Stereotactische Atlas-geleide Laser vangt Microdissection van hersengebieden beïnvloed door traumatisch letsel

Het algemene doel van dit protocol voor laser-capture microdissectie is het verzamelen van cellen uit specifieke hersengebieden die zijn aangetast door traumatisch hersenletsel voor moleculaire analyse. Ik ben dokter Helen Hellmich. Mijn promovendus, Harris Weisz, die student is in het programma Human Pathophysiology and Translational Medicine hier aan de University of Texas medical branch, zal demonstreren hoe wij laser-capture microdissectiemethoden gebruiken in onze studies naar hersenletsel.

Deze methode kan helpen bij het verhelderen van de mechanismen en gevolgen van door TBI geïnduceerde veranderingen in specifieke hersengebieden, zoals de frontale cortex, die executieve functies aanstuurt, en de hippocampus, die belangrijk is voor geheugenafhankelijke processen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we het effect van een ziekteproces op meerdere specifieke hersengebieden of individuele celtypen uit hetzelfde brein kunnen bestuderen.

Voorafgaand aan elke LCM-procedure die transcriptionele analyse omvat, moeten alle oppervlakken worden gereinigd met een RNase-verwijderend detergent om het risico op contaminatie en RNA-degradatie te beperken. Haal het hersenweefsel uit de opslag en plaats het in een cryostaat die is afgekoeld tot -20 °C.

Laat de hersenen ongeveer tien minuten equilibreren naar de temperatuur van de cryostaatkamer. Plaats de hersenen met de ventrale zijde naar boven op een gaasdoekje op de tafel van de cryostaat. Snijd met een schoon RNA-scheermesje het posterieure gedeelte net rostral van het cerebellum en het gedeelte net anterieur van het chiasma opticum af.

Plaats een kleine hoeveelheid optimal cutting temperature-medium in twee afzonderlijke cryovormen. Plaats de hersenen die de frontale associatiecortex en de nucleus accumbens core bevatten met de binnenzijde naar beneden in één cryovorm. Voeg voldoende OCT-medium toe om het weefsel te bedekken.

Herhaal deze stap met het stuk hersenweefsel dat de hippocampus en de nucleus suprachiasmaticus bevat. Laat het OCT-medium ongeveer 20 minuten volledig bevriezen in de cryostaat. Zodra het weefsel en het OCT-medium volledig bevroren zijn, brengt u een kleine hoeveelheid OCT aan op een montagekop.

Druk een bevroren cryomallen op de montagekop en laat het OCT volledig bevriezen, zodat de mal met het weefsel stevig aan de kop is bevestigd. Bevestig de kop aan de snijhouder en draai de schroef vast. Pas de snijhoek ten opzichte van het cryostaatmess met de verstelhendels aan om te garanderen dat de coupes gelijkmatig worden gesneden.

Stel de coupesdikte in op 30 micron. Bij het coupesnijden van het weefselblok dat de hippocampus en SEN bevat, wordt er gesneden tot het chiasma opticum vlak is bij bregma 0,48 millimeter en het derde ventrikel zichtbaar wordt. Verzamel vervolgens vanaf dit punt coupes voor de SEM door bij kamertemperatuur voorzichtig polyethyleennaphtalaat-membraanpreparaten boven op het gesneden weefsel te plaatsen.

Controleer visueel of de hechting aan het objectglas correct is door te bevestigen dat het weefsel en het OTC volledig op het glas zijn gesmolten. Bewaar alle objectglazen met weefselcoupes in de cryostaat tot aan de kleuring. Stop met het verzamelen van coupes bij bregma 0,72 millimeters wanneer de supraoptische decussatie begint.

Voor het verzamelen van de hippocampus worden coupes gemaakt totdat de hoorns van de korrelcellaag van de gyrus dentatus zichtbaar zijn bij bregma 3,00 millimeter. Verzamel de coupes totdat de CA-subvelden van de hippocampus gefuseerd zijn in de coronale coupes bij bregma 4,78 millimeter. Dit maakt een volledige verzameling van de hippocampus mogelijk onder de craniotomie en de plek van de beschadiging.

Was vóór het kleuren al het glaswerk en het kleurgebied in een chemische zuurkast met een RNase-verwijderend reinigingsmiddel. Neem het rek met coupes uit de cryostaat en plaats dit in de zuurkast. Laat de coupes 30 seconden opwarmen.

