Name: Drie-dimensionale reconstructie van de vasculaire architectuur van de passieve duidelijkheid-gewist muis eierstok (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Leer de driedimensionale reconstructie van de vasculaire architectuur in intacte muizen-eierstokken met de passieve CLARITY-methode. Deze techniek visualiseert capillaire netwerken en hun relatie met follikels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Chinese speciale fonds voor Postdocs (nr. 2014T70392 aan de YF), de nationale Natural Science Foundation van China (nr. 81673766 aan de YF), het nieuwe leraar Priming Fonds, de oprichting van de Zuoxue van Fudan Universiteit en de ontwikkeling Project van Shanghai piek Disciplines-integratieve geneeskunde (20150407).

Alle procedures waarbij dierlijke onderwerpen volgde de richtsnoeren van de ethische commissie van het dier aan Shanghai Medical College, Fudan Universiteit (erkenningsnummer 20160225-013).
1. bereiding van de transparante muis eierstok
<ol><li>
Bereiding van de oplossingen
	<ol>
<li>Bereid met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)-oplossing (1 M, pH 7,6) met 0,1% Triton X-100 (PBST). Om 1 L van 10 x PBS stockoplossing, meng 87 g NaCl, 3.1 g van NaH2PO4 · 2H2O en 28.7 g nb2HPO4 ·12H2O. dH2O 1 L en roer ~ 2 h. aanpassen op een pH van 7,4 met 1 N NaOH toevoegen en bewaren bij kamertemperatuur. Verdunnen van deze stamoplossing 10 x 1/10 met behulp van dH2O en breng 0,1% Triton X-100 in PBS.</li>
		<li>Bereid de hydrogel oplossing (pH 7.5) door mengingen 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA) oplossing, 4% (wt/vol) acrylamide, 0.05% (wt/vol) bisacrylamide en 0,25% (wt/vol) VA-044 initiatiefnemer in tweemaal gedestilleerd water op het ijs.</li>
		<li>Bereid de clearing-oplossing (pH 8,5) door het mengen van 200 mM natriumboraat buffer met 4% (wt/vol) natrium dodecyl sulfaat (SDS) in tweemaal gedestilleerd water.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transcardial perfusie en eierstok voorbereiding
	<ol>
<li>Houd alle oplossingen op het ijs tijdens alle procedures.</li>
		<li>Anesthetize volwassen vrouwelijke wild type C57BL/6 muis met een intraperitoneale injectie pentobarbital (0.35 mg/kg) oplossing. Zodra het toont geen teen-snuifje reactie, is de muis goed verdoofd.</li>
		<li>Gebruik plakband om te herstellen van de muis met de ledematen uitgestrekt op een vlakke schuim bord.</li>
		<li>Bloot het hart door een sneetje op de xiphoid-proces door middel van de borst, huid en botten met een schaar.</li>
		<li>Maak een incisie in de juiste atrium van het dier, en dan perfuse het linkerventrikel met 20 mL ijskoud 1 x PBS op 10 mL/min.</li>
		<li>Perfuse van het dier met ten minste 20 mL hydrogel oplossing op 10 mL/min.</li>
		<li>De huid over de buik langs de lijn van medioventral met een schaar, die de hele enterocoelia bloot, incise en de ingewanden te verwijderen. Het verzamelen van de eierstokken, alsmede de baarmoeder te handhaven van de integriteit van ovariële morfologie.</li>
		<li>Het verwijderen van het vetweefsel rond de eierstok onder een microscoop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ontgassing
	<ol>
<li>Plaats de eierstokken in 10 mL hydrogel oplossing bij 4 ° C voor fixatie voor 3 dagen.</li>
		<li>Breng de eierstok in een tube van 5 mL en vul de buis met hydrogel oplossing. Parafilm rekken over de bovenkant van de buis en vervolgens wikkel parafilm rond de hals van de buis. Let op: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de parafilm en de hydrogel-oplossing.</li>
		<li>Plaats de buis op een shaker in de incubator bij 37 ° C gedurende ten hoogste 3 h om de hydrogel te polymeriseren.</li>
		<li>Verwijderen van de eierstok uit de gel met behulp van een spatel en verwijder voorzichtig de overtollige gel van rond de eierstok door papieren zakdoekje. Wassen van de eierstok viermaal met 1 x PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passieve clearing
	<ol>
<li>Het onderdompelen van de eierstok 10 ml van de oplossing van de clearing. Voorzichtig schudden bij 80 omwentelingen per minuut bij 37 ° C om de clearing-proces te starten.</li>
		<li>In de eerste week was de oplossing elke 3 dagen wijzigen. Na een week, de clearing-oplossing te vernieuwen zodra een week tot de eierstok duidelijk wordt. Dit proces duurt meestal ongeveer 2-3 weken. Opmerking: De eierstok immunostained rechtstreeks kan worden of kan worden opgeslagen in natriumazide (0,02%) in PBS bij 4 ° C voor enkele weken immunokleuring.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. immunokleuring
<ol><li>De eierstok tweemaal in PBST wassen op de dag 1 bij 37 ° C op een shaker.</li>
	<li>Incubeer de eierstok op een shaker in primaire antilichamen/PBST oplossing (tabel 1) op dag 2-3 bij 37 ° C. Bij de werkzaamheden hier gepresenteerd, de primaire antilichamen werden bloedplaatjes-endothelial cel adhesie molecuul 1 (CD31) en tyrosine hydroxylase verdund op 1:10 en 1:50 in PBST, respectievelijk. Let op: Als twee of meer soorten primair antilichaam worden gebruikt, zorg ervoor dat er verschillende dierlijke bronnen.</li>
	<li>Wassen van de primaire antilichamen met PBST buffer bij 37 ° C op dag 4 op een shaker.</li>
	<li>Incubeer de eierstok met de gewenste secundaire antilichamen in PBST op dag 5-6 bij 37 ° C op een shaker. In het werk hier gepresenteerd, waren de secundaire antilichamen Alexa bloem 488 voor tyrosine hydroxylase en Alexa bloem 594 voor CD31 verdund bij 1:50 in PBST.</li>
	<li>Wassen van de secundaire antilichamen met PBST buffer bij 37 ° C op dag 7 op een shaker.</li>
