Name: De analyse van de promotor van de plant: Identificatie en karakterisering van Root knobbeltje specifieke promotor in de gemeenschappelijke Boon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Leer hoe je knol-specifieke promotoren in gewone bonen identificeert en karakteriseert met behulp van Agrobacterium rhizogenes-geïnduceerde harige wortels. Deze methode versnelt de inductie en verbetert de studie naar genexpressiepatronen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd slechts gedeeltelijk ondersteund door de Dirección General de Asuntos del persoonlijke Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (verlenen neen. IN219916 M.L en IA205117 aan M-K. A) en de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnològia (CONACYT subsidie no. 240614 voor de M.L.).

1. identificatie, isolatie en klonen van P. Vulgaris NIN promotor
<ol>
	<li>Het identificeren van de opeenvolging van de promotor voor het gen van belang. Er zijn verschillende genoom databases en analysetools beschikbaar voor planten zoals Phytozome, Ensembl planten, NCBI, etc. A peulvrucht promotor P. vulgaris NIN (PvNIN; Phvul.009G115800) werd gebruikt in deze studie20.</li>
	<li>Ontwerp oligos voor Gateway of traditionele restrictie-enzym klonen afhankelijk van het vector-systeem gebruikt (figuur 1A). Opmerking: Standaard (25-35 bp), ontzout inleidingen werken prima. Omgekeerde oligo-sequenties die flank tussen de promotor en de gene zijn aan te raden.</li>
	<li>Versterken van het PvNIN promotor regio (of de regio van de promotor van het gen van belang) vanaf vers geïsoleerde P. vulgaris genomic DNA met behulp van de promotor-specifieke oligo-set. Een polymerase van HiFi-gebruiken met de volgende PCR voorwaarden: 95 ° C gedurende 5 minuten; 30 cycli (95 ° C gedurende 30 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 1 min); en 72 ° C gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Voer het versterkte fragment op 1% agarose gel op 60 V op een 7 x 10 cm gel dienblad en elueer de overeenkomstige amplicon (700 bp, figuur 1B) en kloon in de pENTR/D-TOPO vector volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Transformeren 2 µL van de reactie in bevoegde Escherichia coli cellen met behulp van de instructies van de fabrikant en de plaat 150 µL van het mengsel van de transformatie op lysogenie brother (LB) aangevuld met 50 mg/L kanamycine (Kan50). Groeien de vergulde cellen bij 37 ° C's nachts.</li>
	<li>Kies de koloniën en de cultuur die hen overnachting in LB opslagmedium met Kan50 3-6. Isoleren van de plasmide DNA met behulp van de methode van keuze en analyseren van de plasmide door PCR met behulp van de vector specifieke M13 oligos. Voor PCR, gebruik 100 ng van plasmide, 0. 15.00 uur van oligos, 10 X PCR buffer, 0,5 U polymerase van DNA Taq, en 10 mM dNTPs.</li>
	<li>Gebruik de volgende PCR versterking voorwaarden; 95 ° C gedurende 3 min; 30 cycli (95 ° C gedurende 30 s, 58 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 75 s); en 72 ° C gedurende 7 min. visualiseren de PCR producten op een 1% agarose gel. Zorg ervoor dat de juiste invoegingen een band op 1024 bp en vectoren zonder tussenvoegsels zullen hebben een 324 bp band (Figuur 1 c).</li>
	<li>Het uitvoeren van de LR-reactie tussen een vermelding vector (pENTR/D-TOPO-PvNIN) en de bestemming vector pBGWFS7.021 met behulp van een mix van commerciële enzym volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Transformeren 2 µL van LR reactie in bevoegde E. coli cellen met standaardtechnieken, zoals beschreven in de instructies van de fabrikant en de plaat 150 µL van het mengsel van de transformatie op LB aangevuld met 100 mg/L spectinomycine (Spe100). Groeien de vergulde cellen bij 37 ° C's nachts.</li>
	<li>Neem ongeveer 5 kolonies en cultuur ze 's nachts in LB opslagmedium met Spe100. Isoleren van de plasmide DNA met behulp van een methode van keuze en analyseren van de plasmide door PCR met behulp van de promotor-specifieke oligos.</li>
	<li>Gebruik de PCR voorwaarden in stap 1.3. Visualiseer de PCR producten op een 1% agarose gel te bevestigen versterking. Waarbij zijn 700 bp.</li>
	<li>Het volgnummer van de positieve plasmide pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (Figuur 1 d) met de promotor-specifieke oligos te controleren van de echtheid van het donormateriaal.</li>
