Drie-dimensionale reconstructie van de vasculaire architectuur van de passieve duidelijkheid-gewist muis eierstok
10 december 2017
Hier presenteren we een aanpassing van de passieve duidelijkheid en 3D reconstructie methode voor visualisatie van de ovariële therapieën en folliculaire haarvaten in de eierstokken intact muis.
Het algemene doel van dit protocol is om een volledig driedimensionaal beeld te geven van de capillaire verdeling in muis-ovariumfollikels en hun relaties te tonen. Het ovarium is een essentieel orgaan bij reproductie en in de endocrinologie. Tel elke verschillende ontwikkelingsstadium van het follikel en de somatische cellen.
Bovendien vertoont het ovarium, in tegenstelling tot andere organen, geen herhaalde vertakking van de functionele eenheid. Het lokale vasculaire systeem kan, samen met het zenuwstelsel, ook ingrijpende veranderingen ondergaan in elke menstruatiecyclus bij volwassen vrouwtjes. Het toepassen van passieve helderheid in het ovarium stelt ons in staat om de algehele verdeling en de verbinding tussen die cellen en follikels in het ovarium te zien.
Het belangrijkste van deze maatregel is dat het de minste effect heeft op het ovarium en rekening houdt met het opruimen van verschillende markers. Door de reconstructie van het microscopische beeld hebben we een kaart van het ovarium geboden. Sommige details van de bloedvaten, neuronen en follikels kunnen duidelijk worden waargenomen.
Voor beeldanalyse werden enkele opties van Imaris gebruikt om de relaties tussen het ovarium en de structuren te evalueren. Bereid profusieoplossingen volgens de artikelinstructies en bewaar ze op ijs. Anesthetiseer de muizen en zorg ervoor dat de muis geen teenprikrespons heeft.
Spuit ethanol, maak een incisie in het rechter atrium en profuseer vervolgens onmiddellijk het linker ventrikel met 20 ml ijskoud PBS met een snelheid van 10 ml per minuut om het bloed weg te spoelen. Profuseer vervolgens het dier met koude Hydrogel-oplossing met dezelfde snelheid. Verzamel de eierstokken evenals de baarmoeder om de integriteit van de ovariële morfologie te behouden.
Breng de gescheiden eierstokken over naar de koude Hydrogel-oplossing. Verwijder onder een stereomicroscoop het vetweefsel rond de eierstok. Voor een beter resultaat van weefselfixatie raden we aan de ovariumbursa te verwijderen.
Bewaar de eierstokken gedurende drie dagen in de Hydrogel-oplossing. Na drie dagen brengt u de eierstokken over in een glazen buis en vult u de buis met verse Hydrogel-oplossing. Strek het parafilm over de bovenkant van de buis en wikkel vervolgens een ander parafilm om de hals van de buis.
Zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn tussen het parafilm en de Hydrogel-oplossing. Plaats de glazen buis gedurende twee uur in een schuddende incubator bij 37 graden Celsius totdat het gel is gevormd. Verwijder voorzichtig het overtollige gel rond de eierstokken met een papierfilter.
Plaats de eierstokken in een 15 ml buis en vul de buis met 10 ml opklaringsoplossing. Plaats de buis op een schuddende incubator bij 37 graden Celsius gedurende minimaal twee maanden. Ververs de opklaringsoplossing elke dag in de eerste drie dagen en vervolgens wekelijks totdat de eierstok helder is geworden.
Alle immunokleuringsprocedures worden bij 37 graden Celsius op een schuddende uitgevoerd. Was eerst de eierstok 24 uur in PBST. Incubeer vervolgens de eierstok in primaire antilichaam verdund door PBST gedurende twee dagen.
Was vervolgens de primaire antilichamen af met PBST-buffer. Incubeer vervolgens de eierstok met het gewenste secundaire antilichaam in PBST gedurende twee dagen. Was vervolgens de secundaire antilichamen af met PBST.
Ten zesde, breng de eierstok over in een brekingsindex matchende oplossing voor RI-homogenisatie. Controleer de visuele transparantie, wanneer de eierstok volledig is opgehelderd, kan deze worden afgebeeld. Bereid eerst een schone glazen bodemplaat.
Maak een putty-cilinder en vorm deze in een hoefijzervorm. Druk de buitenrand stevig op de glasplaat om een afgesloten ruimte te maken. De hoogte van de putty moet iets hoger zijn dan de eierstok.
Verplaats de eierstok voorzichtig naar het centrum en voeg montageoplossing toe. Duw een schaal over de putty en gebruik twee stukken putty om het te bevestigen. Wanneer de eierstok klaar is om te worden afgebeeld, kan een Nikon confocale microscoop met 16X lens worden geselecteerd om deze te beeldvormen.
Voor beeldvorming met een confocale microscoop, kiest u eerst de lens in het Ni-E-paneel. In het panelverwerving, selecteert u het aantal kanalen. Gebruik eerst het Eye Port-tabblad en de XY-controller joystick om het weefsel naar het midden van het veld te verplaatsen door het te controleren met microscoopooggetuigen.
Ten tweede, na het uitschakelen van het sluiterlicht, klikt u op het live-tabblad om de laservermogen, HV en offset voor elk kanaal aan te passen. Pas in het paneel Z Intensiteitscorrectie de verwerving voor de bovenste laag aan, klik op de plus-knop om de bovenkant te definiëren, beweeg de lens naar beneden en stel het juiste HV en laservermogen in voor de onderkant van het weefsel en voeg de laagste laagopgave toe. Klik op ND om de instelling met het paneel en de verwerving te synchroniseren. En in de verwerving, stelt u eerst het aantal scanstappen in.
