antilichaam kleuring onmiddellijk na het beëindigen van de overdracht van alle gesneden secties in de weefsels kamers. De secties ondergedompeld en gekoeld in 1 mL PBS-H te allen tijde houden.</li>
	<li>Broeden de weefselsecties overnachting met 0,5 µg/mL FITC-geconjugeerd, peptide-geladen MHC-ik tetramers verdund in PBS-H met 2% normale geit serum (NGS). Muis of andere niet-konijn antilichamen gericht extracellulaire epitopes van belang in deze incubatie bevatten (bijvoorbeeld rat anti-CD8 antilichamen verdund 1:500 in PBS-H met 2% NGS). Plaats 1 mL verdunde antilichamen in elk putje. 
	Opmerking: Zorg moet worden genomen bij het selecteren van CD8 antilichamen, zoals sommige vergroten kunt en sommige MHC tetramers binden aan T-cel-receptoren 4 , 21 kunnen remmen. De rat anti-menselijke CD8 antilichaam hier beschreven is onstabiel en soms resulteert in een enigszins zwakke kleuring. Het wordt hier gebruikt voor het drievoudige labelen want het is de enige niet-konijn en niet-muis CD8 antilichaam die gekleurd rhesus makaak CD8 T cellen getest.</li>
	<li>Gebruik 1 mL van oplossing per putje voor het primair antilichaam en alle volgende incubations, en het uitvoeren van dit en alle latere incubations bij 4 ° C, met de platen op een rockende platform. 
	Opmerking: Weefsels moeten vrij zweven in de zaal.</li>
</ol> 2. Dag 2: Fixatie en secundaire incubatie <ol><li>na de primaire incubatie, wassen de secties tweemaal met 1 mL van gekoeld PBS-H gedurende 20 minuten elke wassen. Dit doen door de overdracht van de kamers van het weefsel op een bord van de verschillende 24-well weefselkweek met 1 mL gekoeld PBS-H in de overeenkomstige putjes. 
	Opmerking: Wees voorzichtig niet te druppelen van inhoud uit een experimentele monster naar de andere tijdens het verplaatsen tussen de kamers van het weefsel. Voor alle daaropvolgende incubations en wast, moet u de zaal weefsel ook overbrengen in een schoon plaat met de passende oplossing. Zorg ervoor dat controleren van de secties in het weefsel kamers tijdens de procedure om ervoor te zorgen dat de secties niet blijven aan de zijkanten van de kamers van het weefsel steken. Als ze, duw ze terug in de oplossing.</li>
	<li>Het herstellen van de secties met 1 mL van de verse PBS-gebufferd 4% paraformaldehyde gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (niet overdreven oplossen). Wassen met koud PBS-H tweemaal voor 5 min. 
	Let op: Paraformaldehyde is giftig; passende persoonlijke beschermingsmiddelen dragen. 
	Opmerking: Als antigeen ophalen en permeabilization nodig is voor het detecteren van intracellulaire epitopes, kunnen de antigenen worden opgehaald door het koken van de secties in 0,01 mol ureum na de fixatie paraformaldehyde.</li>
	<li>Overbrengen van de secties in 24-well cultuur platen met 0,01 mol ureum en plaats deze platen in een magnetron. Kook de secties driemaal voor ongeveer 10 s elk, voor een totaal van 30 s. 
	Opmerking: Wees heel voorzichtig, als het kookt de oplossing kan dwingen de secties uit de putten. Als dit gebeurt, gebruik een verfkwast terug te duwen in de secties van de zijkanten van de kamer van weefsel of van het deksel van de plaat in de bodem van de kamer van de juiste weefsel.</li>
	<li>Voorafgaande aan de incubatie van secundair antilichaam, permeabilize en de weefselsecties blokkeren door ze aan het broeden in blokkerende oplossing met PBS-H, 0,3% wasmiddel (PBS-H-T) en 2% NGS op een rocker gedurende 1 uur bij 4 ° C. uitvoeren volgende antilichaam incubations met PBS-H-T/2% NGS.</li>
	<li>Voor de secundaire incubatie, overbrengen in de secties in het weefsel chambers putten met konijn anti-FITC antilichaam verdund 1:10,000 in PBS-H-T/2% NGS. Na een nacht bebroeden.</li>
	<li>Uitvoeren counterstaining via muis anti-CD20 antilichaam verdund 1:200 in PBS-H-T/2% NGS. Voor deze optie, halen de epitopes indien nodig, de cellen doordringen en voorafgaand aan deze incubatie, blokkeren zoals hierboven beschreven.</li>
</ol> 3. Dag 3: Tertiaire incubatie <ol><li>na de tweede incubatie, wassen de secties drie keer in PBS-H bij 4 ° C gedurende ten minste 20 min.</li>
