Name: Elektrofysiologische opname van Drosophila Trichoid Sensilla in reactie op geurstoffen met lage volatiliteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Leer elektrofysiologische opname van Drosophila trichoïde sensilla bij lage-vluchtigheid geurstoffen. Deze methode maakt effectieve presentatie van feromonen mogelijk voor onderzoek naar insectencommunicatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Ye Zhang voor de hulp met de voorbeeldsporen en Tin Ki Tsang voor de hulp met de foto&#39;s. Dit werk werd ondersteund door een Ray Thomas Edwards Foundation Early Career Award en een NIH-subsidie ​​(R01DC015519) aan C.-YS en NIH subsidies (R01DC009597 en R01DK092640) aan JWW

1. Voorbereiding van de hardware voor at4 opname <ol><li> Gebruik een pipettrekinstrument om elektroden voor te bereiden met aluminosilicaatglas capillairen (OD 1.0 mm, ID 0.64 mm). Knop het uiteinde van de referentieelektrode lichtjes aan met een paar fijne tangen om de invoeging in de clypeus van de vlieg te vergemakkelijken ( dwz een afgeronde plaat aan de voorzijde van de vliegkop boven de monddelen). OPMERKING: In deze studie werden 7-jarige WT-mannen (Berlijn) gebruikt. Gebruik AHL-zoutoplossing 14 als de elektrolyt voor beide elektroden. </li><li> Bereid 1 liter AHL door het mengen van 900 ml gedestilleerd water met 6,312 g NaCl, 0,373 g KCI, 0,337 g NaHCO3, 0,1120 g NaH 2PO 4, 1,892 g trehalose ּ 2 H2O, 3,423 g sucrose, 1.192 g HEPES en 8,2 ml 1 M MgCl2. Met gedestilleerd water breng het totale volume tot 1 liter. Breng de pH tot 7,4 met 1 N NaOH en steriliseer de oplossing met eenVacuümgedreven filtersysteem. Voor langdurige opslag, houd de AHL-porties bij 4 ° C. OPMERKING: Consistente leveringen van palmitoolzuur zijn afhankelijk van uniformiteit tussen cartridges. Het is cruciaal dat elke cartridge op een reproduceerbare manier is samengesteld. </li><li> Gebruik een scheermesje, verwijder 0,9 cm van de punt van een 200 μL pipetpunt om de eerste patroon sectie te maken, met een lengte van 4,1 cm; Verwijzen naar de afmetingen die gedetailleerd zijn in figuur 1A . Gebruik nog eens 200 μL pipettip en verwijder 1,7 cm en 1,5 cm van de punt en de basis, respectievelijk, om de tweede patroon sectie te maken, 1,8 cm ( figuur 1A ). Gebruik een liniaal om reproduceerbaarheid te waarborgen. </li><li> Gebruik een ⅛ &quot;hole puncher om discs uit filterpapier te snijden. </li><li> Gebruik tangen om een ​​filterpapierschijf aan de uiteinde van de tweede cartridge sectie te plaatsen. Bevestig visueel dat er een opening in de cartridge tip is, waardoor de lucht kan passeren. </li><li> Bevestig de eerste en tweede cartridge secties, zoals weergegeven in Figuur 1A . Hoek de tweede patroon sectie naar beneden om het vierkant te richten op het prep ( figuur 1B ). </li><li> Sluit de cartridge aan met de geurafgiftebuis, die op een micromanipulator is gemonteerd. OPMERKING: Met dit ontwerp kunt u de cartridge naar buiten zwenken om uitwisseling te vergemakkelijken ( Figuur 1C ). </li><li> Stel de constante bevochtigde luchtstroom in op 2 L / min in één massa controller en de geurvloeistof stroomt tot 500 mL / min in een andere massa controller. </li><li> Gebruik de software (zie de Tabel van Materialen ), programmeer de procedure om een ​​500 ms geurpuff te beheren. </li></ol> 2. Bereiding van Palmitoleenzure Oplosmiddeloplossingen voor Levering OPMERKING: Or47b ORNs reageren op zowel cis- als trans- palmitoolzuur. Aangezien palmitolezuur onstabiel is bij RT, de voorraden worden opgeslagen bij -20 ° C en worden gebruikt binnen een maand na opening. Ethanol is het oplosmiddel van keuze voor palmitoolzuur. <ol><li> Gebruik een vortexmenger om 10 μl cis- of trans- palmitolzuurvoorraden of verdunningen met 90 μl 100% ethanol voor tienvoudige seriële verdunningen in 1,7 ml microtubes grondig te mengen. Bereid verse palmitoolzuurverdunningen dagelijks voor experimenten uit en gebruik binnen een dag. OPMERKING: Voor geurstoffen die niet in ethanol oplosbaar zijn, wordt een glazen fles aanbevolen voor het bereiden van geurverdunningen met andere soorten organische oplosmiddelen. </li><li> Gebruik van een P10 micropipette 5 μl cis -palmitoolzuuroplossingen van de gewenste verdunningen aan het filterpapier in elke bijbehorende patroon. OPMERKING: De hoogste dosering (10 -1 ) bevat 450 μg van de verbinding. Voor trans- palmitoolzuuroplossingen dient u in plaats daarvan 4,5 μl toe te passen, zodat de hoogste dosering (10 -1 ) ook 450 μg t bevatHij is samengesteld. </li><li> Om het oplosmiddel volledig te verdampen, plaats de palmitoolzuurcartridges in een vacuümdroogmiddel gedurende 1 uur bij RT en 7,59 mmHg druk. OPMERKING: De cartridges kunnen maximaal 4 uur bij RT worden gebruikt. </li></ol> 3. Bereiding van Drosophila voor Klaar Toegang tot de At4 Sensilla voor In Vivo Electrofysiologische Opnamen OPMERKING: WT vliegen (Berlijn) worden opgemaakt in standaard maïsmeelmedium bij 25 ° C in een 12:12 lichtdonkere cyclus. Bij eclosie worden vliegen gescheiden naar geslachten in groepen van tien, waardoor ze tot 7-jarige leeftijdsgroepen zijn. Or47b ORNs in zowel mannelijke als vrouwelijke vliegen reageren op palmitoolzuur. Voor de eenvoud worden alleen mannelijke vliegen onderzocht in de huidige studie. <ol><li> Monteer een fly-prep slide: op een glasplaatje, plaats een glazen dekglaasje (18 x 18 mm2) met een kleine hoeveelheid klei, die een ~ 3 ° hoek met de glasplaatje. Plaats dubbelzijdige tape op de binnenkant eDge van de deklaag en op het dia vlak onderaan. Vervang met verse tape voor elke dag van opname ( afbeelding 2A ). </li><li> Gebruik een vliegasasier 15 om de vliegvlieg in de buis te verzamelen en past dan een 200-pipetip over het uiteinde van de buis. Tegelijkertijd de buis naar voren terwijl u lucht in de buis waait om de vlieg naar het einde van de pipetstip te duwen. Gebruik een scheermesje om net onder het lichaam van de vlieg en 2 hoofdlengtes boven de vlieg te snijden. </li><li> Steek de bodem van de pipettip met modelleerklep aan, duw de vlieg naar boven totdat de antenne en de clypeus worden blootgesteld ( figuur 2B ). Om te vermijden dat de vliegen worden vermoord, voegt u alleen genoeg klei toe om de antenne en aristae bloot te stellen, omdat dit voorkomt dat de buik van de vlieg wordt gebroken. Voeg ook langzaam en zachtjes klei toe om eventuele plotselinge constrictie te voorkomen. Bevestig dat de vlieg levend is door te kijken naar antennesOf proboscisbeweging. </li><li> Gebruik pincet om de pipet tip te manoeuvreren die de vlieg herbergt. Richt het hoofd zodanig dat de clypeus naar rechts van de waarnemer staat. Pas de prep langs de deklip aan met behulp van fijne tang tot de laterale zijde van de antenne tegen het tapijtoppervlak ligt ( Figuur 2B ). </li><li> Plaats een houderstang op de arista om de antenne vast te zetten op de dubbelzijdige tape om beweging te voorkomen ( Figuur 2B ). OPMERKING: De houderstang wordt getrokken uit een borosilicaatglazenkapillaire met een pipettrekker en in stand gehouden met modellerende klei ( figuur 2A ). </li><li> Plaats de prep op het podium van de tuig ( Figuur 2C ). Bevestig met behulp van de microscoop dat de trichoïden zichtbaar zijn langs de distale zijde van het derde segment van de antenne. OPMERKING: Ideaal gezien, moet de sensilla duidelijk op de achtergrond worden gesilhouetteerd, wat hun eenvoud vereenvoudigt<html> Identificatie en vergemakkelijkt opname ( figuur 3 ). In deze voorbereiding zijn de meeste toegankelijke trichoid sensilla van het type at4. </li><li> Houd de prep onder een constante bevochtigde luchtstroom (2 L / min), die via een aparte luchttoevoerbuis geleverd wordt op ongeveer 2 cm afstand van de prep ( Figuur 4 ), zoals eerder beschreven 2 , 15 . </li></ol> 4. Opname van at4 Sensillum Activiteit van Or47b ORNs in de at4 Trichoïden in reactie op Palmitoleenzuur <ol><li> Plaats de referentieelektrode in de clypeus ( Figuur 3A ). Om weefselbeschadiging te vermijden, zorg ervoor dat de elektrode net onder het oppervlak zit, waar het hemolymph onder de kutikula kan contacteren, met een snelle en soepele beweging. </li><li> Laat de opnameelektrode langzaam zakken tot het in hetzelfde perspectief komt als het doel sensillum (= &quot;Xfig&quot;&gt; Figuur 3B). Opnemen onder een 50X objectieflens. OPMERKING: De zware trichoidale kutikula zorgt ervoor dat de opnameelektrode in de sensulaire basis wordt geplaatst, waarvan het bredere gebied een groter doelwit geeft, waardoor