Integratie Gratis Derivatie van Menselijk Geïnduceerde Pluripotente Stamcellen Met Laminine 521 Matrix
7 juli 2017
Robuuste afleiding van door mensen geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen werd bereikt door gebruik te maken van niet-integratie van Sendai virus (SeV) vector gemedieerde herprogrammering van dermale fibroblasten. HiPS cel onderhoud en clonale uitbreiding werd uitgevoerd met behulp van xeno-vrije en chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden met recombinante humane laminine 521 (LN-521) matrix en essentiële E8 (E8) medium.
Het algemene doel van dit protocol is om homogene humane geïnduceerde pluripotente stamcellen te verkrijgen. Deze methode kan worden gebruikt om humane geïnduceerde pluripotente stamcellen te verkrijgen voor vele doeleinden, waaronder ziektemodellering, geneesmiddelenscreening of om cellen te verkrijgen voor preklinische celtherapieproeven. Het voordeel van dit protocol is dat het robuust is en homogene cellen genereert die worden onderhouden in een gebruiksvriendelijk, Xeno-vrij en volledig chemisch gedefinieerd kweeksysteem.
Aangezien humane iPS-cellen de genetische achtergrond van het donorweefsel nabootsen en potentieel kunnen worden gedifferentieerd in elk ziekte-relevant celtype, bieden ze uitstekende hulpmiddelen voor thesismodellering. De biopsiesnede en koloniepicking zijn ingewikkelde procedures. Ze met ervaren handen zien uitvoeren, helpt bij het begrijpen van de procedures en maakt het gemakkelijker om te herhalen.
Het demonstreren van de procedure vandaag zal Harriet RonnHolm en Kelly Day zijn, twee zeer ervaren laboratoriumtechnici van de iPS Core Facility bij het Karolinska Institutet. Huidbiopsiemonsters kunnen maximaal 48 uur worden bewaard in PBS plus 1% penicilline streptomycine bij vier graden Celsius, maar moeten zo snel mogelijk worden verwerkt nadat ze zijn verkregen. Breng de biopsie over naar een schaal van 35 millimeter.
Dompel de huidbiopsie gedurende 30 seconden onder in een schaal van 35 millimeter met twee milliliter 70% ethanol. Voeg één milliliter steriele Hank's Balanced Salt Solution, aangevuld met 1% penicilline streptomycine, toe aan een nieuwe schaal van 35 millimeter en breng de biopsie over naar de nieuwe schaal. Breng de biopsie over naar een vier schaal van 35 millimeter gevuld met één milliliter vers bereide 0,1% dispase-oplossing.
Gebruik steriele chirurgische scalpels en pincetten om de huidbiopsie in stukken van één tot twee kubieke millimeter te snijden. Breng de biopsie stukken met de dispase-oplossing over in een buis van 15 milliliter en voeg nog eens twee milliliter dispase toe. Spoel de schaal van 35 millimeter af met één milliliter dispase-oplossing en breng de gespoelde oplossing over in de buis van 15 milliliter.
Incubeer de biopsie gedurende een nacht bij vier graden Celsius. De volgende ochtend voegt u vier milliliter 0,1% collagenase I toe aan de buis met de biopsiestukken en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende vier uur. Dertig minuten voordat de cellen worden gezaaid, bedekt u één put in een zes-putten kweekplaat met één milliliter 0,1% gelatine in DPBS.
Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Na vier uur incubatie met collagenase, centrifugeert u de gedigereerde cellen bij 300 keer g gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Aaspibeer de supernatant en hersuspendeer de digest in twee milliliter fibroblastmedium.
Verwijder de gelatine-oplossing uit de eerder bereide zes-putten kweekplaat. Breng de celsuspensie inclusief eventuele resterende weefselstukken over naar de zes-putten plaat. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide in hoge luchtvochtigheid.
Fibroblasten zijn klaar om te worden gepassageerd naar een T25 kweekflacon wanneer ze 80% confluent zijn. Fibroblasten in passage twee tot vier zijn optimaal voor reprogrammering, aangezien de reprogrammeringsefficiëntie over het algemeen hoger is voor fibroblasten met een lagere passage. Aaspibeer het kweekmedium uit de flacon en was de cellen met één milliliter DPBS.