	<li>Voeren een definitieve incubatie met de juiste fluorescently label antilichamen (bijvoorbeeld geit anti-konijn geconjugeerd groenachtig geel, geit anti-rat geconjugeerd veel rode kleurstof en geit anti-muis geconjugeerd groene kleurstof antilichamen verdunde 1:5, 000, 1:5, 000 en 1:2, 000, respectievelijk, in PBS-H-T/2% NGS). Na een nacht bebroeden. 
	Opmerking: op dit punt, de incubatie kan worden verlengd tot drie dagen indien nodig. Houden van de secties beschermd tegen licht door inwikkeling van de platen in aluminiumfolie tijdens deze incubation stap en daarna, zoals licht fluorophores lest.</li>
</ol> 4. Dag 4: Montage van de secties <ol><li>Wash de secties drie keer in PBS-H voor ten minste 20 min. 
	Opmerking: Als plan voor downstream ISH 19, bevestigen de secties in 4% paraformaldehyde voor 1 h voor de beveiliging van de tetramers en de antilichamen in plaats en daarna wassen de secties tweemaal met PBS-H voor elke 5 min. 
	Let op: Paraformaldehyde is giftig; passende persoonlijke beschermingsmiddelen dragen.</li>
	<li>Gebruiken een penseel over te dragen van de secties aan een microscoopglaasje. Wees voorzichtig niet om het weefsel te veel steken. Jas elke sectie met glycerol/gelatine met 4 mg/mL n-propyl gallate of een ander montage opslagmedium met een conserveermiddel fluorophore. Dek af met een dekglaasje aan.</li>
	<li>De dia's opslaan in een licht beveiligde dia verpakking bij -20 ° C. Spoel de weefselkweek platen en verwijderen van de etiketten op het gebruik van alcohol deksels. 
	Opmerking: De platen kunnen worden hergebruikt.</li>
</ol> 5. Verwerving van de Confocal Microscoop beelden <ol><li>de hoge resolutie beelden vastleggen met een confocal microscoop, met behulp van de juiste lasers en filters voor elke fluorophore ( figuur 1A en B). 
	Opmerking: In dit voorbeeld een confocal microscoop (Zie de Tabel van materialen) werd gebruikt. Beelden werden verzameld met behulp van de 561 nm laser op 20% kracht voor de groenachtig geel-geëtiketteerden antigeen-specifieke T-cellen, de laser van de 488-nm op 10% kracht voor groen-geëtiketteerden CD20-uiten B-cellen en de laser van de 640-nm op 15% kracht voor ver rood gemerkte CD8 T-cellen. De 20 X doelstelling en een numerieke diafragma van 0,8 dienden.</li>
	<li>Verzamelen sequentieel z-serie op 3 µm (of andere) intervallen in de drie kanalen in meerdere 800 x 800 pixel velden. Bouwen van een montage van de verzamelde velden ( Figuur 1 c -E). Elke afbeelding van de montage op basis van de gegevens van de bijbehorende dia een naam geven en opslaan voor analyse.</li>
	<li>Uitvoeren van kwantitatieve beeldanalyse met behulp van de respectieve confocal microscoop analyse en kwantificering software of het gebruik van ImageJ.</li>
</ol> 6. Kwantitatieve beeldanalyse Opmerking: kwantitatieve beeldanalyse kan worden bereikt met behulp van de confocal microscoop analyse en kwantificering software of met behulp van ImageJ software. Hier, ImageJ werd gebruikt als een voorbeeld.
<ol><li>Open een confocal montage door deze te slepen naar het venster ImageJ ( figuur 2A). 
	Opmerking: ImageJ kunt montages verzameld door vele verschillende confocal microscopen rechtstreeks openen. Wanneer de montage niet rechtstreeks worden geopend door ImageJ, de geselecteerde z-scan als een TIFF-bestand te openen it. exporteren</li>
	<li>Dupliceren de geselecteerde z-scan p.a. (&#34; beeld &#34;-&#62; &#34; dupliceren &#34;) ( figuur 2B).</li>
	<li>De verschillende kanalen splitsen (&#34; beeld &#34;-&#62; &#34; kleur &#34;-&#62; &#34; kanalen splitsen &#34;) ( figuur 2C).</li>
	<li>Trekken de ROI voor kwantitatieve analyse in het overeenkomstige kanaal doelstelling en toe te voegen aan de ROI-manager door te drukken op &#34; T &#34; op het toetsenbord. Meten van het gebied. 
	Opmerking: De manager van de ROI van ImageJ geeft het gebied in µm 2 ( figuur 2D).</li>
	<li>Aanpassen van de fluorescentie helderheid en het contrast van het kanaal om te worden geanalyseerd (&#34; beeld &#34;-&#62; &#34; aanpassen &#34;-&#62; &#34; Helderheid/Contrast &#34;) ( figuur 2E).</li>
	<li>De ROI op de afbeelding afvlakken (&#34; ROI manager &#34;-&#62; &#34; Flatten &#34;) ( figuur 2F).</li>
	<li>Kwantificeren van de positieve cellen in de afbeelding met behulp van de &#34; Multi-Point &#34; gereedschap ( Figuur 2 g).</li>
</ol>

