Stereotactische Atlas-geleide Laser vangt Microdissection van hersengebieden beïnvloed door traumatisch letsel
11 september 2017
We beschrijven het gebruik van laser vangt microdissection te verkrijgen van monsters van afzonderlijke cel populaties van verschillende hersengebieden gen en microRNA p.a.. Deze techniek maakt het mogelijk de studie van Differentiele effecten van traumatische hersenenverwonding in bepaalde gebieden van de hersenen van de rat.
Het algemene doel van dit Laser Capture Microdissection protocol is om cellen te verzamelen uit specifieke hersengebieden die getroffen zijn door traumatisch hersenletsel voor moleculaire analyse. Ik ben Doctor Helen Hellmich. Mijn graduaat-assistent, Harris Weisz, die een student is in het programma Humane Fysiopathologie en Translationele Geneeskunde hier aan de University of Texas medische afdeling, zal demonstreren hoe we laser capture microdissectie methoden gebruiken in onze hersenletselstudies.
Deze methode kan helpen om de mechanismen en gevolgen van door TBI geïnduceerde veranderingen in discrete hersengebieden te verduidelijken, zoals de frontale cortex, die executieve functies controleert. En hippocampus die belangrijk is voor geheugenafhankelijke processen. Het grote voordeel van deze techniek is dat we het effect van een ziekteproces op meerdere discrete hersengebieden of individuele celtypen uit dezelfde hersenen kunnen bestuderen.
Voor elke LCM-procedure die transcriptieanalyse omvat, moet u alle oppervlakken schoonmaken met RNace eliminerend detergent om het risico op besmetting en RNA-degradatie te verminderen. Haal het hersenweefsel uit de opslag. En plaats het in een cryostat die gekoeld is tot minus 20 graden Celsius.
Laat de hersenen gedurende ongeveer tien minuten gelijkmatig worden aangepast aan de temperatuur van de cryostatkamer. Plaats de hersenen, met de ventrale kant naar boven, op een gaaslaken op de cryostatfase. Snijd met een schone RNA-mesjes het achterste gedeelte net rostraal van het cerebellum en het gedeelte net anterior van het optische chiasma af.
Plaats een kleine hoeveelheid optimaal snijtemperatuurmedium in twee afzonderlijke cryovormen. Plaats de hersenen met de frontale associatiecortex en nucleus accumbens core in één cryovorm, met de binnenkant naar beneden. Voeg voldoende OCT-medium toe om het weefsel te bedekken.
Herhaal deze stap met het stuk hersenweefsel dat de hippocampus en suprachiasmatische kern bevat. Laat het OCT-medium ongeveer 20 minuten in de cryostat volledig bevriezen. Zodra het weefsel en OCT-medium volledig bevroren zijn, knijpt u een kleine hoeveelheid OTC op een montagekop.
Druk een bevroren cryovorm op de montagekop en laat de OCT volledig bevriezen, zodat de mal met het weefsel stevig aan de kop is bevestigd. Bevestig de kopbevestiging aan de snijmontage en draai de schroef vast. Pas de snijshoek aan ten opzichte van de cryostatmesjes met de aanpassingshendels om ervoor te zorgen dat de secties gelijkmatig worden gesneden.
Stel de dikte van de sectie in op 30 micron. Bij het snijden van de weefselblok met de hippocampus en SEN, snijd tot het optische chiasma is afgeplat op bregma 0,48 millimeter. Wanneer het derde ventrikel duidelijk wordt. Verzamel dan secties voor de SEM vanaf dit punt door voorzichtig kamertemperatuur polyethyleen naftalaatmembraanslides op de bovenkant van het gesneden weefsel te plaatsen.
Controleer visueel de hechting aan de slide door te bevestigen dat het weefsel en OTC volledig gesmolten zijn op de slide. Bewaar alle slides met weefselsecties in de cryostat tot het kleuren. Stop met het verzamelen van secties op bregma 0,72 millimeter wanneer de supraoptische decussatie begint.
Voor de verzameling van de hippocampus, snijd tot de hoorns van de granulecel laag dentate gyrus zichtbaar zijn op bregma 3,00 millimeter. Verzamel secties tot de hippocampale CA-subvelden zijn versmolten in de coronale secties op bregma 4,78 millimeter. Dit zorgt voor een volledige verzameling van de hippocampus onder de craniotomie en het letselgebied.
Voor het kleuren, was alle serviesgoed en het kleurgebied in een chemische afzuigkap met RNase eliminerend detergent. Neem de rack met slides uit de cryostat en plaats deze in de afzuigkap. Laat de slides gedurende 30 seconden opwarmen.
