Laboratorium Protocol voor genetische Analyses van de inhoud van de Gut van aquatische Macroinvertebrates gebruiken groepsspecifieke rDNA Primers

Het algemene doel van dit protocol is om onderzoek naar trofische ecologie te verbeteren, met name vanuit veldmonsters. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van de ecologie van voedselwebben, zoals de impact van invasieve soorten op trofische interacties. Het belangrijkste voordeel is de aanvullende toepassing op meer tijd-integrerende trofische analyses voor exact dezelfde exemplaren en dat het door vrijwel elke ecoloog kan worden toegepast.

Hoewel we deze aanpak hebben ontwikkeld om inzicht te geven in de prooiconsumptie van aquatische consumenten, kan deze ook voor andere doeleinden worden toegepast, bijvoorbeeld om de soortsamenstelling binnen benthise macro-invertebratenmonsters te bepalen. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Christian Sodemann, een technicus uit ons laboratorium. Om dit experiment te starten, breng je eerder gedissekteerde predator gastro-intestinale tractus over naar een twee-milliliter safe-lock reactiebuis die 440 microliters zoutextractiebuffer bevat.

Vries de monsters onmiddellijk in bij min 20 graden Celsius tot DNA-extractie. Nadat je de monsters uit de vriezer hebt gehaald, begin je met DNA-extractie door met een pincet een vijf-milliliter roestvrijstalen kraal toe te voegen aan elke monsterbuis, en laat de monsters dan op de werkbank op kamertemperatuur ontdooien. Gebruik een kraalmolen om de monsters gedurende één minuut bij 15 hertz te homogeniseren.

Nadat je de monsters kort hebt gecentrifugeerd, voeg je 90 microliters 10% SDS en vijf microliters 10 milligram per milliliter proteinase K toe aan de monsters. Klop de monsters daarna grondig en incubeer ze gedurende één uur bij 60 graden Celsius met constant schudden bij 400 tpm op een ThermoMixer. Om de lysis verder te bevorderen, klop je de monsters elke 10 minuten tijdens deze incubatie.

Na een korte centrifugatie zet je 350 microliters van vijf molare natriumchloride in de monsters. Klop gedurende 30 seconden tot één minuut om de monsters volledig te mengen. Daarna centrifugeer je bij 16.200 keer g bij vijf graden Celsius gedurende 40 minuten.

Een van de meest cruciale dingen bij het uit de centrifuge halen van de monsters is om te voorkomen dat de kralen bewegen en het pellet verstoren dat alle deeltjes bevat die door de stap moeten worden verwijderd. Breng vervolgens voorzichtig ongeveer 600 microliters supernatant over in een nieuwe 1,5 milliliter buis, zorg ervoor dat je het pellet niet verstoort. Voeg 600 microliters ijskoud isopropanol toe en draai de buis voorzichtig een paar keer om.

Bewaar bij min 20 graden Celsius een nacht lang. Nadat je de monsters uit de vriezer hebt gehaald, centrifugeer ze bij 16.200 keer g bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Gooi het supernatant weg en zorg ervoor dat je het pellet niet verliest, en gebruik een tissue om de buis voorzichtig te drogen.

Was deze DNA-bevattende pellets door 200 microliters 70% ijskoud ethanol toe te voegen en centrifugeer vervolgens bij 16.200 keer g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant voorzichtig weg en gebruik pluisvrij tissue om de buis voorzichtig te drogen. Ten slotte verwijder je voorzichtig het resterende supernatant met een 10 microliter pipette ingesteld op acht microliters, zorg ervoor dat je het pellet niet verstoort.

Laat het pellet drogen totdat al het ethanol is verdampt. Voeg vervolgens 50 tot 100 microliters nuclease-vrij water toe, klop kort en laat het bij vier graden Celsius een nacht lang staan om het pellet op te lossen. Om de functionele efficiëntie van de hier geëxtraheerde DNA-monsters te verifiëren, test je elk ervan door PCR, met behulp van universele primersets die geschikt zijn voor de respectieve voedselbron.

Begin met het toevoegen van primers, dNTP-mix, reactiebuffer, Taq DNA-polymerase en gezuiverd water in een 1,5 of 2,5 milliliter reactiebuis en klop de standaardreactiemix. Breng nu voor elk DNA-monster één microliter van het corresponderende DNA-extract over in negen microliters van de standaardreactiemix in een PCR-plaat. Sluit de plaat, plaats hem in de thermocycler en start het PCR-programma.

Na de voltooide PCR-reactie, gebruik een korte draaioptie van een minicentrifuge om de PCR-producten naar beneden te centrifugeren. Meng vervolgens drie microliters van elk PCR-product met één microliter van zes keer ladingskleurstof. Laad deze monsters in gelslots van een eerder bereide agarosegel.

Laad 1,5 microliters van een 100 basenpaar DNA-ladder in één slot van de gel als groottenorm. Sluit het deksel van de elektroforese-eenheid, sluit deze aan op een stroomvoorziening en laat de gel 35 minuten bij 100 volt per centimeter lopen. Na de elektroforese-run verwijder je de gel en plaats je hem in een eerder bereide kleuringsbad gedurende ongeveer 10 minuten.

Verwijder ten slotte de gel uit het kleuringsbad en plaats hem op een geldocumentatiesysteem en visualiseer hem volgens de handleiding. Om de darminhoud van de predator te analyseren, gebruik je eerder bereide werkoplossingen van DNA-extract. Voer afzonderlijke PCR-reacties uit voor elk van de 16 prooigroep-specifieke primersets.

Neem één positieve controle op met DNA van een exemplaar dat tot de respectieve prooigroep behoort en één negatieve controle met DNA van de predatorensoort. Het is cruciaal om de toewijzing van monsters binnen elke PCR-plaat exact te documenteren om te voorkomen dat verschillende monsters worden samengevoegd tijdens het laden op een sequencingplaat voor de detectie van een toewijzingssequencer en uiteindelijk de verkeerde resultaten toe te wijzen aan een consumentenindividu. Voer vervolgens de PCR-reacties uit met behulp van hetzelfde protocol als eerder beschreven, aangepast aan de specifieke annealtemperatuur en cyclusnummer voor elke gebruikte primerset.

Om de versterkte fragmenten in deze PCR-reacties te detecteren, voer je geautomatiseerde fragmentanalyses uit in twee batches, A en B. Bereid een mengsel voor dat laadoplossing voor monsters, of SLS, en de respectieve groottenorm bevat voor elke batch. Ontdooi vervolgens de eerder bevroren PCR-producten van de acht PCR-reacties die tot de respectieve batch behoren, zorg ervoor