<ol><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+identify+peptide-specific+human+CD4%28%2B%29+T+cells+proliferating+in+response+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen.</a> J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+memory+CD8+T+cells+reveals+regionalization+of+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance.</a> Cell. 161 (4), 737-749 (2015).</li>
<li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li>
<li>Haanen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+virus-+and+tumor-specific+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity.</a> Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18432944">In situ tetramer staining using MHC class I tetramers.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+HLA-DR%2A08032%2FE7+and+HLA-DR%2A0818%2FE7+tetramers+in+tracking+of+epitope-specific+CD4%2B+T+cells+in+active+and+convalescent+tuberculosis+patients+compared+with+control+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors.</a> Immunobiology. 216, 947-960 (2011).</li>
<li>Bischof, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+after+primary+and+secondary+challenge+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers.</a> J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+staining+with+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers+permits+detection+of+antigen-specific%2C+autoreactive+CD4+T+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ.</a> PLoS ONE. 9, e87519(2014).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+brain+and+heart+using+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers.</a> J Vis Exp. (90), e51679(2014).</li>
<li>Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Peptide-MHC-II+Tetramer+Staining+of+Antigen-Specific+CD4%2B+T+Cells+in+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128862(2015).</li>
<li>Tjernlund, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+Gag-specific+CD8%2B+cells+in+the+GI+tract+of+SIV+infected+Rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques.</a> Retrovirology. 7, 7-12 (2010).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTL+fail+to+accumulate+at+sites+of+HIV-1+replication+in+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue.</a> J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).</li>
<li>Hong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0004131">Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium.</a> PLoS ONE. 4 (1), e4131(2009).</li>
<li>Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+and+dynamics+of+the+immunodominant+CD8+T+cell+response+to+SIV%CE%94nef+immunization+and+SIVmac251+vaginal+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81623(2013).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+simian+immunodeficiency+virus+replication+within+secondary+lymphoid+tissues+of+rhesus+macaques+is+linked+to+disease+stage+and+inversely+related+to+localization+of+virus-specific+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL.</a> J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcomes+in+early+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2009).</li>
<li>Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+simultaneously+visualize+virus-specific+CD8%2B+T+cells+and+virus-infected+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ.</a> J Vis Exp. (30), e1561(2009).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simian+immunodeficiency+virus-producing+cells+in+follicles+are+partially+suppressed+by+CD8%2B+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo.</a> J Virol. 90, 11168-11180 (2016).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
<li>Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+distribution+of+iNKT+cells+impacts+their+cytokine+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response.</a> Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).</li>
<li>Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Vibratome+and+Compresstome+sectioning+of+fresh+primate+lymphoid+and+genital+tissues+for+in+situ+MHC-tetramer+and+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining.</a> Biol Proced Online. 17, (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

