In Situ MHC-tetrameer kleuring en kwantitatieve analyse om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van CD8 Antigen-specifieke T-cellen in weefsels

Het algemene doel van deze procedure is om de locatie, abundantie en het fenotype van antigeenspecifieke CD8-positieve T-cellen binnen weefsels van belang te bepalen. Deze methode helpt bij het snel beantwoorden van vragen over CD8 T-cellen door een manier te bieden om vrijwel elke antigeenspecifieke CD8 T-cel in elk weefsel te lokaliseren, te kwantificeren en te fenotyperen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om de ruimtelijke distributie van antigeenspecifieke CD8-positieve T-cellen te bepalen ten opzichte van andere cellen en structuren binnen de weefsels van belang.

Gwantwa Mwakalundwa zal de procedure demonstreren samen met Shengbin Li. Gebruik op de eerste dag van de procedure een scalpel om het verse weefsel in stukjes van ongeveer 0,5 x 0,5 centimeter te snijden. Hier wordt miltweefsel van een resusaapje getoond.

Plak elk weefselfragment afzonderlijk in het midden van de bovenkant van een zuiger en bedel de monsters in drie tot vijf milliliters warme 4% low melting agarose in PBS. Label de zuigers met de relevante weefselinformatie. Plaats de monsters vervolgens in een gekoelde houder in een ijsemmer.

Zodra de agar is gestold, schakelt u het microtoom in en stelt u de dikte in op 200 micrometers. Plaats na het installeren van een nieuw scheermesje de plungers in het microtoombad. Vul het microtoombad met 100 tot 200 milliliters vers bereide PBS-H en voeg PBS-H ijsblokjes toe om de temperatuur tussen nul en twee degrees celsius te houden.

Nadat coupes van 200 micrometer zijn verkregen, gebruikt u een penseel om de agar rondom elke coupe te verwijderen en brengt u de monsters over naar individuele weefselkamers in afzonderlijke putjes van een 24-wells weefselkweekplaat die één milliliter gekoelde PBS-H bevat. Wanneer alle monsters zijn verzameld, worden de weefselcoupes overnacht geïncubeerd in één milliliter met fit geconjugeerde peptide geladen MHC-klasse I-tetrameren, verdund in PBS-H aangevuld met 2% normaal geiten serum bij vier degree celsius onder schudden. De volgende ochtend wordt elke weefselkamer voor 20 minuten overgebracht naar individuele putjes van een nieuwe 24-wells plaat met één milliliter verse gekoelde PBS-H.

Fixeer na de tweede wasbeurt de coupes gedurende twee uur bij kamertemperatuur in één milliliter verse 4%paraformaldehyde. Volg dit met twee wasbeurten van vijf minuten in koude PBS-H. Breng de coupes over naar een nieuwe 24-wellplaat met 0,01 molar ureum en verwarm de coupes drie keer in de magnetron gedurende ongeveer 10 seconden per keer, totdat het ureum kookt.

Om de monsters te permeabiliseren en te blokkeren, worden de coupes gedurende één uur bij 4 °C op een rocker geïncubeerd in een blokkeringsoplossing bestaande uit PBS-H aangevuld met 0,3% triton x100 detergent en 2% normaal geiten serum. Aan het einde van de incubatie worden de weefselkamers overgebracht naar individuele wells van een nieuwe 24-wells plaat die één milliliter van een oplossing bevat met konijnen anti-FITC antilichamen, muis anti-humane CD antilichamen en rat anti-humane CD3 antilichamen. De monsters worden vervolgens overnacht bij 4 °C onder schudcondities (rocking) geïncubeerd.

Was op dag drie de coupes drie keer in verse PBS-H bij vier graden Celsius gedurende ten minste 20 minuten per wasbeurt en voer een laatste incubatie uit met de geschikte fluorescentie-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende maximaal drie dagen, beschermd tegen licht. Spoel de monsters aan het einde van de incubatie met het tertiaire antilichaam af met drie wasbeurten van 20 minuten in verse PBS-H en gebruik een penseel om de monsters uit elke weefselkamer over te brengen naar een glazen microscpiaal. Bedek elke coupe met monteermedium aangevuld met een fluorofoor-conserveermiddel en dek de monsters af met een dekglas.

Bewaar de objectglazen vervolgens in een lichtbestendige objectglashouder bij 20 °C. Plaats op de dag van de beeldvorming het eerste objectglas op de tafel van een confocale microscoop en selecteer de juiste lasers en filters voor elke fluorofoor die is gebruikt om het weefselmonster te labelen. Neem met het 20x objectief sequentieel een z-serie op met intervallen van 3 µm in elk van de fluorofoor-kanalen, in meerdere velden van 800 x 800 pixels.

Stel vervolgens een montage samen van de verzamelde velden en sla elke montage-afbeelding op met een naam op basis van het overeenkomstige weefselmonster. In deze representatieve afbeeldingen wordt een sectie gekleurd met MHC-klasse I-tetrameren geladen met een SIV-peptide vergeleken met een sectie van hetzelfde weefsel, gekleurd met MHC-klasse I-tetrameren geladen met een irrelevant peptide, wat de specificiteit van de tetrameerkleuring aantoont. In deze afbeeldingen kleuren de virus-specifieke T-cellen, gekleurd met MHC-klasse I-tetrameren geladen met SIV-peptide, positief voor CD8, een T-cel subsetmarker, maar niet voor CD20, een celoppervlakte-eiwit dat tot expressie komt op B-cellen.

Deze montage is samengesteld uit meerdere confocale z-serie velden, die werden gebruikt voor de kwantificering van met tetrameren gekleurde cellen met specifieke fenotypes en in verschillende anatomische compartimenten van de lymfeknoop. Deze vergrote afbeelding toont een gebied van de montage van de lymfeknoop dat een B-cel-follikel bevat, afgebakend door IGM-kleuring. MHC-klasse I-tetrameer-gekleurde cellen, waarvan sommige de T-cel-activatie- en proliferatiemarker KI67 co-expresseren, kunnen zowel binnen als buiten de B-cel-follikel worden gedetecteerd.

Deze kleuringscombinatie maakt het mogelijk om de activatie- en proliferatiestatus van SIV-specifieke CD8-positieve T-cellen te bepalen, evenals hun lokalisatie binnen secundaire lymfoïde weefsels. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer vijf dagen worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat vers weefsel cruciaal is voor een succesvolle kleuring.

Verwerk de monsters binnen 24 uur of minder na het oogsten en houd ze gekoeld tot de fixatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het uitvoeren van een tetrameerkleuring en immunohistochemie om de locatie, abundantie en het fenotype van antigeenspecifieke CD8-positieve T-cellen in de relevante weefsels te bepalen. Vergeet niet dat werken met infectieuze agentia extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om blootstelling te voorkomen, zoals het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en het beperken van het gebruik van scherpe voorwerpen tijdens het uitvoeren van deze procedure.