	<li>Breng het weefsel in de passende oplossing brekingsindex voor brekingsindex homogenisering op dag 8. Zet het weefsel op een papier met rasterlijnen zijn visuele helderheid controleren door te controleren of de rasterlijnen kunnen worden gezien. Zodra het weefsel volledig is opgehelderd, kan het beeld worden.</li>
	<li>Maak een stopverf cilinder die kon alleen omringt het weefsel, en vervolgens gestalte in de vorm van een hoefijzer krijgt en druk op de buitenste rand strak op een glasplaatje zodat een verzegelde ruimte. De hoogte van de stopverf moet worden een beetje groter dan het vruchtbeginsel.</li>
	<li>Plaats van de geklaarde eierstok zorgvuldig in het midden van de stopverf en voeg brekingsindex bijpassende oplossing. Zet een glazen-bodem schotel over de stopverf strak en gebruik putty de schotel vast te stellen.</li>
</ol>3. confocale microscopie
<ol><li>Kies in het deelvenster "Ni-E" voor beeldbewerking met een confocal microscoop, de lens (in dit geval water onderdompeling 25 X 2 mm-WD, objectief, 1.1-nb) met de juiste afstand van de werken (in dit geval 2.0 mm).</li>
	<li>
Selecteer in het deelvenster "Overname", het aantal kanalen. Hier, drie kanalen gebruiken.
	<ol>
<li>Gebruik eerst het tabblad "oog poort" en de XY controller joystick om het weefsel naar het midden van het veld door te controleren door de Microscoop oculairs.</li>
		<li>Na het uitschakelen van de sluiter licht, klik op de "live" tab bijstellen "laser", "HV (winst)", en "offset" voor elk kanaal afzonderlijk. Hogere macht van de laser en HV kan leiden tot hogere signalen, en hogere verschuiving de achtergrondgeluiden kan verminderen.</li>
		<li>Selecteer de juiste "Scan maat" en "Count". Gebruik een scan-formaat van 1024 x 1024 µm2 en een telling van 4 tot en met 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Na het instellen van de kwaliteit van de afbeelding voor het definiëren van de diepte van het weefsel in het deelvenster 'Z intensiteit correction' en na het vinden van de lens op de bovenste laag van de eierstok (in het midden van het weefsel) en de overname voor de bovenste laag aan te passen, klikt u op de "plus" knop om te definiëren van de bovenste laag.
	<ol>
<li>De lens omlaag en stel de juiste HV en laser kracht voor de onderkant van het weefsel en de laaggegevens van de laagste in de Z-intensiteit correctie tabel toevoegen. Klik op "Naar ND" voor het synchroniseren van de instelling met de "ND verwerving" paneel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
In de "ND overname" paneel, eerste reeks het aantal scannen stappen. Vink dan, de tabbladen "Z" en "Grote afbeelding".
	<ol>
<li>Ga naar het "Scan grote afbeelding" venster om te bepalen van de grootte van het veld naar de rand van het weefsel met de hulp van weefsel visualisatie via de oculairs. Ga terug naar het paneel "ND verwerving" om de grootte van het scangebied ("velden") en kies de overlap tussen 10% en 15%.</li>
		<li>Klik op de "Run Z correctie", niet "Run nu", automatisch de juiste HV, laser macht en offset instellen voor elke laag, en wachten op de afbeelding om te verwerken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 3D reconstructie van individuele follikels en hun Vasculatures
<ol><li>Gebruik eerst ImageJ5 om de oorspronkelijke NIS-bestand te openen. Klik op de knop 'Afbeelding' en kies de "kleur" en de "Split-kanalen". Dan, klik op "Bestand" en afzonderlijk de kanalen opslaan als TIFF-bestand-serie met behulp van de optie "Image Sequences" in "Opslaan als".</li>
	<li>Gebruik Imaris om te openen een van de TIFF-bestand-serie. Klik op de knop "Bewerken" en kies "Add kanalen" toe te voegen van de rest van de kanalen. De naam en de kleur van het kanaal kunnen worden gewijzigd in de tabbladen "Display aanpassing". De dikte van het weefsel moet mogelijk worden gecorrigeerd in het deelvenster "Afbeeldingseigenschappen" in de drop-down lijst onder "Bewerken".</li>
	<li>Voor de 3D bijsnijden van de laatste beelden en verwijdering van overtollige delen, klik op de knop "Bewerken" en kies "Gewas 3D". De grootte van het veld kan worden aangepast door de rand te slepen.</li>
	<li>
Als u wilt reconstrueren de signalen van het schip met de filamenten algoritme in het deelvenster Surpass, klikt de "Door samensmelting van filamenten" Maak een nieuwe gloeidraad en klik op volgende.
	<ol>
<li>Om de grootste en de dunste diameter, ga naar het paneel "Slice" en vind het schip tracering. De afstand wordt automatisch getoond in het deelvenster "Maatregel" door het selecteren van twee punten op de maximale breedte van het schip.</li>
		<li>Ga terug naar het paneel "Surpass" ingang van de gemeten breedte en klik op volgende.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De begin- en zaad punt drempel aanpassen. Kies in het deelvenster "Camera" "Selecteren". Als sommige van de automatisch geproduceerde bollen worden verwijderd moeten, houdt u SHIFT ingedrukt en klik op het punt. Door het kiezen van "Navigeren" en de muis bewegen, kan de structuur worden gedraaid om ervoor te zorgen dat alle juiste punten hebben overgenomen, en klik op volgende.</li>
	<li>Kies de hoogste drempel voor het lokale contrast en klik op volgende. Geen Selecteer "Detect stekels" en blijven de wederopbouw van de cilinder bloedvat af te ronden. De kleur kan worden bewerkt door te klikken op het tabblad "Kleur". De statistische gegevens kan worden gewonnen in de "Statistiek"-paneel van de gereconstrueerde gloeidraad. Overtollige onderdelen kunnen worden verwijderd in het deelvenster 'Bewerken'. Opmerking: Andere algoritmen kunnen worden gebruikt voor het meten van de omvang van de totale follikels of folliculaire muren. In het werk hier gepresenteerd, werden de eicellen gekenmerkt door de autofluorescence van beide secundaire antilichamen. Vanwege de grote hoeveelheid gegevens, werd de server van een werkstation gebruikt voor de data-analyse.</li>