	<li>De plasmiden omvormen A. rhizogenes stam K599 (echter andere stammen van A. rhizogenes kunnen worden gebruikt). 2 µL van de plasmide prep toevoegen aan 50 µL van electrocompetent cellen en electroporate in een cuvet van 1 mm met de volgende instellingen: 1.8 kV, 25 µF en 200 Ω.</li>
	<li>Herstellen van cellen in ~ 500 µL van SOC medium en schudden bij 28 ° C gedurende 2 h. plaat op LB-Spe100 en groeien bij 28 ° C gedurende 2 dagen.</li>
	<li>De PCR voorwaarden zoals in stap 1.3 en kolonie screening uitgevoerd zoals vermeld in stap 1.7. Maak glycerol voorraden van positieve klonen en sla ze op-80 ° C.</li>
	<li>Gebruik van A. rhizogenes cultuur herbergen lege pBGWFS7.0 vector als de negatieve controle.</li>
</ol>
2. A. Rhizogenes getransformeerd harige wortels van de gemeenschappelijke Boon
<ol>
	<li>Steriliseren bean (P. vulgaris cv. Negro Jamapa) zaden (ongeveer 20) in 50 mL 96% ethanol voor 1 min en negeren de ethanol; dan Voeg 50 mL 20% bleekwater (natriumhypochloriet) gedurende 10 minuten, met constante mengen in een laminaire flow-kap. Verwijder het bleekmiddel en wassen in overmaat steriel water 3 keer. Opmerking: Andere cultivars P. vulgaris kunnen worden gebruikt voor de harige wortel inductie.</li>
	<li>Ontkiemen van de gesteriliseerde zaden op steriele filtreerpapier bevochtigd met Broughton &#38; Dilworth (B &#38; D) oplossing22 (tabel 1) voor 2 dagen in het donker bij 28 ° C.</li>
	<li>De dag voordat transformatie voorbereiding van de volgende handelingen uit:
	<ol>
		<li>Strijk uit 150 µL van A. rhizogenes cultuur herbergen de binaire vector (bereid in stappen 1.13 en 1.14) op solide LB Spe100 en groeien bij 28 ° C's nachts.</li>
		<li>Vullen van een tube van 15 mL met B &#38; D oplossing en vervangen de schroefdop met dubbele gelaagde aluminiumfolie. Dit samenvoegen tot een 22 cm glazen buis met 10 mL B &#38; D oplossing (figuur 2C) en autoclaaf het.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Op de dag van transformatie, assembleren de volgende steriele materialen in een laminaire flow hood: gekiemde zaden uit stap 2.2, cultuur plate uit stap 2.3.1, buizen uit stap 2.3.2, steriele dubbel gedestilleerd water (10 mL), pipetten en Pipetteer tips, steriel pincet, en 3 mL spuiten.</li>
	<li>Gebruik een gebogen 200 µL tip om schrapen A. rhizogenes cellen van de plaat in een microcentrifuge buis en resuspendeer in 1 mL van de dubbele steriel water. Op dezelfde manier bereiden vector controle cellen afzonderlijk.
	<ol>
		<li>Meng de cellen zachtjes aan resuspendeer. Doen niet vortex.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Maak een gat van 3 mm op de aluminiumfolie van de buizen uit stap 2.3.2 met behulp van een steriele pipette uiteinde.</li>
	<li>Verzamelen van de cellen (promotor of vector control) uit stap 2.5 met de spuit en lichtjes prikken de hypocotyls van de ontkiemde zaden met het topje van de naald (Figuur 2 g). Opmerking: Zorg ervoor dat de naald (4 - 6 maal) het vaatweefsel doordringt en injecteren kleine (~ 5 µL) druppels de cellen op de wond op verschillende posities rond de hypocotyl.</li>
	<li>Steek voorzichtig de wortels van de geïnjecteerde zaailingen in het gat van 3 mm van de tube van 15 mL met B &#38; D oplossing. Terug de volledige opstelling in de 22 mL glazen buizen en verzegelen om vochtigheid.</li>
	<li>Incubeer de buizen in een zaal van de groei onderhouden bij 28 ° C met 16 h licht: 8 h donkere fotoperiode. Opmerkingen: 3-4 dagen na een incubatieperiode van, de planten groeien aan de rand van de 22 mL glazen buizen.</li></ol>In dit stadium, verwijderen de caps en verzegel de rand met parafilm rond de stengel zoals weergegeven in figuur 2I.
	<li>Observeren van de eelt op de verwonding sites op 5-7 dagen, en vinden ~ 2 cm harige wortels door 10-12 dagen na de transformatie. Opmerking: Het is belangrijk om de B &#38; D oplossing voortdurend in zowel kunststof als glazen buizen.</li>
	<li>Na 2 weken, de primaire hoofdmap verwijderen door het snijden van de stengel 2 cm onder de harige wortels en planten van de primaire wortels in potten met steriele vermiculiet. Handhaven van de planten in een zaal van de groei (16 h licht: 8 h donker bij 28 ° C) en irrigeren met B &#38; D oplossing.</li>