IST gecombineerd met IHC biedt een essentieel instrument voor het opsporen, karakteriseren, en kwantificeren van antigeen-specifieke CD8 T cellen in native omgevingen met de context van andere cellen en weefsel structuren. Hier, beschreven we gedetailleerde procedures voor het IST gecombineerd met IHC, gevolgd door kwantitatieve beeldanalyse, om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van antigeen-specifieke CD8 T-cellen in de lymfeklieren van rhesus makaken. Soortgelijke kleuring kan worden toegepast op de mens...

T-cellen zijn cruciaal voor veel immunologische processen, waaronder opsporen en elimineren van virus-geïnfecteerde cellen voorkomen autoimmuniteit, assisteren bij B-cel en plasma-cel productie van antilichamen, opsporen en elimineren van kankercellen. De ontwikkeling van peptide/MHC klasse I tetrameer kleuring van antigeen-specifieke CD8 T cellen1 en de meer recente ontwikkeling van de MHC klasse II tetrameer kleuring van CD4 T cellen2 door stroom cytometry een revolutie teweeggebracht in ons vermogen te bestuderen en begrijpen de Immunobiologie van T-cellen. Terwijl uiterst nuttig voor het bepalen van de hoeveelheid en het fenotype van antigeen-specifieke T-cellen, stroom cytometry niet mogelijk voor de detectie van de ruimtelijke lokalisatie van antigeen-specifieke T-cellen naar andere cellen en structuren in de weefsels, en de huidige aggregatieniveau technieken om uit te pakken van de T-cellen die nodig zijn voor stroom cytometry hebben beperkte doeltreffendheid in niet-lymfoïde weefsels3.
Wij en anderen hebben ontwikkeld methoden met peptide-geladen MHC klasse I en klasse II tetrameer of multimer reagentia vlek van antigeen-specifieke CD8 en CD4 T-cellen in weefsels4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. deze IST methoden voor de bepaling van de locatie, overvloed en fenotype van antigeen-specifieke CD8 en CD4 T-cellen in weefsels verlenen en een middel om het detecteren van deze cellen ten opzichte van andere cellen en structuren in de weefsels. Onze fractie heeft uitgebreid gebruikt voor MHC-ik tetrameer vlekken om te bestuderen van humaan immunodeficiëntie virus (HIV)- en simian immunodeficiëntie virus (SIV) - specifieke CD8 T-cellen in de lymfoïde, genitale en rectale weefsels een inzicht van HIV en SIV immunopathogenese en te identificeren correlaten van succesvolle vaccinatie strategieën14,15,16,17. Daarnaast ontwikkeld we ook een techniek die IST met in situ hybridisatie (ISH combineert) te lokaliseren en te kwantificeren van virus-specifieke CD8 T cellen en virus-geïnfecteerde cellen in weefsels en om te bepalen van de in vivo effector-tot-streefpad niveaus 18 , 19.
Hier beschrijven we een protocol met behulp van peptide-geladen MHC-ik tetramers om vlek van antigeen-specifieke CD8 T-cellen in de weefselsecties van vers, tot counterstain weefsels met behulp van IHC en te kwantificeren van cellen met specifieke fenotypen in specifieke weefsel compartimenten. Deze procedures zijn dezelfde als in onze recente publicatie werden gebruikt door Li et al., waarin wij de locatie, overvloed en fenotype van SIV-specifieke T-cellen in de lymfoïde weefsel tijdens chronische SIV infectie in Makaken20 vastbesloten.
Voor deze procedure, verse weefsels zijn gesegmenteerd en 's nachts geïncubeerd met peptide-geladen MHC-ik tetramers geconjugeerd met fluoresceïne kaliumthiocyanaat moleculen (FITC). Ze worden dan opgelost met paraformaldehyde. Na de vaststelling van het weefsel, wordt het signaal van de MHC tetramers versterkt met behulp van konijn anti-FITC antilichamen en geïncubeerd met fluorescently tagged anti-konijn IgG antilichamen, die het signaal van de afhankelijke tetramers verder te versterken. IHC wordt gebruikt in combinatie met IST te karakteriseren van antigeen-specifieke T-cellen en de omringende cellen. Antilichamen die herkennen epitopes op het oppervlak van cellen of in de extracellulaire ruimte zijn opgenomen in de primaire incubatie met de tetramers. Antilichamen die intracellulaire epitopes herkent vereisen permeatie van de celwand voorafgaand aan kleuring. De gekleurde weefselsecties zijn beeld met behulp van een confocal microscoop en geanalyseerd met behulp van de confocal software. Gelabelde cellen worden gekwantificeerd aan de hand van de confocal microscopie software of ImageJ. De beschreven protocol kan worden gebruikt om vlek in wezen een antigeen-specifieke CD8 T cel in elk weefsel voor welke MHC-ik tetramers zijn beschikbaar.

