Synthese van besmettelijke bacteriofagen in een e-coli -gebaseerd systeem van cel-vrije expressie

Het algemene doel van dit experiment is om te beschrijven hoe bacteriofagen worden gesynthetiseerd uit hun genoom met behulp van een volledig E.coli celvrij transcriptie-translatiesysteem. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van de synthetische biologie, zoals het verduidelijken van de moleculaire zelfassemblagemechanismen in levende systemen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de veelzijdigheid van het platform.

Veel biologische systemen kunnen volledig worden gerecapituleerd en fijn afgesteld voor experimentele analyse. Begin deze procedure met de bereiding van fagelaezen zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik het uiteinde van een steriele Pasteur-pipet om een enkele plaque uit te kernen en te verwijderen.

Blaas de plaque in de verdunde cellen. Incubeer vervolgens gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Om te testen op volledige infectie, neem een monster van 500 microliter in een buis van 1,5 milliliter en voeg 10 microliter chloroform toe.

Vortex de mixtuur onmiddellijk op hoge snelheid en observeer of de oplossing opklaart, wat wijst op fageninfectie. Zodra de cellen volledig geïnfecteerd zijn, incubeer gedurende nog eens twee uur. Voeg vervolgens DNase toe voordat de cellen worden gecentrifugeerd bij 8.000 keer g en vier graden Celsius.

Gooi het supernatant weg en resuspendeer het pellet in 10 milliliter 1X Tris magnesiumchloride. Voeg 500 microliter chloroform toe en vortex op hoge snelheid om de cellen te lyzeren. Klaarheid door centrifugatie bij 12.000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Decant vervolgens het supernatant in een 15 milliliter conische buis en bewaar bij vier graden Celsius. Bereid vier vijf tot 45% sucrosegradiënten voor door 2,5 milliliter 45% sucrose in vier ultracentrifugebuizen te pipetten. Vul de laag aan met ongeveer 2,6 milliliter 5% sucrose, stop wanneer de vloeistof twee millimeter van de rand van de buis is.

Meng de gradiënten door de buisjes te kantelen en te draaien met behulp van een gradiëntvormend instrument gedurende 43 seconden bij 86 graden en 23 RPM. Voeg met behulp van een pipet van één milliliter 500 microliter van de gepoolde fagensuspensie toe door de punt in contact te brengen met het vloeistofoppervlak en heel langzaam het volume op de bovenkant van de sucrosegradiënt te doseren, zorg ervoor dat u niet snel pipetteert. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 70.000 keer g en vier graden Celsius.

Dompel een stompe canule in de oplossing tot de punt zich in het midden van de bovenrand van de fagenband bevindt. Verwijder de band door op de spuitzuiger te trekken tot de meerderheid van de fagenband is verwijderd. Voeg vervolgens het sucrosevolume met de gesuspendeerde fagen toe aan drie of vier ultracentrifugebuizen.

Vul de buizen tot tussen de drie en vier millimeter vanaf de bovenkant van de buis met koud 1XTM. Bedek de buizen met paraffinefolie en draai om te mengen. Plaats de buizen terug in een ultracentrifuge en centrifugeer bij 145.000 keer g gedurende één uur bij vier graden Celsius.

Pour snel het supernatant af en laat het op afvoerdoekjes lopen. Verdeel 200 tot 400 microliter koud 1XTM over alle pellets en resuspendeer een nacht bij vier graden Celsius. Er hoeft niet geschud te worden.

De dag voordat de titers worden gemaakt, bereid een kweek van E.coli gastheercellen in 10 milliliter LB-groeimedium en laat de kweek in een schuddende incubator staan die ingesteld is op 250 RPM en 37 graden Celsius overnacht. Bereid vervolgens een mastermix voor door 5,25 milliliter topagar, 220 microliter verdunde fagenmonsters en 50 microliter gastheerbacteriële cellen in een kweekbuis van 14 milliliter te pipetten. Sluit de kweekbuis af en vortex op hoge snelheid.

Haal twee kweekplaten uit de 37 graden Celsius incubator. Voeg vervolgens 2,5 milliliter mastermix langzaam toe aan het midden van de eerste plaat. Draai de plaat voorzichtig met de hand om de mastermix gelijkmatig te verdelen zodat deze de hele kweekplaat beslaat.

Wacht 20 minuten om de stollingstijd van de topagar te garanderen. Incubeer de platen gedurende vier tot zeven uur bij 37 graden Celsius. Tel de plaques en bepaal de fagenconcentratie voor elke reactiemonster.

Verdun een portie van de fagenstock tot 400 microliter met 1XTM-buffer in een verse 1,5 milliliter buis. Voeg een gelijk volume Tris fenol chloroform toe aan de verdunning. Schud de mixtuur voorzichtig op een laboratoriumwieg of met de hand gedurende vijf minuten.

Centrifugeer vervolgens de resulterende emulsie bij 17.000 keer g in een tafelcentrifuge gedurende vijf tot 10 minuten. Verwijder de bovenste waterige fase in een nieuwe buis, zorg ervoor dat u de interfasegrens niet verstoort. Herhaal deze stappen nog twee keer voor een totaal van drie fenolextracties.

Breng de waterige fase over naar een verse buis en voeg een gelijk volume chloroform toe. Schud en centrifugeer voordat u de waterige DNA-monster naar een schone buis overbrengt. Voeg vervolgens 0,4 volumes drie molair natriumacetaat en drie volumes 95% ethanol toe.

Plaats de buis in een min 20 graden Celsius vriezer voor overnacht precipitatie. Centrifugeer gedurende 10 tot 15 minuten bij 17.000 keer g in een tafelcentrifuge. Verwijder en gooi het supernatant weg, hetzij door decanteren of pipetteren.

Voeg vervolgens 500 microliter 70% ethanol toe en schud voorzichtig de buis tot de pellet vrij van de bodem van de buis drijft. Na centrifugatie, verwijder en gooi het ethanol weg, zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort. Na het toevoegen van ethanol en centrifugeren zoals eerder, verwijder en gooi het ethanol een tweede keer weg, opnieuw zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort.

Laat de pellet 30 tot 60 minuten aan de werkbank drogen. Zodra het droog is, voeg 50 microliter dubbel gedestilleerd water toe aan de pellet en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius om