De analyse van de promotor van de plant: Identificatie en karakterisering van Root knobbeltje specifieke promotor in de gemeenschappelijke Boon

Harige wortels worden gebruikt om getransformeerde wortels te verkrijgen in Phaseolus met een reporterconstruct. De resulterende transgene wortels worden gebruikt om de expressie van het reportergen te onderzoeken. Promotorexpressiestudies zijn cruciaal om de ruimtelijk-tijdelijke expressiepatronen van genen te begrijpen.

Vandaag gaan we de methodologieën demonstreren voor haarrige wortelinductie en om promotorexpressiepatronen te bestuderen in transgene harige wortels onder symbiotische wortelknobbelomstandigheden in Phaseolus. Estrada-Navarrete en collega's hebben eerder een door Agrobacterium rhizogenes geïnduceerde harige wortelsysteem in Phaseolus vastgesteld. De huidige methode zal helpen om de duur van de harige wortelinductie te versnellen en daarmee de veelzijdigheid van het systeem te verbeteren.

De procedures zullen worden gedemonstreerd door mijn collega Manoj-Kumar Arthikala en bachelorstudenten Alma Leticia en Brenda Mariana uit mijn lab. Om te beginnen, zoek de NIN-gensequentie in de Phaseolus vulgaris-genoomdatabase van Phytozome en selecteer de vereiste lengte van de sequentie stroomopwaarts tot ATG. Ontwerp de oligonucleotiden volgens de juiste promotorsequentieanalyse.

Frisse bereide Phaseolus genomische DNA zal dienen als sjabloon om de promotorsequentie te PCR-amplificeren. Bereid de PCR-mastermix voor met high-fidelity Taq polymerase en standaard PCR-componenten, samen met de eerder ontworpen oligonucleotiden. Deelverdeel de mastermix in 2 mL PCR-buisjes en voer de promotorfragmentamplificatie uit in een thermocycler en met een geschikt programma.

Schei het PCR-product elektroforetisch op een 1,2% agarosegel. Visualiseer het NIN-fragment geamplificeerd bij 700 basenparen onder UV-transilluminatie. Snijd uit, elueer en cloneer het fragment in de Gateway-entry vector pENTR/D-TOPO vector volgens de standaardinstructies.

Transformeer twee microliters van de reactiemix in competente E.coli-cellen bij 42 graden Celsius gedurende 50 seconden en plateer de getransformeerde E.coli op LB gesupplementeerd met 50 milligram per liter kanamycine. Laat de geplateerde cellen overnacht groeien bij 37 graden Celsius. Voer een PCR-reactie uit voor plasmiden geïsoleerd uit willekeurig geselecteerde E.coli-kolonies met behulp van M13-oligonucleotiden.

Het fragment bij 1024 basenparen zou positieve klonen moeten aangeven. Voer de LR-reactie uit tussen de positieve entry-kloon en de bestemmingsbinaire vector. Transformeer twee microliters van de reactiemix in E.coli en selecteer de kolonies op 100 milligram per liter spectinomycine bij 37 graden Celsius.

Amplificeer de plasmiden met NIN-specifieke oligonucleotiden. De positieve kloon zou bij 700 basenparen moeten amplificeren. Sequence en verifieer de juistheid van het kloonfragment.

Mobiliseer de NIN-promotorconstructie in elektrocompetente K599 Agrobacterium rhizogenes-cellen. En bevestig nogmaals de kloon met promotorspecifieke oligonucleotiden. Zwavel steriliseer Phaseolus vulgaris-zaden en ontkiem ze gedurende twee dagen in het donker bij 28 graden Celsius op steriele, natte filterpapieren.

Verspreid 150 microliters Agrobacterium rhizogenes-cellen met NIN-construct en controlevector op LB-platen met spectinomycine-selectie. Laat de cultuur overnacht groeien bij 28 graden Celsius. Decota Phaseolus-zaailingen en schraap Agrobacterium rhizogenes-cellen af met een gebogen, 200-microliters tip van de plaat.

En resuspendeer in Eppendorf-buisje met één mL steriele, gedestilleerd water. Verzamel Agrobacterium rhizogenes-cellen in een drie mL-sering en plaats Phaseolus-zaailingen in eerder bereide buisopstelling. Prik de hypocotyls van ontkiemde zaden lichtjes met de naaldtip, terwijl je de Agrobacterium rhizogenes-cellen injecteert.

Er moet voor worden gezorgd dat de naald niet door de hypocotyl gaat. Houd de geïnjecteerde zaailingen in een groeikamer bij 28 graden Celsius met een fotoperiode van 16 uur licht en acht uur donker. Callus op de gewonde hypocotyls zou binnen vijf tot zeven dagen zichtbaar moeten zijn.

Na twee weken verwijdert u de primaire wortel door de stengel twee centimeter onder de harige wortels af te snijden en plant ze vervolgens in potten met steriele vermiculiet. Inoculeer tegelijkertijd de planten met één ml Rhizobium tropici om nodulevorming te induceren. Zorg ervoor dat de Rhizobium-cultuur wordt verdund tot 6 bij OD 600.

Bewaar de planten in een groeikamer bij 28 graden Celsius, 16 uur licht en acht uur donker fotoperiode, en besproei met B en D-oplossing. Om ruimtelijk-tijdelijke expressiepatronen van NIN-promotor te bestuderen, wordt er op verschillende tijdstippen gesampled. Haal de planten eruit zonder de wortels te beschadigen en was de wortels zonder enige vermiculietdeeltjes.

Selecteer willekeurig de wortels uit NIN- en controleplanten en ga verder met GUS-histochemische kleuring door de monsters gedurende 16 uur in het donker bij 37 graden Celsius in GUS-assaybuffer te incuberen. Observeer de GUS-gekleurde wortels onder stereo- en compoundmicroscoop. Deze foto toont de Rhizobium-geïnduceerde NIN-promotorexpressie in de primaire wortels.

NIN-promotorexpressie kan ook worden gezien in Rhizobium-geïnfecteerde wortelhaarcellen. Verder kan de GUS-expressie worden gedocumenteerd in verschillende stadia van wortelknobbelontwikkeling. Er werd geen GUS-expressie waargenomen in vectorcontrolewortels.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van het ontwerpen van uw promotorconstructies en het bestuderen van de promotorexpressiepatronen in transgene harige wortels van Phaseolus. Dit systeem zou verder kunnen worden uitgebreid om de promotorexpressiepatronen te bestuderen onder andere symbiotische en pathogeeninteracties in Phaseolus en ook andere eudicots.