<table><tbody><tr><td>MHC-I monomer</td><td>NIH tetramer core facility</td><td></td><td>Materialen voor MHC-tetrameer voorbereiding</td></tr><tr><td>ExtrAvidin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2716</td><td>Materialen voor MHC-tetrameer voorbereiding</td></tr><tr><td>Normaal geitenserum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBL6391V</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6878</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>J.T.Baker</td><td>4204-05</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol gelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBH2672V</td><td></td></tr><tr><td>n-propylgallaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td><td>Acris</td><td>0714</td><td>Antilichaam onstabiel, gebruik ingevroren aliquoot voor eenmalig gebruik</td></tr><tr><td>m-a-h-CD20 (1:500)</td><td>NOVOCASTRA</td><td>6026819</td><td></td></tr><tr><td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td><td>Vector</td><td>6022201</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-m-A488 (1:2,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>124083</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>106232</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rat-Cy5 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>118088</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>86579</td><td></td></tr><tr><td>Compresstome: VF-300 Microtome</td><td>Precisionary Instruments, LLC</td><td>1079</td><td></td></tr><tr><td>Quick Set Instant Adhesive</td><td>Loctite</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>24-well vlakke bodem weefselkweekplaten</td><td>Falcon</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglas</td><td>Globe scienfitic Inc.</td><td>#1321</td><td></td></tr><tr><td>Vuilmes</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Feather Disposable Scalpel</td><td>FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.</td><td>No. 21</td><td></td></tr><tr><td>Ronde schilderskwast #2</td><td>PRINCETON ART & BRUSH CO.</td><td>4350R</td><td>Kan indien nodig worden bijgesneden met mesje</td></tr><tr><td>Confocale Microscoop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW_Viewer4.0</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ mhc-tetrameer kleuring en kwantitatieve analyse om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van cd8 antigen-specifieke t-cellen in weefsels

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T-cellen zijn cruciaal voor veel immunologische processen, waaronder opsporen en elimineren van virus-geïnfecteerde cellen voorkomen autoimmuniteit, assisteren bij B-cel en plasma-cel productie van antilichamen, opsporen en elimineren van kankercellen. De ontwikkeling van MHC-tetrameer kleuring van antigeen-specifieke T-cellen geanalyseerd door stroom cytometry heeft een revolutie teweeggebracht in ons vermogen te bestuderen en begrijpen van de Immunobiologie van T-cellen. Terwijl uiterst nuttig voor het bepalen van de hoeveelheid en het fenotype van antigeen-specifieke T-cellen, kan niet stroom cytometry bepalen wat de ruimtelijke lokalisatie van antigeen-specifieke T-cellen naar andere cellen en structuren in de weefsels, en huidige aggregatieniveau technieken om uit te pakken van de T die nodig zijn cellen voor stroom cytometry hebben beperkte doeltreffendheid in niet-lymfoïde weefsels. In situ MHC-tetrameer kleuring (IST) is een techniek om te visualiseren van T-cellen die specifiek voor antigeen van belang in de weefsels zijn. In combinatie met immunohistochemistry (IHC), kunt IST bepalen de overvloed, locatie en fenotype van antigeen-specifieke CD8 en CD4 T-cellen in weefsels. Hier beschrijven we een protocol om de vlek en inventariseren van antigeen-specifieke CD8 T-cellen, met specifieke fenotypen gelegen binnen specifieke weefsel compartimenten. Deze procedures zijn dezelfde die we in onze recente publicatie door Li et al. gebruikt, getiteld "Simian Immunodeficiëntie Virus-producerende cellen in de follikels gedeeltelijk onderdrukt door CD8+ cellen In Vivo." De beschreven methoden zijn breed toepasbare omdat ze kunnen worden gebruikt voor het lokaliseren, fenotype, en in wezen een antigeen-specifieke CD8 T-cel waarvoor MHC tetramers beschikbaar zijn, in elk weefsel te kwantificeren.