de kans op de elektrode wordt weggenomen ( Figuur 3B , inset) vermindert. </li><li> Voordat u geurstimulaties toepast op een sensillum, let op de volgende selectiecriteria; Elke trichoid die niet aan deze normen voldoet, moet worden afgewezen en in plaats daarvan een andere sensillum gekozen. <ol><li> Let op een hoge signaal-ruisverhouding (zie figuur 3C voor een voorbeeld). </li><li> Let op identificeerbare spikes van at4A en at4C neuronen ( Figuur 3C ). OPMERKING: Opmerking, de at4B spijker amplitude lijkt zeer vergelijkbaar met at4A 10 en kan niet gemakkelijk worden geïdentificeerd zonder geur stimulatie. </li><li> Let op dat de basale brandfrequentie van de at4A neuronen isRond of onder 20 Hz. OPMERKING: Dit criterium is specifiek voor at4A omdat de basale brandfrequentie voor de neuron hoger is dan die van de basiconische ORNs 2 . Een veel hogere basale branding geeft aan dat de neuronen tijdens de elektrode-invoeging beschadigd kunnen zijn. </li></ol></li><li> Sluit de cartridge aan op de geurstofafgiftebuis. Begin met de oplosmiddelcontrole en vervolgens de geurstoffen, van lage tot hoge concentraties. Gebruik de micromanipulator om de cartridge naar de prep te manoeuvreren terwijl u de cartridge helemaal in de kop van de prep stuurt. Bevestig visueel dat de cartridge rechtstreeks op de antenne is gericht ( figuur 4 ) vanaf een paar millimeter weg. OPMERKING: Het doel is de opening van de cartridge direct op de antenne te oriënteren en te plaatsen in de nabijheid van het doelweefsel. </li><li> Zorg ervoor dat de geurpatroon van de opnameelektrode aan de rechterkant is gescheiden van 1 - 2 mm en van de vliegvoorzijdeP onderaan met ongeveer 1 mm. OPMERKING: In de hier beschreven beschrijving is de geurcartridge nauw begrensd door de opnamelektrode, de referentieelektrode en de vlieg-prep-dia ( Figuur 4 ). OPMERKING: Let op de afstand tussen de cartridge en de opname- / referentieelektroden. Een afstand van ongeveer 4 mm wordt aanbevolen 1 . Onbedoeld contact kan het signaal stoppen en de punt van de opnameelektrode breken, de huidige neuron beschadigen en verdere opnames compliceren. OPMERKING: Beschouw de afstand die de cartridge en de vliegende prep dia scheidt. Als u de coverlip aanraakt, kan de opname-elektrode ook worden ontworpen om de opname te storen. </li><li> Druk op &quot;Record&quot; in de data acquisition software om de opname te starten. OPMERKING: Voor elke 10 s opname wordt een enkele 500 ms geurpuls direct aan de antenne geleverd, zoals beschreven in stap 1.9. </li><li> Na het toepassen van geurstoffen,Zet de cartridge voorzichtig terug voordat u hem vervangt met een patroon met de volgende hoogste concentratie. Ga door totdat het volledige doseringsbereik is verkregen. OPMERKING: Het is aan te bevelen dat er slechts één Or47b ORN van elke vlieg wordt opgenomen om eventuele effecten van aanpassing te vermijden. </li><li> Spoel de opnamelektrode met gedestilleerd water grondig af nadat u de opname voor de dag hebt afgesloten. </li><li> Analyseer en plot de gegevens met behulp van commercieel verkrijgbare offline analyse software. </li></ol>

<ol><li>Lin, H. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+modulation+of+pheromone+detection+enhances+male+courtship+success%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success.</a> Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).</li>
<li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125 (1), 143-160 (2006).</li>
<li>Silbering, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+function+and+integrated+wiring+of+the+evolutionarily+distinct+Drosophila+olfactory+subsystems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems.</a> J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).</li>
<li>Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedicated+olfactory+neurons+mediating+attraction+behavior+to+ammonia+and+amines+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).</li>
<li>Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+class+of+olfactory+neurons+mediates+behavioural+responses+to+a+Drosophila+sex+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone.</a> Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).</li>