Kleur de secties met cresylviolet en maak ze helder met zoutoplossing. Laat de rack met gekleurde slides gedurende maximaal tien minuten op kamertemperatuur in de afzuigkap drogen. Eenmaal gedroogd, ga direct naar LCM.
Voordat u begint met een LCM-procedure voor RNA-analyse, veegt u het verzamelgebied en het gebied rond het apparaat schoon met RNAse eliminerend detergent en 100% ethanol. Zet de aan/uit-schakelaar van de infraroodlasergenererende eenheid in voordat u de microscoopbasis aanzet en laat het systeem initialiseren voordat de software vanaf het bureaublad wordt gestart. Zodra de software is opgestart en door de initiële stappen is gelopen, opent u het setup-paneel van de software en drukt u op de knop voor de huidige fase.
De modulaire fase beweegt zich naar de positie waar LCM-macrokappen en slides kunnen worden geladen en gelost. Plaats maximaal drie penmembraanslides in de houders met de bevroren rand naar rechts gericht. Selecteer het kap- en slide-afhandelingsgebied naast de respectieve slide en klik op het selectievakje MEM om de software te vertellen dat membraanglasslides zijn geladen.
Klik vervolgens op de gewenste slide die eerst moet worden vastgelegd. Om een beeld van een tegel te maken voor weefselligging en oriëntatie voor kapplaatsingen, selecteert u afbeelding op de werkbalk en selecteert u overzicht verkrijgen. Plaats de cursor over het gebied op het tegelbeeld, klikt u met de rechtermuisknop en selecteert u plaats kap in het midden van de regio.
De software zal automatisch een kap over de geselecteerde positie plaatsen. Nadat u de infrarode en UV-lasers hebt gevonden, kiest u de optie vrijhandige tekening in het selectiegereedschapsvenster. Gebruik de stylus van de touchscreen om rond de omtrek van het gebied van belang te tekenen terwijl u ervoor zorgt dat het contact tussen de touchscreen en de styluskop niet verloren gaat.
Zorg ervoor dat u de begin- en eindpunten met elkaar verbindt. Voor de verzameling van de hippocampus, gebruikt u laser om de CA1, CA2 en CA3 hippocampale subvelden te vangen, beginnend op bregma 3,00 millimeter en gebruikt u de volledig gevormde granulaire laag van de dentate gyrus als een fysiek kenmerk voor morfologische identificatie. Na verzameling verplaatst u de LCM-macrokappen naar de QC-positie en controleert u op volledige weefselhechting door visueel te controleren of het UV-gesneden weefsel aan het me
Overzicht
Dit artikel beschrijft het gebruik van laser capture microdissectie (LCM) voor het verkrijgen van specifieke celpopulaties uit verschillende hersengebieden van ratten om de expressie van genen en microRNA te analyseren. De techniek vergroot het inzicht in de differentiële effecten van traumatisch hersenletsel (TBI) in verschillende hersengebieden, zoals de frontale cortex en de hippocampus.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Moleculaire Analyse
Achtergrond
- TBI kan uiteenlopende effecten veroorzaken in verschillende hersenregio's.
- Het begrijpen van deze effecten op cellulair niveau vereist nauwkeurige bemonsteringstechnieken.
- LCM maakt gerichte analyse van specifieke celtypen mogelijk zonder contaminatie.
- Deze studie heeft zowel praktische als methodologische implicaties voor neurowetenschappelijk onderzoek.
Doel van de studie
- Om LCM te gebruiken voor het isoleren van hersencellen die zijn aangetast door TBI.
- Om de gen- en microRNA-expressie die relevant zijn voor TBI te analyseren.
- Om de moleculaire gevolgen van TBI in specifieke hersengebieden te verduidelijken.
Gebruikte methoden
- Laser capture microdissection (LCM) is het primaire gebruikte platform.
- Het biologische model bestaat uit hersenweefsel van ratten, waarbij specifiek regio's worden getarget die zijn aangetast door TBI.
- De studie stelt kritieke tijdlijnen vast voor weefselpreparatie, doorsneden en kleuring.
- Stappen voor zorgvuldige preventie van contaminatie worden gedurende het gehele protocol benadrukt.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van doelcelpopulaties uit regio's zoals de frontale cortex en hippocampus.
- Inzichten in door TBI geïnduceerde veranderingen op moleculair niveau, ter ondersteuning van toekomstige mechanistische studies.
- Identificatie van kritieke fasen van coupesnijden en kleuring voor een betrouwbare RNA-verzameling.