Figuur 1 toont hoe verzamelt confocal beelden met behulp van een confocal microscoop. Figuur 2 toont kwantitatieve beeldanalyse ImageJ gebruiken. Figuren 3 en 4 tonen vertegenwoordiger beelden van lymfeklier weefsels van een SIV besmet resusaap gekleurd met MHC tetramers, CD8 antilichamen en CD20 antilichamen, en dienen om aan te tonen van de specificiteit van de MHC-tetrameer kleuring. <strong c...

Hier beschrijven we een methode die in situ MHC-tetrameer kleuring combineert met immunohistochemistry lokalisatie, fenotype, en hoeveelheid van antigeen-specifieke T-cellen in weefsels te bepalen. Dit protocol wordt gebruikt om te bepalen van de ruimtelijke en fenotypische kenmerken van antigeen-specifieke CD8 T-cellen ten opzichte van andere celtype en structuren in de weefsels.

In Situ MHC-tetrameer kleuring en kwantitatieve analyse om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van CD8 Antigen-specifieke T-cellen in weefsels

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Het algemene doel van deze procedure is om de locatie, abundantie en het fenotype van antigeenspecifieke CD8-positieve T-cellen binnen weefsels van belang te bepalen. Deze methode helpt bij het snel beantwoorden van vragen over CD8 T-cellen door een manier te bieden om vrijwel elke antigeenspecifieke CD8 T-cel in elk weefsel te lokaliseren, te kwantificeren en te fenotyperen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om de ruimtelijke distributie van antigeenspecifieke CD8-positieve T-cellen te bepalen ten opzichte van andere cellen en structuren binnen de weefsels van belang.Gwantwa Mwakalundwa zal de procedure demonstreren samen met Shengbin Li. Gebruik op de eerste dag van de procedure een scalpel om het verse weefsel in stukjes van ongeveer 0,5 x 0,5 centimeter te snijden. Hier wordt miltweefsel van een resusaapje getoond.Plak elk weefselfragment afzonderlijk in het midden van de bovenkant van een zuiger en bedel de monsters in drie tot vijf milliliters warme 4% low melting agarose in PBS. Label de zuigers met de relevante weefselinformatie. Plaats de monsters vervolgens in een gekoelde houder in een ijsemmer.Zodra de agar is gestold, schakelt u het

in-situ-mhc-tetramer-staining-quantitative-analysis-to-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze procedure toont de zuivering en in vitro expansie van antigeen specifieke CD4 + T-cellen uit heel het perifere bloed en de visualisatie met behulp van MHC klasse II tetrameren. Tetrameren toestaan ​​dat de directe visualisatie van T-cellen met een enkel antigen specificiteit en gedefinieerd MHC klasse II beperking.

Visualiseren van antigeen specifieke CD4 + T-cellen met behulp van MHC klasse II tetrameren

Een techniek combineert in situ tetrameer vlekken en in situ hybridisatie (ISTH) maakt visualisatie, in kaart brengen en analyseren van de ruimtelijke nabijheid van virus-specifieke CD8 + T-cellen om hun virus-geïnfecteerde targets, en de bepaling van de kwantitatieve relaties tussen deze immuun-effectoren en doelstellingen voor infecties resultaten.

Een techniek om tegelijkertijd Visualiseer virus-specifieke CD8 + T-cellen en virus-geïnfecteerde cellen In situ</em

Dit protocol beschrijft het gebruik van peptide: MHC tetrameren en magnetische microbolletjes voor laagfrequente populaties van epitoop-specifieke T-cellen isoleren en analyseren door flowcytometrie. Deze methode maakt de directe bestudering van endogene T-celpopulaties plaats...