Kleur de coupes met cresylviolet en maak ze helder met zoutoplossing. Laat het rek met gekleurde coupes maximaal tien minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur in de zuurkast. Ga direct over tot LCM zodra ze droog zijn.

Voordat u begint met een LCM-procedure voor RNA-analyse, reinigt u het verzamelgebied en de omgeving rond het apparaat met een RNAse-verwijderend detergent en 100% ethanol. Zet de aan/uit-schakelaar van de infrarode lasergenerator aan voordat u de microscoopbasis inschakelt, en laat het systeem initialiseren voordat de software vanaf het bureaublad wordt gestart. Zodra de software is opgestart en de initialisatiestappen zijn doorlopen, opent u het instellingenpaneel van de software en drukt u op de knop 'present stage'.

De modulaire tafel zal zich naar de positie bewegen waar de LCM macro-doppen en objectglazen kunnen worden geladen en uitgeladen. Plaats maximaal drie membraan-objectglazen in de houders met de gematteerde rand naar rechts gericht. Selecteer het gebied voor het hanteren van doppen en objectglazen naast het betreffende objectglas en vink het selectievakje MEM aan om de software te laten weten dat membraan-objectglazen zijn geladen.

Klik vervolgens op de gewenste slide die als eerste moet worden vastgelegd. Om een tegelbeeld vast te leggen voor de locatie en oriëntatie van het weefsel voor de plaatsing van de caps, selecteert u image in de werkbalk en kiest u acquire overview. Plaats de cursor over het gebied op het tegelbeeld, klik met de rechtermuisknop en selecteer place cap at region center.

De software plaatst automatisch een dop over de geselecteerde positie. Nadat de infrarode en UV-lasers zijn gelokaliseerd, kiest u de optie voor vrijhandig tekenen in het paneel met selectiegereedschappen. Teken met de stylus van het touchscreen rond de omtrek van het interessegebied, waarbij u erop let dat het contact tussen het touchscreen en de punt van de stylus niet wordt verbroken.

Zorg ervoor dat de begin- en eindpunten met elkaar verbonden worden. Voor de hippocampus-collectie wordt met laser capture de CA1-, CA2- en CA3-subvelden van de hippocampus verzameld, beginnend bij bregma 3,00 millimeter, waarbij de volledig gevormde granulaire laag van de gyrus dentatus als fysiek referentiepunt voor morfologische identificatie wordt gebruikt. Verplaats na de collectie de LCM-macrodoppen naar de QC-positie en controleer of het weefsel volledig hecht door visueel te bevestigen dat het door UV gesneden weefsel aan het membraan vastzit.

Het is essentieel dat de UV-laser rondom het gehele weefsel snijdt. Als dit niet gebeurt, zal het weefsel niet volledig aan de LCM-cap hechten. Plaats vervolgens elke cap snel in een RNAse-vrije reactiebuis van 0,5 milliliter met dunne wand die 100 µL cellysbuffer bevat.

Vortex de monsters kortstondig om volledige lysis te garanderen en bewaar ze bij min 80 graden Celsius tot het moment van de downstream genomische analyse. De volgende afbeeldingen zijn representatieve beelden van weefselcoupes verzameld van de ipsilaterale zijde van de letselplaats met infrarood- en UV-laserfuncties op het LCM-systeem. Dit is een gebied van de frontale associatiecortex.

Deze afbeelding toont dezelfde regio na collectie. En dit is het weefsel op de dop na collectie. Deze afbeelding toont de componenten van de CA1-, CA2- en CA3-parameatale lagen van de hippocampus, gelegen naast de volledig gevormde hoorns van de granulaire laag van de gyrus dentatus.

De CA2- en CA3-regio's werden verzameld en deze celpopulaties zijn zichtbaar op de cap. Hier is een gebied van de nucleus accumbens core, proximaal adrostraal ten opzichte van de commissura anterior, getarget en getrouw gereproduceerd op de cap. Tot slot werd de nucleus suprachiasmaticus, rostraal ten opzichte van het chiasma supraopticum, na TBI vastgelegd via LCM.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze worden gebruikt om één brein in ongeveer acht uur te verwerken. Dit omvat weefselverwerking, kleuring en LCM. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals epigenetische analyse, worden uitgevoerd om vragen over methyleringspatronen of micronische expressie te beantwoorden.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in hoe u LCM kunt uitvoeren op meerdere hersenregio's in hetzelfde brein.