3. de promotor analyse: NIN promotor expressie in rhizobiale knobbeltjes van de gemeenschappelijke Boon
<ol>
	<li>Voor de inductie van wortel knobbeltjes, beënten Rhizobium tropici of Rhizobium etli (die compatibel zijn met de gemeenschappelijke bean) in 100 mL PY medium (0,5 g pepton, 0,3 g gistextract) aangevuld met 700 mM CaCl2 en 20 mg mL−1 nalidixic zuur. Incubeer bij 30 ° C gedurende 24 uur met schudden op 300 rpm. Opmerking: Elke specifieke antibiotica kunnen worden gebruikt in het geval van transgene Rhizobium.</li>
	<li>De cellen in een centrifuge voor 3 min bij 2.800 x g bij kamertemperatuur pellet en resuspendeer in 10 mL 10 mM MgSO4. Pas de OD van cellen aan 0.6 bij OD600 door verdunning met 10 mM MgSO4.</li>
	<li>Inoculeer 1-2 mL van de cultuur (bereid uit stap 3.2) per plant (promotor zowel vector control) voor het opwekken van knobbeltje groei op de harige wortels. Bevloeiing van de planten met B &#38; D oplossing met beperkt stikstof (2 mM KNO3) ter bevordering van nodulatie.</li>
	<li>Afhankelijk van de experimentele behoefte, verzamelen de harige wortels op verschillende tijdstippen. Verzamelen van de monsters voor de studie van infectie draden tussen 3-5 dagen post inoculatie (dpi). Opmerking: Primordiale knobbeltje en jonge knobbeltjes kunnen worden bestudeerd op 6-9 dpi en 10-12 dagen dpi, respectievelijk. Ten slotte, volwassen en functionele knobbeltjes kunnen worden bestudeerd op 14-21 dpi en senesced knobbeltjes op &#62; 28 dpi.</li>
	<li>Verwerk de wortel/knobbeltjes voor de activiteit van verslaggever genen (GUS of GFP). GUS activiteit volgens het protocol beschreven door Jefferson23te analyseren. Observeren GFP onder een fluorescentie Microscoop. GFP fluorescentie prikkelen met een blauwe argon ion laser (488 nm), en het verzamelen van de uitgestoten fluorescentie van 510 tot 540 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+promoters+and+cis-actingregulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements.</a> Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).</li>
<li>Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+Thirst+for+Genome+Sequencing%2C+Data+Interpretation%2C+and+Database+Usage+in+Genomic+Era%3A+The+Road+towards+Fast-Track+Crop+Plant+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+Research+International%22%5BJournal%5D)">Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement.</a> Genetics Research International. , 684321(2015).</li>
<li>Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplast+isolation%2C+transient+transformation+of+leaf+mesophyll+protoplasts+and+improved+Agrobacterium-mediated+leaf+disc+infiltration+of+Phaseolus+vulgaris%3A+Tools+for+rapid+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis.</a> BMC Biotechnol. 16 (1), 53(2016).</li>
<li>Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+localization+of+a+symbiosis-specific+phosphate+transporter+is+mediated+by+a+transient+reorientation+of+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).</li>
<li>Kryvoruchko, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MtSWEET11%2C+a+Nodule-Specific+Sucrose+Transporter+of+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).</li>
<li>Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulation+of+cortical+cell+division+during+root+nodule+development+in+Lotus+japonicus+is+accompanied+by+auxin+response%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response.</a> Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).</li>
<li>Suzaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoreduplication-mediated+initiation+of+symbiotic+organ+development+in+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus.</a> Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).</li>
<li>Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-affinity+phosphate+transporter+GmPT5+regulates+phosphate+transport+to+nodules+and+nodulation+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean.</a> Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).</li>
<li>Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Functional+Analysis+of+a+Novel+Group+of+Legume-specific+WRKY+and+Exo70+Protein+Variants+from+Soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean.</a> Sci Rep. 6, 32090(2016).</li>
<li>Montiel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Phaseolus+vulgaris+NADPH+oxidase+gene+is+required+for+root+infection+by+Rhizobia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia.</a> Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).</li>
<li>Arthikala, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PvRbohB+negatively+regulates+Rhizophagus+irregularis+colonization+in+Phaseolus+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris.</a> Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).</li>