Peptide: MHC tetrameer-gebaseerde verrijking van epitoop-specifieke T-cellen

Is beschreven het protocol tot zelf-reactieve CD4 T-cellen te detecteren in de hersenen en het hart door directe kleuring met hoofdhistocompatibiliteitscomplex klasse II dextramers in dit rapport. Voor uitgebreide analyse is een betrouwbare methode om de frequentie van antigeen-specifieke CD4 + T-cellen in situ sommen ook ontwikkeld.

In Situ Detectie van autoreactieve CD4 T-cellen in de hersenen en het hart met behulp van Hoofdhistocompatibiliteitscomplex Klasse II Dextramers

We beschrijven beeldvorming van het hele dier en op flowcytometrie gebaseerde technieken voor het bewaken van de uitbreiding van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen als reactie op immunisatie met nanodeeltjes in een muizenmodel voor vaccinatie.

Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het opsommen en karakteriseren rhesus macaque CD8 + T cellen tegen het AIDS-virus. Dit artikel is niet alleen nuttig voor het gebied van immunologie HIV, maar ook op andere gebieden van biomedisch onderzoek waarbij CD8 + T cel responsen is bekend dat de ziekte uitkomst beïnvloeden.

Analyse van Simian Immunodeficiency Virus-specifieke CD8 + T-cellen in resusapen door peptide-MHC-I tetrameer kleuring

Bestuderen van tumor communicatie kan identificeren prognostische of voorspellende biomarkers voor klinische respons op immunotherapie. Hier wordt gepresenteerd, is een innovatieve methode op basis van in situ fluorescentie multispectrale imaging te analyseren en automatisch verschillende subpopulaties van CD8 tellen+ T cellen. Deze reproduceerbaar zijn en betrouwbare techniek is geschikt voor grote cohort analyses.

Multiplexed immunofluorescentie analyse en kwantificering van Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cellen

Hier presenteren we een protocol voor de ex vivo kwalitatieve detectie van antigeen-specifieke CD8+ T cellen. Analyse is mogelijk met eencellige schorsingen van organen of van kleine hoeveelheden bloed. Een breed scala van studies vereisen de analyse van de reacties van de cytotoxische T-cel (vaccinatie en kanker immunotherapie studies).

Gelijktijdige kwantificering van anti-vector en Anti-transgenic-specifieke CD8+ T cellen Via MHC ik tetrameer kleuring na vaccinatie met een virale Vector

Dit protocol beschrijft het gebruik van één keten MHC klasse I complexen te onderzoeken van de moleculaire interacties in menselijke CD8 + T cel activatie: generatie van gemanipuleerde antigeen presentatie van cellen uiten van één keten bouwt, cultuur van menselijke CD8 + T cel kloon en T-cel activatie experimenten.

Gebruik van één keten MHC technologie te onderzoeken van Co-agonisme in menselijke CD8 + T cel activatie

In dit artikel wordt een protocol beschreven voor handmatige tyramide signaalversterking (TSA) multiplex immunofluorescentie (mIF) in combinatie met beeldanalyse en ruimtelijke analyse. Dit protocol kan worden gebruikt met formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) secties voor de kleuring van twee tot zes antigenen per dia, afhankelijk van de diascanner die beschikbaar is in het laboratorium.

Multiplex immunofluorescentie gecombineerd met ruimtelijke beeldanalyse voor de klinische en biologische beoordeling van de micro-omgeving van de tumor

Dit protocol beschrijft een methodologie voor multiplex-mRNA-detectie met massacytometrie voor eiwitbeeldvorming in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties.

Moleculaire cartografie met dubbele modaliteit: integratie van multiplex-mRNA-detectie met massacytometrie voor eiwitbeeldvorming

Leer in situ MHC-tetrameer kleuring met immunohistochemie om antigen-specifieke CD8 T-cellen in weefsels te lokaliseren, kwantificeren en fenotyperen. Deze methode biedt inzicht in ruimtelijke verdeling.

In Situ MHC-tetrameer kleuring en kwantitatieve analyse om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van CD8 Antigen-specifieke T-cellen in weefsels (Video) | JoVE Journal

In Situ MHC-tetrameer kleuring en kwantitatieve analyse om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van CD8 Antigen-specifieke T-cellen in weefsels

Meer video's verkennen