Meten van In Vivo veranderingen in extracellulaire Neurotransmitters tijdens natuurlijk belonen van gedrag in vrouwelijke Syrische Hamsters
12 september 2017
Deze paper gegevens het gebruik van vaste-potentieel amperometrische opnamen met behulp van koolstofvezel elektroden en de enzymatische biosensor technologie voor het meten van de vrijlating van dopamine en glutamaat met hoge temporele resolutie tijdens natuurlijke lonende gedrag in de vrouwelijke hamster.
Het algemene doel van deze experimentele procedure is om de afgifte van neurotransmitters te meten bij wakkere, zich gedragen dieren. Hoewel deze video een toepassing in de gedragsneurowetenschap demonstreert, met de mogelijkheid om specifieke neurotransmitterafgifte te karakteriseren in relatie tot specifieke gedragsgebeurtenissen, kan deze techniek in verschillende andere neurowetenschappelijke subdisciplines worden toegepast, zoals bij het injecteren van geneesmiddelen. Het grote voordeel van deze techniek is de turnkey-aard om bijna realtime afgifte van neurotransmitters in vivo te meten.
Begin met het injecteren van 500 microgram progesteron in 0,1 milliliter katoenzaadolie, vier uur voor de introductie van het mannetje om seksuele receptiviteit te induceren. Zorg ervoor dat elk dier aan het begin van de donkere fase van hun dagelijkse cyclus wordt getest, omdat sociale gedragingen van knaagdieren onderhevig zijn aan verandering onder wit licht en rood licht testcondities. Maak de kalibratieoplossingen vers op de dag van testen in 20 milliliter glazen centrifugeerbuisjes.
Voor de analytoplossing, los 7,4 milligram L-glutaminezuur op in 10 milliliter ultra-puur water door de buis voorzichtig om te draaien. Maak vervolgens de interferentieoplossing door 176,1 milligram AA op te lossen in 10 milliliter ultra-puur water. Zet de kalibratie op door een magnetische roerder op de basis van een eenvoudige laboratoriumringstandaard te plaatsen.
Plaats een 20 milliliter gemantelde beker bovenop de magnetische roerder en klem op zijn plaats met een middelgrote klemmen met twee uitsteeksels. Verbind de gemantelde beker met een circulerend waterbad om de bufferoplossing op 37 graden Celsius te verwarmen. Voeg een magnetische roerbar en 20 milliliter 100 millimolair fosfaatgebufferd zoutwater, of PBS, toe aan de gemantelde beker.
Plaats vervolgens de sensorkalibratiehouder bovenop de gemantelde beker en zet een vierkanaals kalibratiepre-versterker bovenop, bevestig deze met een rechte hoekklem. Verbind vervolgens de pre-versterker met een dataconditionerings- en acquisitieapparaat om kalibratiegegevens op te nemen. Test de gevoeligheid van elke enzymatische biosensor voor glutamaat vóór de experimentele opname door de sonde in de kalibratiehouder te plaatsen, bovenop een gemantelde beker, en het sensorgedeelte en een deel van de zilverchloride referentiedraad in de bufferoplossing onder te dompelen.
Start een nieuwe opname op de computerinterface met behulp van gratis te downloaden acquisitiesoftware. Verbind vervolgens elke te testen sensor met een poort op een vierkanaals kalibratiepre-versterker. Laat de sensoren een stabiele basislijn bereiken.
Begin met het toevoegen van de analytinjecties wanneer de sensoren een stabiele basislijn hebben bereikt. Gebruik het gat in de kalibratiehouder om een pipettip in de bufferoplossing te introduceren. Gebruik vervolgens de sneltoets-annotatietool in de opnamesoftware om te annoteren wanneer een injectie wordt gemaakt.
Maak vervolgens 10 micromolaire injecties van glutamaat door 40 microliter van de analytoplossing in de bufferoplossing te pipetten. Wacht tot de sensor is gestabiliseerd tussen toevoegingen. Voeg vervolgens drie injecties van de analytoplossing toe voordat u een enkele injectie van de interfererende AA-oplossing toevoegt.
Bekleed de testkamer met beddengoed uit de kooibuis van het dier. Verwijder de occlusieve obdurator van de geleidingscanule en voer ofwel de koolstofvezel elektrode of de enzymatische sonde door de geleidingsschacht. Verbind de sensor met het opnamesysteem.
Stabiliseer vervolgens de sensorverbinding door een speldbevestiging op de hoofdmontage te schroeven. Plaats vervolgens het dier in de testkamer. Begin met het opnemen van de video en tijdgebonden amperometrisch signaal in het softwareprogramma.