<li>Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RbohB+a+Phaseolus+vulgaris+NADPH+oxidase+gene%2C+enhances+symbiosome+number%2C+bacteroid+size%2C+and+nitrogen+fixation+in+nodules+and+impairs+mycorrhizal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization.</a> New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).</li>
<li>Barraza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+PvTRE1+enhances+nodule+biomass+and+bacteroid+number+in+the+common+bean%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean.</a> New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).</li>
<li>Estrada-Navarrete, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autophagy-related+kinase+is+essential+for+the+symbiotic+relationship+between+Phaseolus+vulgaris+and+both+rhizobia+and+arbuscular+mycorrhizal+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi.</a> Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).</li>
<li>Nanjareddy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Legume+TOR+Protein+Kinase+Regulates+Rhizobium+Symbiosis+and+Is+Essential+for+Infection+and+Nodule+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development.</a> Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).</li>
<li>Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter+of+the+Vicia+faba+L.+gene+VfEnod12+encoding+an+early+nodulin+is+active+in+cortical+cells+and+nodule+primordia+of+transgenic+hairy+roots+of+Vicia+hirsuta+as+well+as+in+the+prefixing+zone+II+of+mature+transgenic+V.+hirsuta+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules.</a> Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).</li>
<li>Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+Sesbania+rostrata+leghemoglobin+glb3+gene+5%27-upstream+region+in+transgenic+Lotus+corniculatus+and+Nicotiana+tabacum+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants.</a> Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).</li>
<li>Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+network+governing+nodule+organogenesis+and+infection+in+the+model+legume+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus.</a> Nat Commun. 12, 1-10 (2010).</li>
<li>Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaseolus+vulgaris+RbohB+functions+in+lateral+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development.</a> Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).</li>
<li>Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+expressed+genes+in+mycorrhized+and+nodulated+roots+of+common+bean+are+associated+with+defense%2C+cell+wall+architecture%2C+N+metabolism%2C+and+P+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0182328(2017).</li>
<li>Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).</li>
<li>Broughton, W. J., Dilworth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+leghemoglobin+synthesis+in+snake+beans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Control of leghemoglobin synthesis in snake beans.</a> Biochem J. 125 (4), 1075-1080 (1971).</li>
<li>Jefferson, R. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1178271/">Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system.</a> Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).</li>
<li>Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+induction+of+soybean+hairy+roots+and+propagation+of+the+soybean+cyst+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode.</a> Planta. 210 (2), 195-204 (2000).</li>
<li>Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Composite+Plants+in+Medicago+truncatula+used+for+Nodulation+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2633(2011).</li>
<li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+expression+of+hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+roots+and+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules.</a> Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).</li>
<li>Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.bio-protocol.org/e795">Hairy Root Transformation in Lotus japonicus.</a> Bio-protocol. 3 (12), e795(2013).</li>
<li>Jacobs, T. B., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+CRISPR+Vector+Construction+and+Characterization+of+DNA+Modifications+by+Generation+of+Tomato+Hairy+Roots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots.</a> J. Vis. Exp. (110), e53843(2016).</li>
<li>Estrada-Navarrete, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-transformation+of+the+Phaseolus+spp.%3A+a+tool+for+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics.</a> Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Tijdens de functionele analyse van genen speelt de studie van gen-expressiepatronen een cruciale rol in het begrijpen van de ruimtelijke en temporele regulering van de genen in vivo. Een bekende methode om te studeren van gen-expressiepatronen is te klonen van het gen promotor regio van belang, stroomopwaarts aan verslaggever genen zoals fluorescerende markers (GFP, RFP, enz.) of β-glucuronidase. Wij hebben hierin een regio van de promotor van de wortel knobbeltje symbiose (RNS) specifiek gen, NIN, te b...