</ol>5. statistische analyse
Opmerking: Analyse van de afbeeldingsgegevens worden gepresenteerd als middel van ± standaardfouten.
<ol><li>Uitvoeren van vergelijkingen tussen de follikels met behulp van onafhankelijke sample t-test en Pearson's correlatie test gebruiken om te vergelijken correlatiecoëfficiënten van folliculaire muur en capillaire lengte. Stelt een waarde van P < 0.05 als de limiet voor statistische significantie.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, H. M., Russell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+and+lymphatic+vasculature+in+the+ovary%3A+development%2C+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease.</a> Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).</li>
<li>McFee, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+signal+transduction+blocks+follicle+progression+but+does+not+necessarily+disrupt+vascular+development+in+perinatal+rat+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries.</a> Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).</li>
<li>Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+analysis+of+vascularization+during+primary+development+of+an+organ%2C+the+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+Open+Source+platform+for+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an Open Source platform for biological image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+platelet+endothelial+cell+adhesion+molecule-1-null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice.</a> Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).</li>
<li>Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+expression+of+alpha+%281%29-+and+beta+%282%29-adrenoceptors+and+p75+neurotrophin+receptors+in+rats+with+steroid-induced+polycystic+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Auton+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries.</a> Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).</li>
<li>Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annual+and+periovulatory+changes+in+tyrosine+hydroxylase+activity+in+the+ovary+of+the+catfish+Heteropneustes+fossilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis.</a> Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810(2017).</li>
<li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).</li>
<li>Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Serotonergic+Fibers+in+the+Mouse+Spinal+Cord+Using+the+CLARITY%2FCUBIC+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique.</a> J Vis Exp. (108), e53673(2016).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum%3A+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Sci Rep. 6, 26013(2016).</li>
<li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), e274(2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Chung, A. S., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental and pathological angiogenesis.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).</li>
<li>Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+ovarian+follicular+antrum+and+follicular+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid.</a> Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).</li>
<li>Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-follicle+barrier+%28BFB%29+in+disease+and+in+ovarian+function%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function.</a> Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clear%28T%29%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140, 1364-1368 (2013).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/neuro/journal/v16/n8/full/nn.3447.html">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li>
<li>Lai, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationalisation+and+validation+of+an+acrylamide-free+procedure+in+three-dimensional+histological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging.</a> PLOS ONE. 11, e0158628(2016).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li>
<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27627784">Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).</li>
<li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+%28FACT%29-an+optimized+new+protocol+for+rapid%2C+high-resolution+imaging+of+three-dimensional+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue.</a> Sci Rep. 7, 9895(2017).</li>
<li>Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+an+essential+role+of+vasoconstriction+in+rupture+of+the+ovarian+follicle+at+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).</li>
<li>Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-mount+approach+for+accurate+quantitative+and+spatial+assessment+of+fetal+oocyte+dynamics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice.</a> Biol Reprod. 93 (113), (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In de huidige studie presenteren we 3D-imaging om te evalueren van de relaties tussen de haarvaten en individuele groeiende follikels. In onze vorige werk met behulp van de dezelfde protocol 9, studeerde we de rol van grote therapieën, interacties tussen follikels en de locatie van de follikels in de eierstokken intact muis. De passieve houding van de duidelijkheid ons toegestaan om te studeren van micro - en macro-vasculatures, folliculogenese en de relaties tussen de corpora lutea en de follikel...