Conclusies
- De studie demonstreert hoe LCM gerichte moleculaire analyses van de effecten van TBI kan faciliteren.
- De implicaties omvatten een beter begrip van de neuronale mechanismen die door letsel worden beïnvloed.
- Deze methode vergroot de precisie in neurowetenschappelijk onderzoek en biedt mogelijkheden voor therapeutische exploratie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Laser capture microdissectie (LCM) maakt nauwkeurige moleculaire profilering mogelijk van specifieke hersengebieden die zijn aangetast door traumatisch hersenletsel (TBI), wat doelvalidatie ondersteunt via ruimtelijk opgeloste analyse van gen- en microRNA-expressie. Deze aanpak vermindert storende signalen uit heterogeen weefsel, waardoor het voorspellende vertrouwen bij het mechanistisch minimaliseren van risico's in TBI-paden toeneemt. Door regio-specifieke responsen uit hetzelfde dier te isoleren, verbetert LCM de translationele continuïteit en de triage van portfolio's in neurowetenschappelijk onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking en targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door TBI-aangedane regio's, zoals de frontale cortex en hippocampus, te isoleren voor verduidelijking van signaalpaden.
- Operationele waarde: Biedt biologisch gede-riskte validatie van targets via ruimtelijk opgeloste moleculaire analyse zonder artefacten door weefseldissociatie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door regio-specifieke veranderingen in genexpressie te koppelen aan functionele uitkomsten in executieve processen en geheugenprocessen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream genomische assays door de ruimtelijke integriteit en de oorspronkelijke positionering van hersengebieden te behouden.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays door middel van sectieproces op basis van anatomische kenmerken met behulp van een rattenhersenatlas.
- Schaalbaarheidswaarde: Maakt betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk door kwantitatieve, regio-specifieke moleculaire readouts te leveren uit discrete hersengebieden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Handhaaft de ziekterelevantie door analyse mogelijk te maken van TBI-geïnduceerde veranderingen in gen- en microRNA-expressie binnen anatomisch gedefinieerde hersengebieden.
- Preklinische continuïteit: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door longitudinale moleculaire profilering mogelijk te maken van de ontdekkingsfase tot de preklinische stadia.
- Mechanische risicoreductie: Richt zich op voorspellende waarde door causale moleculaire veranderingen in afzonderlijke regio's te isoleren in plaats van gemiddelden van het gehele weefsel.
Integratie van Pipeline & Workflow
LCM past binnen het ontdekkingscontinuüm, van targetidentificatie via leadoptimalisatie tot preklinische validatie, wat een hypothesegestuurde analyse van TBI-mechanismen in belangrijke hersengebieden mogelijk maakt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van signaalpaden door specifieke celpopulaties te isoleren uit door letsel aangetaste regio's, zoals de nucleus accumbens core en de nucleus suprachiasmaticus.
- Screening: Waarborgt de gereedheid van assays door gestandaardiseerde sectievoorbereiding op gedefinieerde bregma-coördinaten en RNase-vrije verwerking voor een betrouwbare RNA-opbrengst.
- Analytics: Levert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen, waaronder gen- en microRNA-expressieprofielen uit laser-gecapteerd weefsel.
- Translationaal Onderzoek: Verbindt fundamentele ontdekkingen met preklinisch werk door epigenetische en methyleringsanalyses na LCM mogelijk te maken, zoals beschreven in het protocol.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbare methode over verschillende ziektemodellen heen, waarbij de principes toepasbaar zijn op genomische expressiestudies in andere letsel- of ziektecontexten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid door doelvalidatie en vermindering van mechanistische ambiguïteit in de analyse van TBI-signaalpaden.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via cryostat-sectie, atlasbegeleiding en RNase-gecontroleerde workflows.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een laat stadium door het isoleren van regio-specifieke moleculaire responsen.
- Impact op portfolio: Risicogebaseerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van ruimtelijk opgeloste biomaker-uitlijning.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in neuroanatomie, cryostaatsecties en laser capture microdissectie-instrumentatie.
- Afhankelijk van RNase-vrije omgevingen, een cryostaat op -20°C, optimal cutting temperature medium en UV/IR-lasersystemen.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor kleurings-, sectieverzamelings- en cap-ladingsprotocollen over neurowetenschappelijke en moleculair-biologische teams heen.
- Aanpassingen omvatten het wijzigen van bregma-gebaseerde sectiecoördinaten voor verschillende hersenregio's en diermodellen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van nauwkeurige contaminatiecontrole en technische vaardigheid in UV-lasertracing voor volledige weefseladhesie.