Initiatiefnemers zijn belangrijke moleculaire biologische instrumenten een cruciale rol spelen in het begrijpen van de regulering van de expressie van genen van belang. Initiatiefnemers zijn opeenvolgingen van DNA, stroomopwaarts gelegen van de vertaling initiatie codon van gen-sequenties en zij dragen de centrale wettelijk verplichte informatie van genen; Daarom zijn hun juiste annotatie en karakterisering van vitaal belang voor het begrip van de genfunctie. Afhankelijk van de expressiepatronen, worden de initiatiefnemers van de plant geclassificeerd als constitutief, weefsel-specifiek, of ontwikkeling-fase-specifieke en afleidbare1. Voorschotten in transcriptomic technologieën, verbeteringen in computer modeling en de beschikbaarheid van het toenemend aantal genoom sequenties voor verschillende plantensoorten hebben vergemakkelijkt de grootschalige voorspelling van promotor sequenties2.
Aan de andere kant, is het ook kritisch promotor evaluatie-instrumenten en genetische transformatie technieken die snelle, efficiënte en reproduceerbare zijn vast te stellen. In tegenstelling tot de andere model planten, wordt de functionele karakterisering van gemeenschappelijke bean peulvruchten (P. vulgaris) genen belemmerd voornamelijk vanwege de recalcitrante aard van Phaseolus sp. voor stabiele genetische transformatie. Voorbijgaande transformatie systemen dienen als alternatief voor snelle gene functionele karakterisering studies3. De interactie tussen de peulvrucht waardplant en rhizobiale bacterie is in peulvruchten symbiose onderzoek, een van de meest hanteerbare modelsystemen voor de functionele analyse van knobbeltje-specifieke genen en promotor studies. Tot nu toe verschillende peulvrucht initiatiefnemers aan deze symbiose gerelateerde geweest gekenmerkt, namelijk, Medicago truncatula PT44, SWEET115, Lotus japonicus Cyclops, UBQ6, VAG17, Glycine max PT5 8, Exo70J9, P. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, enz. CIS genregulatie rechtstreeks van invloed zijn elementen. De transcriptiefactor ENBP1A bindt aan een Cis regelgevende regio (−692 bp) van vroege nodulin VfENOD12, en dit vergemakkelijkt de expressie van een verslaggever gen in knobbeltje primordia Vicia faba16. Vervanging van Cis regelgevende regio's (−161 met −48 bp) van de promoter knobbeltje-specifieke leghemoglobin GLB3 met het heterologe afgekapt initiatiefnemers δ-p35S en δ-pNOS, resulteerde in een verlies van knobbeltje specificiteit en verminderd promotor activiteit17 .
Eerdere verslagen tonen aan dat de transcriptiefactor NIN is vereist voor de opening van rhizobiale infectie in de haarcellen van wortel en is eveneens essentieel voor knobbel organogenese van L. japonicus18. In de huidige studie beschrijven we een protocol voor identificatie, isolatie, klonen en karakterisering van knobbeltje-specifieke promotor in de gemeenschappelijke bean harige wortels. Om dit te bereiken, we een rhizobiale symbiose-specifieke NIN promotor van P. vulgaris geselecteerd en gekloond in een transcriptionele fusie aan de chimeer verslaggever GUS-enhanced::GFP. Dit protocol beschrijft verder een snelle en veelzijdige systeem van genetische transformatie in de P. vulgaris met behulp van A. rhizogenes geïnduceerde harige wortels. Dit systeem produceert harige wortels in minder dan 2 weken na de transformatie. Tot slot, wij beoordeeld de spatio uitdrukking van NIN promotor in de knobbeltjes van de wortel van Rhizobium gekoloniseerd door GUS kleuring.
De hier beschreven procedure wellicht nuttig niet alleen voor de studie van nodulatie en mycorrhization11 van peulvruchten planten, maar ook voor de studie van de promotor-expressiepatronen in wortels19. Dit protocol is bovendien makkelijk te gebruiken in niet-gespecialiseerde laboratoria.