Laat de sensor zich eerst in de hersenen evenaren voordat experimenteel testen. Introduceer vervolgens een stimulusmannetje in de testkamer. Na de eerste berging met penile insertie door het stimulusmannetje, blijf u gedurende 10 tot 30 minuten verder opnemen, afhankelijk van de experimentele doelen.
Ten slotte, na gedragstesten, koppelt u de vrouwelijke sensor los. Verwijder beide hamsters uit de testkamer, evenals de beddengoed, om de kamer schoon te maken met 70% ethanol. Begin met het bekijken en annoteren van de video's, met behulp van gratis commercieel te downloaden software, in slow motion om gedragingen nauwkeurig te coderen die tijdgebonden zijn aan het amperometrisch signaal.
Annoteer Start Lordosis in het frame wanneer het vrouwtje een dorsiflexie van haar rug initieert en haar staart omhoog buigt. Annoteer Einde Lordosis wanneer het vrouwtje deze houding beëindigt, wat vaak gebeurt wanneer het vrouwtje zich heroriënteert naar een andere locatie in de testkamer. Annoteer vervolgens Start AI wanneer het vrouwtje in de lordosehouding is en het mannetje zijn snuit richting het anogenitale gebied van het vrouwtje beweegt, waarbij snuffelen, likken of neuzelen van haar perinale gebied kan voorkomen.
Annoteer Einde AI wanneer het mannetje zijn snuit verwijdert uit de nabijheid van het anogenitale gebied van het vrouwtje. Annoteer vervolgens Start Berging wanneer het mannetje nadert en zijn voorpoten op het vrouwtje plaatst in een berende houding, ongeacht de oriëntatie van de berende poging. Annoteer eveneens Start Intromissie wanneer succesvol duwen de berende mannetje peniele toegang tot de vagina van het vrouwtje verschaft.
Annoteer eventueel Ejaculeer, wat kan worden opgemerkt door een tredbeweging met de achterpoot van het mannetje. Annoteer tenslotte Einde Intromissie en Einde Berging gelijktijdig in het frame wanneer het mannetje zijn voorste twee poten heeft verwijderd en dus geen contact meer heeft met het vrouwtje. Vanwege het vaak onvermogen om zijn terugtrekking te visualiseren, codeer deze twee gedragingen gelijktijdig om consistentie en betrouwbaarheid over meerdere paringspogingen heen mogelijk te maken.
Onder het tabblad bestand, selecteert u de Export functie en kiest u het TSV-tabblad om de spanningsmetingen op te slaan als een TSV-extensiebestand.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de meting van de afgifte van dopamine en glutamaat tijdens natuurlijk beloningsgedrag bij vrouwelijke hamsters met behulp van vast-potentiaal amperometrische registraties en enzymatische biosensortechnologie. De techniek maakt een hoge temporele resolutie van neurotransmitterdynamiek in wakker, behagend gedrag vertonende dieren mogelijk, wat inzicht biedt in de gedragsneurowetenschappen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsneurowetenschappen
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Dopamine en glutamaat spelen een cruciale rol in beloningsmechanismen.
- De meting van de afgifte van neurotransmitters kan bijdragen aan het begrip van gedrag.
- Technologieën met een hoge temporele resolutie verbeteren de experimentele precisie.
Doel van de studie
- Om de afgifte van neurotransmitters te karakteriseren in relatie tot specifieke gedragsgebeurtenissen.
- Om gedragsreacties tijdens de paring bij vrouwelijke hamsters te onderzoeken.
- Om het nut van enzymatische biosensortechnologie in wakker animals aan te tonen.
Gebruikte methoden
- De gebruikte technieken omvatten amperometrische opnames met een vaste potentiaal met gebruik van koolstofvezelelektroden.
- De experimentele opstelling hield in dat het responsgedrag bij vrouwelijke hamsters werd gemonitord na hormoon-geïnduceerde seksuele ontvankelijkheid.
- Belangrijke stappen waren het voorzichtig omgaan met blootstelling aan licht en de tijdige kalibratie van de sensorsystemen.
- Gedragsobservaties werden gesynchroniseerd met de amperometrische signalen voor een nauwkeurige analyse.
Belangrijkste resultaten
- De studie beschrijft effectief de afgifte van neurotransmitters tijdens paringsgedrag, waarbij de nadruk ligt op de temporele dynamiek.
- Er werd specifiek melding gemaakt van inzichten over de vluchtigheid van dopamine in relatie tot de paring.
