Name: Integratie Gratis Derivatie van Menselijk Geïnduceerde Pluripotente Stamcellen Met Laminine 521 Matrix (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Leer een robuuste methode voor het afleiden van homogene humane geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van niet-integrerend Sendai-virus en laminine 521 matrix.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door SSF (B13-0074) en VINNOVA (2016-04134) financieringsagenten.

De inzameling van patiënt materiaal en afleiding van hiPS cellen is goedgekeurd door de Ethics Review Board, Stockholm, 28 maart 2012, Registratienummer: 2012 / 208-31 / 3. Celcultuurstappen dienen in biosafety kasten te worden uitgevoerd, tenzij anders vermeld. Gebruik altijd steriele hanteringstechnieken bij het werken met cellen. Laat de media, platen en reagentia de kamertemperatuur bereiken voordat u begint. Incubeer cellen bij 37 ° C, 5% CO 2 bij hoge vochtigheid. 1. Isolatie van humane fibroblasten van dermale biopsie <ol><li> Voorbereidingen van cultuurmedium, spijsverteringsenzymen, bekleding van gerechten en dissecterende gereedschappen. <ol><li> Bereid Fibroblast medium: 44,5 ml Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM), 5 ml Fetaal Bovenserum (FBS) en 500 μL Penicilline / Streptomycine (PEST) (zie tabel 1 ), opslaan bij 4 ° C. </li><li> Verteer spijsverteringsenzymen bij een werkconcentratie van 1 mg / ml: weiGh aliquots van 4 mg dispase en collagenase type I poeder in afzonderlijke buizen van 15 ml en oplossen in 4 ml DMEM / F12 + 1% PEST. Steriliseer de enzymatische oplossing door het door een 0,22 μm filter te brengen. Bereid elke keer verse enzymprocessen voor. </li><li> Coat één goed in een 6-putje weefselkweekplaat (of 35 mm weefselkweekschotel) per biopsie gedissecteerd met 1 ml 0,1% gelatine in fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Autoclaaf een set chirurgische scharen en pincet per biopsie voor dissectie. </li></ol></li><li> Biopsie behandeling OPMERKING: Proces biopsies zo snel mogelijk na het nemen. Bewaar in PBS + 1% PEST gedurende maximaal 48 uur bij 4 ° C. Biopsie moet 2 - 4 mm in diameter zijn en volgens ethische vergunningen. <ol><li> Breng de biopsie over in een 35 mm schotel. Verplaats de biopsie naar een nieuwe 35 mm schotel en dompel de biopsie in 2 ml 70% ethanol gedurende 30 s. </li><li> Verplaats de biopsie naar een derde35 mm schotel en was met 1 ml steriele Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) aangevuld met 1% PEST. </li><li> Breng de biopsie over naar een vierde 35 mm schaal, voeg 1 ml vers bereide 0,1% dispasoplossing toe. </li><li> Snijd de huidbiopsie in 1 - 2 mm 3 stuks in het gerecht met behulp van chirurgische scharen en pincetjes en plaats vervolgens de biopsie stukken inclusief de dispasoplossing in een 15 ml buis. Voeg een extra 2 ml dispase toe. </li><li> Spoel de 35 mm schaal af met een 1 ml dispasoplossing en overdragen naar de 15 ml buis. </li><li> Incubeer de biopsie bij 4 ° C overnacht. </li><li> Voeg 4 ml 0,1% collagenase I toe aan de buis en incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur. </li><li> Centrifugeer de verteerde cellen 300 xg gedurende 3 minuten, aspirateer de supernatant en resusteer de vertering in 2 ml fibroblast medium. </li><li> Verwijder de gelatineoplossing uit de 6-putjesweefselkweekplaat. Breng de celsuspensie over, inclusief eventuele resterende stukken aan een weefselkweekplaat met 6 putjes (of 35-mM weefselkweekschotel) precoated met 0,1% gelatine in DPBS. </li><li> Verander het medium elke derde dag. </li></ol></li><li> Uitbreiding van menselijke fibroblasten OPMERKING: Fibroblasten zijn klaar om door een T25 (25 cm 2 ) weefselkweekfles te worden vervoerd wanneer 80% samenvloeit ( Figuur 2B ). Fibroblasten bereiken meestal 80% confluency binnen 7 dagen. De benodigde tijd kan echter sterk variëren, maar mag niet meer dan 4 weken zijn. <ol><li> Aspiratiemedium en wassen eenmaal met 2,5 ml DPBS. </li><li> Verwijder DPBS en voeg 1 ml Trypsin-EDTA (0,05%) toe en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten of tot cellen ronde randen laten zien en begin loslaten. </li><li> Voeg 2 ml fibroblastmedium toe, eventueel spoel de cellen de juiste afschakeling van de cellen. Breng de celoplossing over op een 15 ml buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 3 minuten. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer de celpellet in 5 ml fibroblast medium en plaat fibroblasten in eenOp-gecoate celweefselkweek T25-fles. Wanneer u fibroblasten na deze stap uitbreidt, dissociëren zoals boven beschreven en zaad 12 x 10 3 cellen / cm2. </li><li> Zodra samenvloeiende cellen klaar zijn om te bevroren, verbreden of platen voor herprogrammering. Bevestig twee ronden fibroblast voordat een herprogrammering is gestart (zie volgende sectie voor het vriesproces). De herprogrammeringsefficiëntie is over het algemeen hoger voor lagere doorgangsfibroblasten, cellen bij passage 2-4 zijn optimaal. Echter, succesvolle herprogrammering van fibroblasten tot passage 10 is uitgevoerd met dit protocol. </li></ol></li><li> Bevriezen en ontdooien van fibroblasten <ol><li> Bereid vers fibroblast bevriezend medium op: 90% FBS + 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Blijf bij 4 ° C ( tabel 1 ). Zodra samenvloeiend, kan de T25 weefselkweekfles in drie cryovials worden bevroren. Bereid 500 μl fibroblast bevriezend medium per vrieskas bevroren. </li><li> Om cellen te bevriezen, dissociëren cElls zoals beschreven in stap 1.3, cellen cellen met behulp van een hemocytometer en overbrengen porties van 3 x 10 5 cellen naar 15 ml buizen. Spin buizen bij 300 xg gedurende 3 minuten. Aspirate supernatant. </li><li> Resulteer celpellets in 500 μl 4 ˚C fibroblast bevriezing medium en over te brengen in cryovials. Plaats de flesjes in een vriescontainer en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij -80 ° C voordat ze overgebracht worden naar