<table><tbody><tr><td>Primers voor qRT-PCR-assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pNIN Forward</td><td>CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pNIN Reverse</td><td>CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13 Forward</td><td>GTA AAA CGA CGG CCA G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13 Reverse</td><td>CAG GAA ACA GCT ATG AC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>REAGENTIA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K243520</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Enzyme Mix&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791100</td><td></td></tr><tr><td>pBGWFS7.0&nbsp;</td><td>Plant systems biology</td><td>https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10966018</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Pfx DNA Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>11708013</td><td></td></tr><tr><td>Certified Molecular Biology Agarose</td><td>Bio-Rad</td><td>1613102</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625-250G</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriologische agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin sulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1441</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriologische pepton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0556</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Nalidixinezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Gel-laadoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7654</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>APPARATUUR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sigma</td><td>Sigma 1-14K</td><td></td></tr><tr><td>Geldocumentatie-eenheid</td><td>Carestream</td><td>Gel Logic 212 PRO</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC</td><td>Thermo scientific</td><td>EW-51708-70</td><td></td></tr><tr><td>Plantengroeikam</td><td>MRC</td><td>PGI-550RH</td><td></td></tr><tr><td>Horizontaal laminaire luchtstroomkast</td><td>Lumistell</td><td>LH-120</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Leica</td><td>DM4500 B</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>sym laboratorios</td><td>90X15</td><td></td></tr><tr><td>Scalpelmes</td><td>Fisher scientific</td><td>53223</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15mL conische centrifugeerbuisjes</td><td>Fisher scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>22 mL glazen buizen</td><td>Thomas scientific</td><td>45048-16150</td><td></td></tr></tbody></table>