De follikel is de fundamentele structurele en functionele eenheid van de eierstok en de ontwikkeling ervan is sterk gerelateerd aan de therapieën in de eierstok. Bloedvaten, voeding en hormonen aan de follikels leveren en dus spelen een belangrijke rol in de groei en de rijping van de follikels1.
Een combinatie van technologieën, met inbegrip van bloedvat selectieve markeringen, transgene muismodellen, en farmaceutische ontwikkeling, is onze kennis over ovariële vasculaire netwerken, angiogenese, en de functie van bloedvaten in gestegen folliculogenese. Het vruchtbeginsel is bekend als een actieve orgel omdat het hervormt verschillende weefsels en vasculaire netwerken tijdens folliculogenese en ovulatie. Dergelijke actieve remodelleren in de omvang en de structuur van schepen is vereist voor de biologische functie van de ontwikkeling en het werven van follikels.
Traditionele histologische en histomorphometric methodes gebruikend ovariële secties en immunolabeling van de bloedvaten zijn beperkt tot tweedimensionale (2D) afbeeldingen,2. Met de ontwikkeling van driedimensionale (3D) reconstructie technologieën, kunnen 2D beelden van weefsel segmenten overlappen zodat een 3D-structuur, maar deze methode heeft nog steeds enkele beperkingen — afdelen van het weefsel kan vernietigen de microstructuren, sommige delen van de weefsel ontbreken vaak, en belangrijke arbeid is betrokken bij het maken van 3D-reconstructies van de beelden verkregen uit segmenten. Geheel-weefsel 3D-beeldbewerking met confocale microscopie kan veel van deze beperkingen overwinnen, maar deze methoden zijn beperkt tot de evaluatie van de angiogenese in het embryonale eierstok3. Met behulp van hele weefsel clearing methoden zoals duidelijkheid4 kan verhogen het gevisualiseerde volume zodat deze problemen in de postnatale en volwassen eierstokken en dergelijke methoden bieden optische Goedkeuringvande het ovarium zonder eventuele structurele vervormingen. Beeldvorming van de 3D-architectuur van de eierstokken intact biedt een nauwkeurige afbeelding database voor analysesoftware van de afbeelding, zoals het Imaris softwarepakket gebruikt in dit werk.
Verbouwing van het ovarium tijdens volwassenheid is onderdeel van een dynamische fysiologische systeem, en dit maakt het ovarium een uitstekend model voor onderzoek naar de regulering van angiogenese. Evaluatie van de rol van ovariële bloedvaten in pathologische omstandigheden van het vrouwelijke reproductieve systeem zoals polycysteus ovarium syndroom of ovariële kanker kan bovendien worden bestudeerd door hele eierstokweefsel imaging. De ontwikkeling van de passieve duidelijkheid-methode en het gebruik van de software van de analyse van de geavanceerde beeld hebben gedetailleerde ruimtelijke informatie verstrekt over de relaties tussen de bloedvaten en ovariële structuren zoals follikels.

<table><tbody><tr><td>Acrylamide</td><td>Vetec</td><td>v900845</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845</td></tr><tr><td>Alexa Flour 488 (Dilution 1:50)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11039</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039</td></tr><tr><td>Alexa Flour 594 (Dilution 1:50)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>Bisacrylamide</td><td>Amresco</td><td>172</td><td>http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx</td></tr><tr><td>Black wall glass bottom dish (Willco-Dish)</td><td>Ted Pella</td><td>14032</td><td>http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall</td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10004818</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818</td></tr><tr><td>Dinatriumwaterstoffosfaatdodecahydraat (Na2HPO4 12H2O)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10020318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318</td></tr><tr><td>FocusClear</td><td>Celexplorer</td><td>FC-102</td><td>http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&amp;BRDarea=1</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>http://www.parafilm.com/products</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>80096618</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618</td></tr><tr><td>PECAM1/CD31, plaatjes-endotheelcel adhesiemolecuul 1 (Dilution 1:10)</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html</td></tr><tr><td>Foto-initiator VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&amp;region=US</td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10019318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318</td></tr><tr><td>Natriumdiwaterstoffosfaatdihydraat (NaH2PO4 2H2O)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>20040718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>30166428</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide (NaOH)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10019718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>30188928</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928</td></tr><tr><td>Tyrosinehydroxylase (TH, Dilution 1:50)</td><td>Abcam</td><td>ab76442</td><td>http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html</td></tr></tbody></table>