vloeibaar stikstof voor langdurige opslag. </li><li> Om de cellen te ontdoen, onderdompelen het bodemdeel van de cryovial in 37 ° C water. Zodra het vloeibaar is, breng de cel-suspensie over naar een 15 ml buis en voeg 5 ml fibroblast medium toe. Spincellen 300 xg gedurende 3 minuten. </li><li> Verwijder de supernatant en resuspendeer de celpellet in 5 ml fibroblastmedium. Overdracht cellen naar een niet-gecoate T25 weefselkweekfles en incuberen in 37 ° C. </li></ol></li></ol> 2. SeV Vector Herprogrammering van Fibroblasten <ol><li> Bereiding van vectorquota </strong&gt; VOORZICHTIG: Behandel de SeV onder de bioveiligheidsniveau 2. Raadpleeg het protocol van de fabrikant en de lokale richtlijnen 17 . Virus titer verschilt tussen partijen. <ol><li> Alvorens te bereiden, berekenen de hoeveelheid vector die nodig is voor 5 x 10 4 cellen volgens het protocol van de fabrikant ( bijvoorbeeld CytoTune 2.0). De virustiter varieert over het algemeen van 8 x 10 7 - 1,5 x 10 8 . Ontdooi en combineer vectoren 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 en hKlf4 = MOI 3). Deel het bedrag dat is berekend voor de herprogrammering van 5 x 10 4 cellen in geautoclaveerde 1,5 ml buizen. Verdun virusalikwoten met fibroblastmedium tot een eindvolume van 250 μL voor herprogrammering. OPMERKING: Elke injectieflacon is geldig voor herprogrammering van een putje van een 24-putjes weefselkweekplaat met 5 x 10 4 fibroblasten. Bewaar de aliquots van de virus bij -80 ° C. </li></ol></li><li> SeV Vector transductie <ol><li> Aspireren cel cuMedium medium en was met 1 ml DPBS gewassen. Aspireer DPBS en voeg 1 ml trypsine-EDTA (0,05%) toe. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten of totdat cellen losgemaakt zijn. </li><li> Voeg 2 ml fibroblast medium toe en breng de cellen opnieuw op en over te brengen naar een 15 ml buis. Centrifuge 300 xg gedurende 3 minuten. </li><li> Aspirateer de supernatant en resusteer de pellet in 2 ml fibroblast medium. </li><li> Tel fibroblasten door gebruik te maken van een hemocytometer en zaad 5 x 104 cellen in een put van een 24-putjes weefselkweekplaat. Incubeer cellen bij 37 ° C overnacht. </li><li> Aspireren celcultuurmedium, voeg 250 μl van de SeV-oplossing toe en incubeer overnacht bij 37 ° C. </li><li> Dagelijks veranderen in vers fibroblast medium. Laat getransduceerde cellen 7 dagen groeien voordat ze doorgevoerd worden naar LN-521-beklede platen. Bereid de LN-521 borden de dag voor de doorgang. Zie 2.3.1 voor coatingprocedure. </li></ol></li><li> Replateren van getransduceerde fibroblasten <ol><li> Bereiding van LN-521 gecoate gerechten: Verdun LN-521 in DPBS tot een eindconcentratie van 0,63 μg / cm2. Pipet 2 ml van de LN-521 oplossing per 60 mm weefselkweekschotel. Verzegel de 60 mm weefselkweekschotel met parafilm. Incubeer overnacht bij 4 ° C. </li><li> Bereid essentiële 8-medium (E8) aliquots voor gemakkelijker hanteren: 48,5 ml E8-medium, 1 ml E8-supplement en 500 μL PEST ( tabel 1 ). </li><li> 7 dagen na transductie, passeren de cellen naar een LN-521 gecoate 60 mm weefselkweekschotel. Voeg 250 μl Trypsin-EDTA (0,05%) toe en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten of totdat cellen losgemaakt zijn. Voeg 2 ml fibroblast medium toe en centrifugeer cellen gedurende 3 minuten bij 300 x g. </li><li> Aspirateer de supernatant. Resulteer pellet in 2 ml fibroblast medium en tel cellen in een hemocytometer. Aspirate LN-521 oplossing van de voorgelaste plaat en zaad 4 x 10 4 cellen in 5 ml fibroblast medium in de LN-521 precoated 60 mm schotel. Voeg Rho-kinase-remmer Y-27632 toe(ROCKi) tot een uiteindelijke concentratie van 5 μM. Incubeer overnacht in 37 ° C. </li><li> Belangrijk, de volgende dag, verander medium tot E8 medium. E8 dagelijks wijzigen. HiPS celkolonies komen binnen 2 tot 3 weken op. </li></ol></li></ol> 3. Plukken van kolonies en uitbreiding van hiPS-cellen OPMERKING: De volgende stappen worden buiten de biosafety-kast onder een stereomicroscoop uitgevoerd. Het gebruik van haarnet- en proceduremaskers wordt aanbevolen. Werk zorgvuldig om de celcultuur niet te verontreinigen. <ol><li> Bereid LN-521-gecoate weefselkweekplaten 24-putjes de dag voor het plukken. Verdun LN-521 in DPBS 0,63 μg / cm2. Pipette 250 μL van de LN-521 oplossing in één putje van een 24-putjes weefselkweekplaat. Afdichtplaten met parafilm. Incubeer overnacht bij 4 ° C. OPMERKING: Kolonies zijn klaar om geplukt te worden als ze een maat&gt; 1 mm in diameter bereiken. Kolonies zouden scherpe randen moeten laten zien en in homogene mon kunnen groeienOlayers ( figuur 2D ). </li><li> Aspirate de LN-521 oplossing en voeg 500 μL E8 in één putje van een 24-putjes weefselkweekplaat. </li><li> Knip kolonies in kleinere stukken met een scalpel in een rasterpatroon onder een stereomicroscoop. Schraap de celbladen mechanisch uit de schotel en verplaats de bladen met een 200 μL pipet naar de voorbereide put ( Figuur 2D -2E ). Kies kolonies in aparte putjes. </li><li> Laat cellen toe om vast te zetten zonder 48 uur te veranderen. Vervolgens verander E8-medium dagelijks. </li><li> Wanneer de kolonies een grootte hebben bereikt van&gt; 5 mm, enzymatisch doorlopen cellen als enkele cellen naar een nieuwe putje van een LN-521 gecoate plaat. </li><li> Aspiratie van het celkweekmedium uit cellen en wassen met 250 μl DPBS. </li><li> Aspireer DPBS. Voeg 250 μl dissociatie-reagens toe en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 ° C. </li><li> Let op dat de cellen begonnen zijn om op te ronden. losmakenCellen uit de plaat door de cellen een paar keer met dissociatie-reagens te spoelen. </li><li> Voeg 500 μl E8 medium toe aan een 15 ml buis. Breng de cellen in het dissociatie reagens naar de buis en centrifuge gedurende 3 minuten bij 300 x g. </li><li> Aspirateer de LN-521 oplossing uit de LN-521 precoated well en voeg 500 μL kamertemperatuur E8 medium toe. </li><li> Aspirateer de supernatant en resuspendeer de celpellet in 500 μl E8 medium. </li><li> Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en zaad 2,5 x 10 4 - 5 x 10 4 cellen in de voorbereide LN-521 precoated well (1,25 x 10 4 - 2,5 x 10 4 cellen / cm 2 ). Cellcultuur formaat kan gemakkelijk upscaled worden om het beoogde doel te passen. </li><li> Voeg ROCKi toe aan een eindconcentratie van 10 μM. Incubeer cellen bij 37 ° C. </li><li> E8 dagelijks wijzigen. Cellen zijn meestal klaar om na 4 - 6 dagen over te gaan. Enzymatisch doorlopen cellen als enkele cellen zoals hierboven beschreven, wanneer ongeveer 90% samenvloeien. OPMERKING: De herprogrammerende vectoren worden geleidelijk verdund tijdens de hiPS-celuitbreiding en niet detecteerbaar na passage 12. Cells die onpartijdig herprogrammerd zijn, stoppen gewoon om langs de passage 6-10 te prolifereren of hun karakteristieke pluripotente stamcelmorfologie te verliezen ( Figuur 3B ). </li><li> Bevriezen en ontdooien van hiPS-cellen <ol><li> Om cellen te bevriezen, cellen cellen enzymatisch als afzonderlijke cellen zoals hierboven beschreven, tellen cellen in een hemocytometer en verdelen 2,5 x 10 5 cellen naar een 15 ml buis die 1 ml E8 medium bevat. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 3 minuten. Aspirateer de supernatant. </li><li> Resuspende celpellet in 250 μL 4 ° C PSC-cryomedium en overbrengen naar een cryovial. Plaats de injectieflacon in een vriescontainer en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij -80 ° C voordat ze overgebracht worden naar vloeibaar stikstof voor langdurige opslag. </li><li> Voor het ontdooien van cellen, bereide een voorgelaste LN-521 put van een 24-putjes weefselkweekPlaat door de LN-521-oplossing te aspireren en 250 μl E8-medium toe te voegen. Onderdompel het onderkant van de cryovial in 37 ° C water tot er maar een klein ijsje blijft. </li><li> Voeg 250 μL E8 Medium aan de cryovial toe en breng de cel-suspensie over naar een 15 ml-buis en voeg 1 ml E8-medium toe. Spincellen 300 xg gedurende 3 minuten. </li><li> Verwijder de supernatant en resuspende de celpellet in 250 μL kamertemperatuur E8 medium. Zet de celsuspensie over op de voorbereide put en voeg een 1% cellevendigheidsaanvulling toe of 10 μM ROCKi. Incubeer het weefselkweekplaat bij 37 ° C. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration-free+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+retinitis+pigmentosa+patient+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).</li>
<li>Zhou, H., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+induced+pluripotent+stem+cell+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Evolution of induced pluripotent stem cell technology.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Hovatta, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-independent+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Feeder-independent culture of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521-based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521%2FE-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nat Commun. 5, 3195(2014).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Reprogramming+to+Pluripotency+and+Directed+Differentiation+of+Human+Cells+with+Synthetic+Modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).</li>
<li>Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+manufacturing+practice+and+clinical-grade+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines.</a> Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).</li>
<li>Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+express+an+immunogenic+nonhuman+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid.</a> Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).</li>
<li>Kele, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+iPS+cell+line+CTL07-II+from+human+fibroblasts%2C+under+defined+and+xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions.</a> Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).</li>
<li>Uhlin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+iPS+cell+lines+from+monozygotic+twins+in+defined+and+xeno+free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions.</a> Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).</li>
<li>Center for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5th ed, U.S. Department of Health and Human Services. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf">https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf</a> (2009).</li>
<li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).</li>
<li>Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell+culture%3A+considerations+for+maintenance%2C+expansion%2C+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).</li>
<li>Jacobs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-Density+Culture+in+Human+Embryonic+Stem+Cells+Results+in+DNA+Damage+and+Genome+Instability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability.</a> Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).</li>
<li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).</li>
<li>Nichole Wetton, C. C., Zarrabi MacArthur, A. ryan, Lakshmipathy, U. ma Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf</a> (2016).</li>
<li>Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+negative+effect+of+donor+age+and+time+in+culture+on+the+reprogramming+efficiency+into+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Het verwachte resultaat van dit protocol is de succesvolle opwekking van verschillende clonaal afgeleide hiPS-cellijnen. Belangrijk is dat de methode voor het onderhoud en uitbreiding van gevestigde hiPS-cellen hier beschreven, betrouwbaar is en kan worden uitgevoerd met weinig eerdere ervaring van stamcelcultuur. Enzymatische single cell passaging met ROCKi samen met de LN-521 matrix is ​​bekend om cellen als karyotypisch normaal, pluripotent te handhaven en gemakkelijk in staat te differentiëren, terwijl geïnduseerde ...

Sinds de eerste afleiding van hiPS-cellijnen door Takahashi et al. 1 , 2 , hiPS cellen hebben een nuttig hulpmiddel voor ziekte modelleren, drug ontdekking en als bronmateriaal voor het genereren van celtherapieën in regeneratieve geneeskunde 3 verschaft . HiPS celcultuur is al lang afhankelijk van co-cultuur met fibroblast feedercellen 4 , 5 of op Matrigel 6 en met media formuleringen die foetaal boviene serum (FBS) bevatten. Batch-to-batch varianties zijn een gemeenschappelijk gevolg van de ongedefinieerde aard van deze cultuuromstandigheden, wat resulteert in onvoorspelbare variaties, die een belangrijke bijdrage leveren aan de onbetrouwbaarheid van deze protocollen 7 . De ontwikkeling van gedefinieerd medium, zoals essentiële 8 (E8) 8 en gedefinieerde celkweekmatrices, bijvoorbeeld LN-521 9 , toestaanS voor de oprichting van hoogst reproduceerbare protocollen en hulp bij de robuuste generatie en het onderhoud van homogene hiPS cellen 7 , 8 , 9 , 10 . Ontwikkeling van integratie gratis herprogrammeringstechnieken is een stap vooruit. Oorspronkelijk was herprogrammering afhankelijk van retrovirale vectoren die willekeurig in het genoom geïntegreerd werden met verstorende effecten op genomische integriteit 11 . Voorschotten in herprogrammeringsmethoden omvatten de ontwikkeling van RNA-gebaseerde vectoren. RNA-vectoren hebben een voordeel ten opzichte van de DNA-gebaseerde herprogrammeringsmethode aangezien onbedoelde integratie via genomische recombinatie niet mogelijk is 12 . SeV-vectoren verschaffen hoge en voorbijgaande expressie van exogene factoren door enkelstrengs RNA zonder een DNA-fase 11 . De herprogrammerende vectoren geleverd door de SeVWorden door de celuitbreiding verdund en worden uiteindelijk uit de cultuur afgevoerd, waardoor een vrije afdrukmogelijkheid voor fotoprints mogelijk is. Daarna is het onderhoud van pluripoten afhankelijk van endogene expressie van de pluripotentiegenen 2 . Aangezien pioniersvolle therapieën van HiPS-cel beginnen te verplaatsen naar klinische proeven, zijn de eisen aan gestandaardiseerde partijen, reproduceerbaarheid en veiligheid essentiële problemen om 13 aan te pakken. Daarom moeten producten van dierlijke oorsprong worden vermeden. Bijvoorbeeld, het gebruik van xenogene producten is geassocieerd met het risico op nonhuman pathogeen besmetting. Ook hebben cellen die zijn gekweekt in aanwezigheid van dierlijke afgeleide cultuurcomponenten, aangetoond dat niet-humane siliaczuren in celmembranen worden opgenomen, die dreigen om afgeleide cellen immunogene 14 te maken . Daarom is de noodzaak om xenogene producten te elimineren nodig voor toekomstige klinische werkzaamheden. Dit protocol is van toepassing op xeGeen-vrije en gedefinieerde cultuur bij het behoud van hiPS-cellen die cellen dichter bij de klinische naleving bewegen. Dit protocol beschrijft een consistente, zeer reproduceerbare en makkelijk te gebruiken methode die gestandaardiseerde hiPS cellen van fibroblasten genereert. Het biedt ook een gebruiksvriendelijk cultuursysteem voor het behoud van gevestigde hiPS-cellen. Dit protocol is gebruikt om meer dan 300 hiPS-cellijnen af ​​te leiden in de Zweedse nationale menselijke iPS Core-faciliteit van het Karolinska Institutet, waarvan sommige lijnen eerder 15 , 16 zijn beschreven.

<table><tbody><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>171105-041</td><td>Biopsie-digestie</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>Biopsie-digestie</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td>Fibroblastmatrix</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>21980002-032</td><td>Fibroblasmedium</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td>Fibroblasmedium</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td>Antibioticum</td></tr><tr><td>Essential 8 media</td><td>ThermFisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>iPS-celcultuurmedium</td></tr><tr><td>LN-521</td><td>Biolamina</td><td>LN521-03</td><td>iPS-celcultuurmatrix</td></tr><tr><td>TrypLE select 1X</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12563011</td><td>Dissociatiereagens</td></tr><tr><td>Rho-kinase inhibitor Y27632</td><td>Millipore</td><td>SCM075</td><td>Rho-kinase-remmer (ROCKi)</td></tr><tr><td>CytoTune &ndash; iPS 2.0 reprogramming kit</td><td>Life Technologies</td><td>A1377801</td><td>Sendai-virus-herprogrammeringsvector</td></tr><tr><td>35 mm weefselkweekschaal</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900.300</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>60 mm weefselkweekschalen</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901.300</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>24 well weefselkweekplaten</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922.300</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>T25 weefselkweekkolven</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>15 mL buisjes</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>Centrifugebuisjes</td></tr><tr><td>1.5 mL buisje</td><td>Eppendorf</td><td>0030123.301</td><td>1.5 mL buisje</td></tr><tr><td>CoolCell cell LX</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td>Invriescontainer</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ml</td><td>Fibroblasinvriezen</td></tr><tr><td>Cryovials 1.8 mL</td><td>VWR</td><td>479-6847</td><td>Cryovials</td></tr><tr><td>PSC Cryopreservation Kit</td><td>Gibco</td><td>A2644601</td><td>PSC CryomediumRevitaCell-supplement</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>25300054</td><td>Fibroblasdissociatie-enzym</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>31331-028</td><td>Verdunningsmiddel voor spijsverteringsenzym</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>PBS</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFIsher Scientific</td><td>14025-050</td><td>Biopsievoorbereiding</td></tr><tr><td>Haemocytometer</td><td>Sigma</td><td>BRAND, 718920</td><td>Celtelling</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>291-1213</td><td>Platen afdichten voor opslag</td></tr></tbody></table>