de analyse van de promotor van de plant: identificatie en karakterisering van root knobbeltje specifieke promotor in de gemeenschappelijke boon

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

De upstream sequenties van een gen dat codeert sequenties worden genoemd als promotor sequenties. Bestuderen van de expressiepatronen van de initiatiefnemers zijn zeer belangrijk in het begrijpen van de genexpressie en de spatio-expressiepatronen van doelgenen. Aan de andere kant, is het ook kritisch promotor evaluatie-instrumenten en genetische transformatie technieken die snelle, efficiënte en reproduceerbare zijn vast te stellen. In deze studie onderzochten we de spatio-expressiepatroon van de promotor van de rhizobiale symbiose-specifieke knobbeltje-oprichting (NIN) van Phaseolus vulgaris in de transgene harige wortels. Met behulp van plant genoom databases en analysetools we geïdentificeerd, geïsoleerd, en de promotor P. vulgaris NIN in een transcriptionele fusie aan de chimeer verslaggever gekloond β-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Dit protocol beschrijft verder een snelle en veelzijdige systeem van genetische transformatie in de P. vulgaris met Agrobacterium rhizogenes geïnduceerde harige wortels. Dit systeem genereert ≥2 cm harige wortels op 10 tot 12 dagen na de transformatie. Vervolgens beoordeeld wij de spatio uitdrukking van NIN promotor in Rhizobium geïnoculeerd harige wortels van na inoculatie met regelmatige tussenpozen. Onze resultaten afgebeeld door GUS activiteit tonen aan dat de promotor NIN actief tijdens het proces van nodulatie was. Samen, het huidige protocol laat zien hoe identificeren, isoleren, klonen en karakteriseren van de promotor van een plant in de gemeenschappelijke bean harige wortels. Dit protocol is bovendien makkelijk te gebruiken in niet-gespecialiseerde laboratoria.

Het doel van deze studie was om te beoordelen van de spatio-expressiepatroon van knobbeltje-specifieke P. vulgaris NIN. Om dit te doen, een 700 bp gebied stroomopwaarts van de vertaling initiatie codon van de NIN -gen werd geselecteerd en een set van oligos werd ontworpen, zoals afgebeeld in figuur 1A. Met behulp van een hifi-polymerase, het fragment van de promotor NIN werd versterkt, geïsoleerd (figuur 1B) en ...

Promotor expressie analyses zijn cruciaal voor de verbetering van het begrip van genexpressie en de spatio uitdrukking van de doelgenen. Hierin presenteren wij een protocol om te identificeren, isoleren en klonen van een plant promotor. Verder, beschrijven we de karakterisatie van de knobbel-specifieke promotor in de gemeenschappelijke bean harige wortels.

De analyse van de promotor van de plant: Identificatie en karakterisering van Root knobbeltje specifieke promotor in de gemeenschappelijke Boon

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Harige wortels worden gebruikt om getransformeerde wortels in Phaseolus te verkrijgen met een reporterconstruct. De resulterende transgene wortels worden gebruikt om de expressie van het reportergen te onderzoeken. Studies naar promotorexpressie zijn cruciaal voor het begrijpen van de spatiotemporele expressiepatronen van genen.Vandaag gaan we de methodologieën voor de inductie van haarwortels demonstreren en de expressiepatronen van promoters bestuderen in transgene haarwortels onder symbiotische omstandigheden van wortelknolletjes in Phaseolus. Estrada-Navarrete en collega's hebben eerder een door Agrobacterium rhizogenes geïnduceerd haarwortelsysteem in Phaseolus opgezet. De huidige methode zal helpen de duur van de haarwortelinductie te versnellen en daarmee de veelzijdigheid van het systeem te verbeteren.De procedures zullen worden gedemonstreerd door mijn collega Manoj-Kumar Arthikala en bachelorstudenten Alma Leticia en Brenda Mariana uit mijn laboratorium. Begin met het zoeken naar de NIN-gensequentie in de genome-database van Phaseolus vulgaris van Phytozome, en selecteer de vereiste lengte van de sequentie stroomopwaarts van ATG. Ontwerp de oligonucleotiden na een passend

plant-promoter-analysis-identification-characterization-root-nodule

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Laten we zien hoe harige wortel composiet planten kunnen worden gebruikt om de plant-Rhizobium interacties en nodulatie studie in het moeilijk te transformeren...

Genereren van Composite Planten in Medicago truncatula Gebruikt voor nodulatie Assays

Het Lateral Root Inducible System (LRIS) maakt gelijktijdige inductie van laterale wortels mogelijk en wordt gepresenteerd voor Arabidopsis thaliana en maïs.