Klik op de tabbladen van Z en groot beeld. Ga vervolgens naar het scangrootbeeldvenster om de grootte van het veld te definiëren volgens de rand van het weefsel. Ga vervolgens terug naar de ND-verwerving om de grootte van de scanvelden in te voeren en kies de overlap binnen 10 en 50%Dan klikt u op Z-correctie uitvoeren en wacht u op het beeldvormingsproces.
Gebruik eerst imagic om het oorspronkelijke NIS-bestand te openen. Klik op de afbeeldingsknop, kies kleur en weergavekanalen, klik vervolgens op bestand, kies afbeeldingsreeksen en sla ze afzonderlijk op als tiff-bestanden. Gebruik vervolgens Imaris om een van de tiff-bestanden te openen.
Klik op de knop bewerken en kies de toevoegkanalen om de rest toe te voegen. De naam en kleur kunnen worden gewijzigd in de weergave-aanpassing. De dikte van het weefsel moet ook worden gecorrigeerd
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een aanpassing van de passieve CLARITY-methode voor het visualiseren van de ovariële vaatstructuur en folliculaire capillairen in intacte muizenovaria. Het protocol heeft tot doel een uitgebreid driedimensionaal beeld te geven van de capillaire verdeling binnen ovariële follikels.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Reproductieve biologie
- Vaatbiologie
Achtergrond
- De ovarium speelt een cruciale rol in reproductie en endocrinologie.
- Follikels ondergaan verschillende ontwikkelingsstadia, elk met verschillende somatische cellen.
- In tegenstelling tot andere organen, vertoont de ovarium geen herhaalde vertakking van functionele eenheden.
- Het vaatstelsel in de ovarium kan tijdens elke menstruatiecyclus aanzienlijk veranderen.
Doel van het onderzoek
- Om de algemene verdeling van capillairen in muizenovariumfollikels te visualiseren.
- Om de relaties tussen cellen en follikels binnen de ovarium te illustreren.
- Om het begrip van ovariële vasculairering en de implicaties ervan voor de reproductieve gezondheid te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Toepassing van passieve CLARITY-techniek.
- Driedimensionale reconstructie van de ovariële vaatstructuur.
- Visualisatie van folliculaire capillairen in intacte muizenovaria.
- Tellen van verschillende ontwikkelingsstadia van follikels en somatische cellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van capillaire netwerken in ovariële follikels.
- Gedetailleerde kaart van vasculaire verbindingen tussen follikels.
- Inzichten in de dynamische veranderingen in de ovariële vaatstructuur.
- Totstandbrenging van een raamwerk voor toekomstige studies over ovariële biologie.
Conclusies
- De passieve CLARITY-methode onthult effectief de ovariële vaatarchitectuur.
- Deze aanpak kan ons begrip van ovariële functie en gezondheid verbeteren.
- Toekomstig onderzoek kan op deze bevindingen voortbouwen om reproductieve endocrinologie te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Visualizing intact ovarian vasculature in 3D enables mechanistic de-risking of reproductive target hypotheses by clarifying structural relationships between follicles and their capillary networks. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative, reproducible readouts of vascular architecture that can inform target validation and phenotypic screening workflows. The method addresses a key discovery-stage challenge: linking anatomical context to functional ovarian biology without tissue distortion.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping follicular capillary length to follicular wall volume, supporting functional target validation.
- Operational Value: Provides a standardized, shrinkage-minimized clearing protocol that preserves tissue integrity for reproducible vascular analysis.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through quantitative correlation data (P<0.01) between capillary extent and follicular development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated 3D vascular maps that serve as disease-relevant systems for assessing compound effects on ovarian microstructure.
- Operational Value: Enables assay standardization via consistent immunostaining (CD31), clearing, and imaging parameters across follicles.
- Scalability: Supports platform reuse through adaptable clearing and reconstruction workflows applicable to other endocrine tissues.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-stage vascular phenotypes to preclinical models by preserving native ovarian architecture for longitudinal study.
- Mechanistic De-risking: Clarifies neurovascular interactions in the ovary, reducing ambiguity in endocrine target pathways.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides structural biomarkers (e.g., capillary length, follicular volume) to inform go/no-go decisions in follicle-modulating programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven analysis of vascular contributions to follicle maturation, supporting lead identification through phenotypic vascular profiling, and informing preclinical validation via intact tissue phenotyping.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of vascular regulators in follicle development through direct 3D visualization of capillary networks.
- Screening: Delivers assay-ready, cleared ovarian tissue with quantitative vascular outputs for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides morphometric measurements (capillary length, follicular volume) and correlation statistics to enable comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains histological fidelity from discovery through preclinical stages by avoiding tissue sectioning artifacts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular mapping capability for endocrine and reproductive tissue atlases across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in ovarian vascular biology.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs via passive CLARITY’s minimal tissue perturbation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of vascular-related follicle phenotypes, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on vascular-structural phenotypes in follicle cohorts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel-based tissue clearing, immunostaining, and multiphoton confocal microscopy.
- Depends on specialized instrumentation including shaker incubators, refractive index matching systems, and 3D reconstruction software (e.g., Imaris).
- Necessitates cross-team standardization of clearing duration, antibody validation, and imaging parameters for reproducible vascular quantification.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to non-ovarian tissues due to differences in density and lipid content.
- Limited by extended clearing timelines (up to two months) and the need for optimized antibody penetration in dense stromal regions.