integratie gratis derivatie van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen met laminine 521 matrix

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-vrije en volledig gedefinieerde condities zijn belangrijke parameters voor robuuste en reproduceerbare generatie van homogene, geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen. Onderhoud van hiPS-cellen op feedercellen of ongedefinieerde matrices zijn vatbaar voor batchafwijkingen, pathogene verontreiniging en risico op immunogeniciteit. Het gebruik van de gedefinieerde recombinant humane laminin 521 (LN-521) matrix in combinatie met xenovrije en gedefinieerde media formuleringen vermindert de variabiliteit en zorgt voor een consistente generatie van hiPS cellen. De Sendai-virus (SeV) -vector is een niet-integrerend RNA-systeem, waardoor problemen die verband houden met het potentiële ontwrichtende effect op genoomintegriteit die integratie-vectoren kunnen hebben, worden omzeild. Bovendien hebben deze vectoren relatief hoog rendement bij de herprogrammering van dermale fibroblasten aangetoond. Bovendien vergemakkelijkt enzymatische single cell passage van cellen homogeen onderhoud van hiPS cellen zonder aanzienlijke eerdere ervaring van stamcellenLl cultuur. Hier beschrijven we een protocol dat uitgebreid getest en ontwikkeld is met een focus op reproduceerbaarheid en gebruiksgemak, waardoor een robuuste en praktische manier is om gedefinieerde en xeno-vrije humane hiPS-cellen van fibroblasten te genereren.