Laterale Root Induceerbare System in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; En maïs

We ontwikkelden een eenvoudige en efficiënte protocol voor de voorbereiding van grote hoeveelheden soja protoplasten om te studeren van de ingewikkelde regelgeving en signalering mechanismen in levende cellen.

Een eenvoudige methode voor het isoleren van soja protoplasten en toepassing op voorbijgaande gen expressie Analyses

Het doel van het hier gepresenteerde protocol is het bestuderen van de reactie van de transcriptomic van endosphere-geïsoleerde Bacillus mycoides op aardappel wortel exsudaat. Deze methode vereenvoudigt de identificatie van belangrijke bacteriële genen die betrokken zijn in plant-microbe interacties en is in principe van toepassing op andere endofyten en planten, met kleine aanpassingen.

Plant-Microbe interactie: Transcriptionele reactie van Bacillus Mycoides op aardappel wortel exsudaat

Visualiseren en meten wortel groei in situ is zeer uitdagend. We presenteren een aanpasbare rhizobox methode voor het bijhouden van de ontwikkeling van de wortel en proliferatie na verloop van tijd in reactie op de voedingsstoffen verrijking. Deze methode wordt gebruikt voor het analyseren van maïs genotypische verschillen in wortel plasticiteit in reactie op een organische stikstofbron.

Een geoptimaliseerde Rhizobox Protocol bij het visualiseren van de wortelgroei en responsiviteit gelokaliseerde nutriënten

Hier presenteren we twee protocollen te transformeren aardappelplanten. De transformatie van het Agrobacterium tumefaciens leidt tot een volledige transgene plant terwijl het Agrobacterium rhizogenes produceert transgene harige wortels in een wild type shoot die zelf gekweekte kunnen. We detecteren dan promotor activiteit door GUS vlekken in het getransformeerde wortels.

Agrobacterium tumefaciens en Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie van aardappel- en de activiteit van de promotor van een gen suberine door GUS Staining

Het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) biedt de mogelijkheid om ontwikkelingsprogramma's te ontleden met minimale verwerking van organen en weefsels. Het protocol levert hoogwaardig RNA op uit cellen die zijn gericht op een groene fluorescerende eiwit (GFP)-gelabelde ribosomalsubunit. Downstream analysetools, zoals qRT-PCR of RNA-seq, onthullen weefsel- en celtypespecifieke expressieprofielen.

Het vertalen van Ribosome Affinity Purification (TRAP) om Arabidopsis thaliana Root Development te onderzoeken op een cell type-specifieke schaal

Hier presenteren we een protocol voor de zeer efficiënte productie van transgene sojabonenharige wortels.

Sojabonen harige worteltransformatie voor de analyse van de genfunctie

Hier bieden we het gedetailleerde protocol van een transformatiemethode in één stap, gemedieerd door Agrobacterium tumefaciens om samengestelde planten te produceren.

Een efficiënte en reproduceerbare methode voor het produceren van samengestelde planten door Agrobacterium rhizogenes-gebaseerde harige worteltransformatie

Het gebruik van specifieke glycosidases om suikers te verwijderen uit glycoproteïnen, gevolgd door SDS-PAGE is een waardevolle methode om glycan wijzigingen op eiwit-samples te detecteren en is een goede keuze voor de eerste glycobiologie studies. Veranderingen na deglycosylatie kunnen worden gedetecteerd als verschuivingen in gel mobiliteit of door kleuring met glycan gevoelige reagentia.

Identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases

Leer hoe je knol-specifieke promotoren in gewone bonen identificeert en karakteriseert met behulp van Agrobacterium rhizogenes-geïnduceerde harige wortels. Deze methode versnelt de inductie en verbetert de studie naar genexpressiepatronen.

De analyse van de promotor van de plant: Identificatie en karakterisering van Root knobbeltje specifieke promotor in de gemeenschappelijke Boon (Video) | JoVE Journal

De analyse van de promotor van de plant: Identificatie en karakterisering van Root knobbeltje specifieke promotor in de gemeenschappelijke Boon

Meer video's verkennen