drie-dimensionale reconstructie van de vasculaire architectuur van de passieve duidelijkheid-gewist muis eierstok

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Het vruchtbeginsel is het belangrijkste orgaan van het vrouwelijke voortplantingsstelsel en is essentieel voor de productie van de vrouwelijke gameten en voor de controle van het endocriene systeem, maar de complexe structurele relaties en driedimensionale (3D) therapieën platforms van de eierstok zijn niet goed beschreven. Om te visualiseren de 3D verbindingen en de architectuur van de bloedvaten in de intact eierstok, is de eerste belangrijke stap om de eierstok optisch duidelijk. Ter voorkoming van weefsel krimp, gebruiken we de hydrogel fixatie gebaseerde passieve duidelijkheid (duidelijk lipide-uitgewisseld Acrylamide-gekruist Rigid Imaging / immunokleuring/In situ-hybridisatie-compatibele weefsel Hydrogel) protocol van de methode om te wissen van een intact eierstok . Immunokleuring, geavanceerde multiphoton confocale microscopie en 3D-beeld-reconstructies werden vervolgens gebruikt voor de visualisatie van ovariële vaartuigen en folliculaire haarvaten. Met behulp van deze aanpak, we toonden een significante positieve correlatie (P < 0.01) tussen de lengte van de folliculaire haarvaten en het volume van de folliculaire muur.

Wij de passieve duidelijkheid methode aangepast in een snelle en eenvoudige methode voor passieve eierstok schakelen terwijl het behoud van de folliculaire en vasculaire architectuur en het verkrijgen van de hoogste fluorescent signaal van gelabelde markers van vaartuigen en follikels. De 3D-architectuur van de folliculaire therapieën werd bepaald door immunokleuring voor CD31, een marker voor endotheliale cellen6. CD31 vlekken in de eierstokken van volwassen muize...

Hier presenteren we een aanpassing van de passieve duidelijkheid en 3D reconstructie methode voor visualisatie van de ovariële therapieën en folliculaire haarvaten in de eierstokken intact muis.

Drie-dimensionale reconstructie van de vasculaire architectuur van de passieve duidelijkheid-gewist muis eierstok

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Het algemene doel van dit protocol is om een volledig driedimensionaal overzicht te geven van de capillaire distributie in eierstokfollikels van muizen en hun onderlinge relaties aan te tonen. De eierstok is een essentieel orgaan in de reproductie en de endocrinologie. Tel elk verschillend ontwikkelingsstadium van de follikel en de somatische cellen.Bovendien vertoont het eierstokje, in tegenstelling tot andere organen, geen herhaalde vertakking van de functionele eenheid. Het lokale vaatstelsel kan, samen met het zenuwstelsel, in elke menstruatiecyclus bij volwassen vrouwen ook grote veranderingen ondergaan. Het toepassen van passieve helderheid in het eierstokje stelt ons in staat om de algehele distributie en de verbinding tussen die cellen en follikels in het eierstokje te zien.Het belangrijkste aspect van deze methode is dat deze een minimale impact heeft op de eierstok en voorziet in het vrijmaken van diverse markers. Door de reconstructie van het microscopische beeld hebben we een kaart van de eierstok opgesteld. Enkele details van de vaten, neuronen en follikels kunnen duidelijk worden waargenomen.Voor de beeldanalyse werden enkele opties van Imaris gebruikt om de relaties

three-dimensional-reconstruction-vascular-architecture-passive

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze studie geeft een protocol voor het omkeerbare weefsel clearing, immunokleuring, 3D-rendering en analyse van vasculaire netwerken in menselijke placenta villi monsters over de volgorde van 1-2 mm,3.

Driedimensionale weergave en analyse van Immunolabeled, verduidelijkt menselijke placenta Villous vasculaire netwerken

Hier presenteren we een protocol om te kwantificeren follikels in gekweekte eierstokken van jonge Muizen zonder seriële segmenteren. Met behulp van hele orgel immunofluorescentie en weefsel wissen, is fysieke segmenteren vervangen door optische segmenteren. Deze methode voor de bereiding van de monsters en visualisatie handhaaft integriteit van orgel en vergemakkelijkt geautomatiseerde kwantificering van specifieke cellen.

Hele Mount immunofluorescentie en follikel kwantificering van gekweekte muis eierstokken

Ovariële weefselcultures kan worden gebruikt als modellen van follikel ontwikkeling, ovulatie en follikel atresie en regulerende mechanismen van dynamische ovariële processen aan te geven.

Ovariële weefselkweek te visualiseren verschijnselen in muis eierstok

Hier beschrijven, vergelijken en contrasteren we twee verschillende technieken voor het nauwkeurig tellen van de follikels van vaste eierstokweefsels van muizen.

Nauwkeurige follikelenumatie in volwassen muiseronden

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het in beeld brengen van hele eierstokken voor kwantitatieve en kwalitatieve analyses met behulp van whole-mount immunostaining, multifotonenmicroscopie en 3D-visualisatie en -analyse. Dit protocol biedt een hoge doorvoer, betrouwbare en herhaalbare verwerking die van toepassing is op toxicologie, klinische diagnostiek en genomische testen van de ovariële functie.

Whole Ovary Immunofluorescentie, Clearing en Multiphoton Microscopie voor kwantitatieve 3D-analyse van de zich ontwikkelende ovariële reserve bij muizen

De pericyten in het retinale vaatstelsel werden onderzocht door middel van immunofluorescerende kleuring met van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor β na retro-orbitale injectie van fluorescerend tomatenlectine. Het gelabelde netvlies werd verder behandeld met de weefselopruimingsmethode en in zijn geheel gemonteerd voor het visualiseren van de driedimensionale beelden van pericyten rond het netvliesvaatstelsel onder een confocale microscoop.

3D-visualisatie van retinale vasculaire pericyten bij muizen door immunokleuring 

Veranderingen in de bloedstroom van de eierstokken tijdens de pre-ovulatieperiode zijn essentieel voor de eisprong. Doppler-echografie is gebruikt bij mensen en grote dieren om de hemodynamica en perfusie van de eierstokken te beoordelen. Er wordt een protocol gepresenteerd voor het toepassen van Doppler-echografie om de hemodynamica van de eierstokken tijdens de preovulatoire en periovulatoire fasen bij muizen te evalueren.

Doppler-echografie voor live beeldvorming en kwantificering van de ovariële vasculaire functie bij muizen

De Hi-C methode maakt het mogelijk onpartijdige, genoom-brede identificatie van chromatine interacties (1). Hi-C paren nabijheid ligatie en massaal parallelle sequencing. De resulterende gegevens kunnen worden gebruikt om de genomische architectuur studeren op meerdere schalen: eerste resultaten geïdentificeerd functies zoals chromosoom gebieden, scheiding van open en gesloten chromatine, en chromatine structuur op de megabase schaal.

Hi-C: een methode om de driedimensionale architectuur van genoom-onderzoek.

Het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) lijnen produceert lijnen van verschillende ontwikkelingspotentieel, zelfs als ze passeren standaard tests voor pluripotentie. Hier beschrijven we een protocol muizen volledig zijn verkregen uit iPSCs die de iPSC lijnen gedefinieerd als hebbende full pluripotentie...

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Wij ontwikkelden een software platform dat Imaris Neuroscience, ImarisXT en MATLAB om de veranderingen in morfologie van een ongedefinieerde vorm uit driedimensionale confocale fluorescentie van afzonderlijke cellen te meten gebruikt. Deze nieuwe benadering kan worden gebruikt om veranderingen in celvorm na receptor activatie kwantificeren en dus een mogelijke extra hulpmiddel voor drug discovery.

Een analytisch instrument dat cellulaire morfologie Veranderingen van Drie-dimensionale Fluorescentie afbeeldingen kwantificeert

Leer de driedimensionale reconstructie van de vasculaire architectuur in intacte muizen-eierstokken met de passieve CLARITY-methode. Deze techniek visualiseert capillaire netwerken en hun relatie met follikels.

Drie-dimensionale reconstructie van de vasculaire architectuur van de passieve duidelijkheid-gewist muis eierstok

Meer video's verkennen