Van biopsie naar hiPS-cellen Het gehele proces van biopsie naar gevestigde hiPS-cellen, waarbij u de programmeringsvector opnieuw wilt programmeren en klaar voor karakterisering, duurt ongeveer 16 weken ( Figuur 1 ). Een meer gedetailleerde tijdlijn is gespecificeerd in figuur 2A . Ongeveer 4 weken is nodig om fibroblastculturen vast te stellen en uit te breiden. De eers...

Robuuste afleiding van door mensen geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen werd bereikt door gebruik te maken van niet-integratie van Sendai virus (SeV) vector gemedieerde herprogrammering van dermale fibroblasten. HiPS cel onderhoud en clonale uitbreiding werd uitgevoerd met behulp van xeno-vrije en chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden met recombinante humane laminine 521 (LN-521) matrix en essentiële E8 (E8) medium.

Integratie Gratis Derivatie van Menselijk Geïnduceerde Pluripotente Stamcellen Met Laminine 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Het algemene doel van dit protocol is het verkrijgen van homogene menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze methode kan worden gebruikt om menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen te verkrijgen voor vele doeleinden, waaronder ziektemodellering, screening van geneesmiddelen of het verkrijgen van cellen voor preklinische celtherapie-trials. Het voordeel van dit protocol is dat het robuust is en homogene cellen genereert die worden onderhouden in een gebruiksvriendelijk, xeno-vrij en volledig chemisch gedefinieerd culturesysteem.Omdat menselijke iPS-cellen de genetische achtergrond van het donorweefsel reproduceren en potentieel kunnen worden gedifferentieerd in elk ziekterellevant celtype, vormen ze uitstekende instrumenten voor ziektemodellering. De dissectie van het biopsaat en het selecteren van kolonies zijn complexe procedures. Het zien van deze handelingen door ervaren handen helpt bij het begrijpen van de procedures en maakt herhaling eenvoudiger.De procedure wordt vandaag gedemonstreerd door Harriet RonnHolm en Kelly Day, twee zeer ervaren laboratoriumtechnici van de iPS Core Facility aan het Karolinska Institutet. Huidbiopsieën kunnen tot 48 uur worden bew

integration-free-derivation-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We hebben een protocol voor de inductie van neuroblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke neurale voorouders en neuronale celtypes in het ontwikkelen van CNS voor neurale reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