- Gedragsannotaties boden duidelijke correlaties tussen fysiologische metingen en waargenomen handelingen.
Conclusies
- Dit werk demonstreert een betrouwbare methode om neurotransmitterdynamiek tijdens gedrag te registreren.
- Inzicht in de timing van de afgifte van neurotransmitters vergroot het begrip van reproductief gedrag.
- Deze bevindingen kunnen bijdragen aan bredere toepassingen binnen de gedragsneurowetenschappen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het meten van real-time neurotransmitterdynamiek tijdens natuurlijk gedrag maakt een mechanische risicoreductie van hypotheses over targets in onderzoek naar beloningspaden mogelijk. Deze aanpak ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen door neurochemische veranderingen te koppelen aan specifieke gedragsgebeurtenissen. De technologie faciliteert translationele continuïteit van de ontdekkingsfase tot de preklinische validatie van CNS-modulerende verbindingen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door dopamine- en glutamaattransiënten te correleren met specifieke gedragsgebeurtenissen, zoals vaginale insertie.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via gelijktijdige meting van electroactieve en niet-electroactieve neurotransmitters in wakker, behandelde modellen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door kwantitatieve, tijdgekoppelde neurochemische readouts te bieden die het werkingsmechanisme tijdens beloningsgerelateerd gedrag verduidelijken.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biosensorsystemen voor op downstream screening door het vaststellen van kalibratieprotocollen voor de detectie van glutamaat en dopamine.
- Operationele waarde: Levert standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays via vaste-potentiaal amperometrie en enzymatische biosensing met temperatuurgecontroleerde buffersystemen.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt het hergebruik van het platform over verschillende gedragsparadigma's dankzij de kant-en-klare sensorvoorbereiding en data-acquisitieworkflow.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Demonstreert het nut van het systeem voor ziekte-relevant onderzoek door de afgifte van neurotransmitters te meten tijdens natuurlijk belonend seksueel gedrag bij vrouwelijke hamsters.
- Preklinische continuïteit: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door neurochemische transiënten te correleren met specifieke fasen van het paringsgedrag (bijv. intromissie, ejaculatie).
- Mechanische risicoreductie: Vermindert onduidelijkheid over target-engagement door directe real-time meting van neurotransmitter-dynamiek in vivo te bieden.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetesten via lead-identificatie tot preklinische validatie, door temporeel nauwkeurige neurochemische gegevens te leveren die gekoppeld zijn aan gedrag.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door de afgifte van dopamine en glutamaat te meten tijdens specifieke gedragsepochen in de nucleus accumbens.
- Screening: Waarborgt de gereedheid van de assay door het vaststellen van een stabiele baseline en de validatie van de injectie van analyten voorafgaand aan de gedragsregistratie.
- Analytics: Genereert kwantitatieve, tijdgekoppelde metingen die vergelijking van neurochemische responsen mogelijk maken tussen gedragscondities en experimentele groepen.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt fundamenteel onderzoek met preklinisch werk door het aantonen van de bruikbaarheid in een natuurlijk belonend gedragsparadigma dat relevant is voor motivationele en beloningscircuits.
- Enterprise Reuse: Dient als een herbruikbare methode voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op de afgifte van neurotransmitters in meerdere gedragsmodellen en studies naar geneesmiddeltoediening.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit te verminderen via directe meting van de transiëntie van neurotransmitters.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid via gekalibreerde enzymatische biosensoren en constant-potentiaal amperometrie met temperatuurcontrole.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door neurochemische data te leveren die gesynchroniseerd zijn met het gedrag, waardoor target-interactie en pathway-modulatie worden verduidelijkt.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk door neurochemische dynamiek te koppelen aan specifieke gedragsuitkomsten, waardoor biologische risico's in een late fase van CNS-medicijnontwikkeling worden verminderd.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stereotactische chirurgie, sensorkalibratie en methodologieën voor gedragsneurowetenschappen.
- Benodigt instrumentatie, waaronder apparatuur voor data-conditionering en acquisitie, circulerende waterbaden voor het handhaven van de buffer op 37°C en vierkanaals voorversterkers.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de sensorvoorbereiding, protocollen voor gedragsannotatie en data-exportprocedures (TSV naar XLS/XLSX).
- Omvat overwegingen voor adaptatie over verschillende modelsystemen, inclusief testcondities voor de licht/donkercyclus en protocollen voor hormoonpriming.
- Bevat praktische beperkingen zoals de duur van de sensorstabiliteit, de noodzaak voor functionele validatie vóór de opname en een toename in complexiteit bij gelijktijdige opname met dubbele probes.