Aaspibeer de DPBS en voeg één milliliter 0,5% Trypsin EDTA toe. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten of totdat de cellen loslaten. Voeg twee milliliter fibroblastmedium toe, hersuspendeer de cellen en breng de celsuspensie over naar een buis van 15 milliliter.
Centrifugeer bij 300 keer g gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Aaspibeer de supernatant en hersuspendeer de pellet in twee milliliter fibroblastmedium. Na het tellen van de fibroblasten met behulp van een hemacytometer, zaait u vijf keer 10 tot de vierde cellen in één put van een 24-putten kweekplaat.
Incubeer de cellen gedurende een nacht bij 37 graden Celsius. Op de volgende dag, omdat Sendai-virus zal worden behandeld, vervolgt u de procedure in een aangewezen BSL-2 laboratorium terwijl u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen gebruikt. Aaspibeer het kweekmedium en voeg 250 microliter Sendai-virusoplossing toe.
Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius. Een dag voordat de kolonies worden gepikt, bereidt u LN-521 gecoate 24-putten kweekplaten voor. Pipetteer 250 microliter LN-521-oplossing in één put van een 24-putten plaat.
Verzegeld de plaat met parafilm en incubeer bij vier graden Celsius gedurende een nacht. De volgende dag aaspibeert u de LN-521-oplossing uit de ene put van de 24-putten plaat en voegt u 500 microliter E8 toe aan de put. Het is aanbevolen om een haarnet en proceduremasker te dragen tijdens het pikken van kolonies onder de stereomicroscoop.
Koloningen zijn klaar om te worden gepikt wanneer ze een grootte van meer dan één millimeter in diameter bereiken, scherpe randen vertonen en groeien in homogene monolagen. Kies geen kolonies met wazige randen en grote ongecompacte heterogene celmassa's. Snijd elke kolonie met een scalpel in kleinere stukken in een rasterpatroon.
Gebruik een pipet van 200 microliter om de cellagen mechanisch van de schaal te schrabben en breng de laag vervolgens over naar een put van een 24-putten kweekplaat die eerder is gecoat met LN-521. Kolonieselectie is cruciaal voor het succes van dit protocol. Het pikken van een paar extra kolonies zal een voldoende aantal aanhechtende cellen waarborgen.
Laat de cellen 48 uur lang aanhechten zonder het E8-medium te verversen. Enzymatisch passeer de cellen wanneer de kolonies een grootte van meer dan vijf millimeter hebben bereikt. Aaspibeer het kweekmedium van de cellen en was met 250 microliter DPBS.
Aaspibeer de DPBS en voeg 250 microliter dissociatiere
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een robuuste methode voor het verkrijgen van homogene menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) uit dermale fibroblasten met behulp van niet-integrerende Sendai-virusvectoren. De kweekcondities zijn xeno-vrij en chemisch gedefinieerd, wat clonale expansie en het onderhoud van de hiPSCs faciliteert.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Stamcelbiologie
- Celherprogrammering
- Regeneratieve Geneeskunde
Achtergrond
- Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) kunnen differentiëren in verschillende celtypen.
- hiPSCs behouden de genetische achtergrond van het donorweefsel.
- Ze zijn waardevol voor ziektemodellering en drugscreening.
- Het protocol legt de nadruk op een gebruiksvriendelijk, chemisch gedefinieerd culturesysteem.
Doel van de studie
- Om homogene hiPSCs te verkrijgen voor diverse toepassingen.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor preklinische celtherapie-onderzoeken.
- Om het begrip van complexe procedures te verbeteren door middel van visuele demonstraties.
Gebruikte methoden
- Niet-integrerende Sendai-virusvector voor herprogrammering.
- Gebruik van recombinante menselijke laminine 521 (LN-521) matrix.
- Essential E8 (E8) medium voor celonderhoud.
- Complexe procedures, waaronder biopsie-dissectie en het selecteren van kolonies.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle afleiding van homogene hiPSCs.
- Onderhoud van cellen onder xeno-vrije en chemisch gedefinieerde omstandigheden.
- Demonstratie van procedures verbetert de reproduceerbaarheid.
- De gegenereerde hiPSCs kunnen worden gebruikt voor diverse onderzoeksapplicaties.
Conclusies
- Het protocol biedt een robuust kader voor de derivatie van hiPSC's.
- hiPSC's zijn effectieve instrumenten voor het modelleren van ziekten en het testen van geneesmiddelen.
- Visuele hulpmiddelen in het protocol verbeteren het begrip en de uitvoering.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Dit protocol maakt een robuuste, xeno-vrije derivatie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) uit dermale fibroblasten mogelijk met behulp van niet-integrerende Sendai-virusvectoren en een laminine 521-matrix. Het volledig gedefinieerde, chemisch gedefinieerde cultuursysteem vermindert variabiliteit en ondersteunt de reproduceerbare generatie van homogene hiPSC-lijnen die geschikt zijn voor downstream-toepassingen. De methode biedt een schaalbare, gebruiksvriendelijke aanpak voor ziektemodellering, drugscreening en preklinische ontwikkeling van celtherapie in biopharma R&D-pipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken met behulp van genetisch gematchte menselijke cellen die de achtergrond van het donorweefsel recapituleren.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door het leveren van homogene, pluripotente celpopulaties voor functionele assays ter validatie van targets.
- Predictieve waarde: Verhoogt het vertrouwen in de beoordeling van targets in een vroeg stadium door middel van reproduceerbare, gedefinieerde cellulaire modellen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Genereert gevalideerde hiPSC-lijnen die geschikt zijn voor gestandaardiseerde, reproduceerbare compound-screening onder xeno-vrije omstandigheden.
- Schaalbaarheid: Enzymatische single-cell passaging faciliteert de expansie en het banken van homogene celpopulaties voor high-throughput screening.
- Hergebruik van platform: De gedefinieerde LN-521 matrix en het E8-medium ondersteunen een consistente assay-prestatie over meerdere screeningscampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Afgeleide hiPSCs behouden de genetische achtergrond van de donor, waardoor modellering van patiëntspecifieke ziektefenotypes mogelijk is.
- Translationele continuïteit: Ondersteunt de voortgang van ontdekking naar preklinische validatie met behulp van genetisch stabiele, niet-integrerende gereprogrammeerde cellen.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: De afwezigheid van vectorintegratie vermindert zorgen over genomische instabiliteit, wat de voorspelbaarheid van preklinische resultaten verbetert.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm van fibroblast-reprogrammering tot uitgebreide hiPSC-banken, ter ondersteuning van toepassingen in ziektemodellering, drugscreening en de ontwikkeling van preklinische assays.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetesten en het verduidelijken van pathways mogelijk met behulp van genetisch gedefinieerde menselijke celmodellen.
- Screening: Produceert assay-klaar, homogene hiPSC-populaties met een consistente morfologie en pluripotentie voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Ondersteunt kwantitatieve read-outs via immunocytochemie, PCR en differentiatie-assays om de pluripotentie en lineage-potentieel te beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert continuïteit naar preklinische studies door de generatie van klinisch relevante, xeno-vrije hiPSC-lijnen.
- Enterprise Reuse: Een gedefinieerd matrix- en mediasysteem maakt gestandaardiseerde, reproduceerbare hiPSC-derivatie mogelijk over projecten en locaties heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid door genetisch stabiele, homogene hiPSC-lijnen met bevestigde pluripotentie en trilineage-differentiepotentieel.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via xeno-vrije, gedefinieerde kweekcondities en enzymatische passage.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het verminderen van biologische variabiliteit en mechanistische ambiguïteit in vroege modelstadia.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk met behulp van klinisch transleerbare, patiënt-afgeleide cellulaire modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, enzymatische passaging en technieken voor het plukken van koloniën.
- Afhankelijk van toegang tot BSL-2-faciliteiten voor de omgang met het Sendai-virus en passende PBM.
- Vereist gestandaardiseerde coatingprotocollen voor LN-521-matrix en een gedefinieerde bereiding van E8-medium.
- Vereist training in selectie van koloniën met scherpe randen om homogeniteit en pluripotentie te waarborgen.
- Beperkt door de noodzaak van nauwkeurige biopsieverwerking en getimede stappen voor enzymatische digestie.