We presenteren een protocol voor een efficiënte herprogrammering van menselijke somatische cellen in het menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met behulp van retrovirale vectoren die coderen voor Oct3 / 4, Sox2, Klf4 en c-myc (OSKM) en de identificatie van de opnieuw aangeleerd hiPSC door live kleuring met Tra- 1-81 antilichaam.

Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten

Hier presenteren we protocollen voor de cultuur van humane pluripotente stamcellen (hPSC), gebaseerd op het groeien van gedissocieerde enkele cellen in een niet-kolonietype monolaag (NCM). Deze nieuwe methode, die gebruik maakt van Rho-geassocieerde kinase remmers of de laminine isovorm 521 (LN-521), is geschikt voor het produceren van grote hoeveelheden homogene hPSC's, genetische manipulatie en geneesmiddelontdekking.

Alternatieve Cultures for Human pluripotente stamcellen zijn Productie, Onderhoud, en genetische analyses

We beschrijven een protocol voor het afleiden van op lentivirus gebaseerde, gereprogrammeerde en gekarakteriseerde factorvrije humane geïnduceerde pluripotente stamcellen en de omzetting hiervan in vermeende klinische-kwaliteitscondities.

Afleiden en karakterisatie van een Transgene gratis humane geïnduceerde pluripotente Stem Cell Line en de omschakeling naar Defined Klinisch-grade Voorwaarden

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Dit manuscript geeft een stapsgewijze procedure voor het verkrijgen en onderhouden van humane keratinocyten uit getrokken haar en de daaropvolgende generatie van integratievrije menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) door middel van episomale vectoren.

Generatie van Integratie-vrije mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van Hair-afgeleide keratinocyten

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor efficiënte generatie van integratievrije iPSC's uit menselijke volwassen perifere bloedcellen. Met behulp van vier oriP/EBNA-gebaseerde episomale vectoren om de herprogrammeringsfactoren, KLF4, MYC, BCL-XL, of OCT4 en SOX2 tot expressie te brengen, kunnen duizenden iPSC-kolonies worden verkregen uit 1 mL perifeer bloed.

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

De hier gepresenteerde methode beschrijft een schaalbaar en Good Manufacturing Practice (GMP) -ready differentiatie systeem om menselijke hepatocyt-achtige cellen uit pluripotente stamcellen te genereren. Het dient als een kosteneffectief en gestandaardiseerd systeem menselijke hepatocyt-achtige cellen voor fundamenteel en toegepast onderzoek humane lever genereren.

Gedefinieerd en Scalable Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Het doel van het protocol is om verschillende extracellulaire matrix (ECM) coatingcondities te vergelijken om te beoordelen hoe differentiële coating de groeisnelheid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) beïnvloedt. In het bijzonder streven we ernaar om voorwaarden te creëren om een optimale groei van iPSC-culturen te verkrijgen.

Het meten van de samenvloeiing van iPSC's met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem.

Het doel van dit artikel is om een gestandaardiseerde aanpak te bieden om menselijke hepatische voorloperdifferentiatie van pluripotente stamcellen te induceren. De ontwikkeling van deze procedure met kant-en-klare mediaformuleringen biedt de gebruiker een gemakkelijk systeem om menselijke levercellen te genereren voor biomedisch onderzoek en vertaling.

Hepatische voorloperspecificatie van pluripotente stamcellen met behulp van een gedefinieerd differentiatiesysteem

Leer een robuuste methode voor het afleiden van homogene humane geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van niet-integrerend Sendai-virus en laminine 521 matrix.

Integratie Gratis Derivatie van Menselijk Geïnduceerde Pluripotente Stamcellen Met Laminine 521 Matrix

Meer video's verkennen