<li>Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors+and+neurons+for+fly+odors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Receptors and neurons for fly odors in Drosophila.</a> Curr Biol. 17, 606-612 (2007).</li>
<li>Schlief, M. L., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+processing+and+behavior+downstream+from+highly+selective+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).</li>
<li>Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Pheromone-sensitive+neurons+is+mediated+by+conformational+activation+of+pheromone-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein.</a> Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).</li>
<li>Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligands+for+pheromone-sensing+neurons+are+not+conformationally+activated+odorant+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins.</a> PLoS Biol. 11 (4), e1001546(2013).</li>
<li>Dweck, H. K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromones+mediating+copulation+and+attraction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+USA%22%5BJournal%5D)">Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila.</a> Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).</li>
<li>Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation+rates+and+vapor+pressures+of+the+even-numbered+C8-C18monocarboxylic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+A%22%5BJournal%5D)">Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids.</a> J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).</li>
<li>Kimura, K. -I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+back+or+front%3A+the+courtship+position+is+a+matter+of+smell+and+sight+in+Drosophila+melanogaster+males%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males.</a> J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).</li>
<li>Grosjean, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+receptor+for+food-derived+odours+promotes+male+courtship+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila.</a> Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li>
<li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+sensillum+recordings+in+the+insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een procedure waarbij de reacties van Or47b ORNs op palmitolezuur robuust kunnen worden geïnduceerd en opgenomen. Wij hebben een conventionele methode voor afgifte van lange afstand geur 2 , 7 , 10 aangepast om het probleem van onvoldoende feromoongeurstofafgifte te oplossen. We hebben de kwestie van vluchtige luikantilatiteit aangepakt door de verbinding via geurpatronen te leveren, waarvan de opening binne...

<html> Drosophila ORNs reageren op een groot aantal geurstoffen, met veel uiteenlopende koolstofketenslengten en een verscheidenheid aan functionele groepen, waaronder esters, alcoholen, ketonen, lactonen, aldehyden, terpenen, organische zuren, aminen, zwavelverbindingen, heterocyclische verbindingen en aromaten 2 , 3 . Geurstoffen die gevarieerd zijn in hun fysisch-chemische eigenschappen kunnen opmerkelijk verschillende volatiliteiten hebben, aangegeven door de dampdruk van de verbinding. Met name, biologisch relevante geurstoffen voor Drosophila melanogaster verschillen enorm in hun volatiliteit. Bijvoorbeeld reageren Ir92a ORN&#39;s op ammoniak 4 , die zeer vluchtig is, met een dampdruk van 6.432 mmHg bij 20 ° C. In tegenstelling hiermee reageren Or67d ORNs op een mannelijk feromoon, cis- va-acetaat ( c VA) 5 , 6 , waarvan de dampdruk 43 mmHg bij 20 ° C is. Ove_content &quot;&gt; Het bestuderen van het olfactorische reactie op geurstoffen met een lage vluchtigheid is bijzonder uitdagend met conventionele geurafleveringsmethoden, waarbij geurstoffen via een dragerluchtstroom over een relatief lange afstand ( dwz enkele centimeter) worden afgeleverd. Als zodanig zijn de gerapporteerde olfactieve reacties Naar een gegeven volatiliteit geurmiddel kan sterk variëren, afhankelijk van het ontwerp van het geurafgifte-systeem. Bijvoorbeeld, de gerapporteerde respons van Or67d ORN&#39;s tot een hoge dosis c VA varieert van ~ 40 7 -&gt; 200 spikes / s 6 . Bovendien is de ondoeltreffende levering van c VA met conventionele aflevermethoden waarschijnlijk toegeschreven aan valse negatieve resultaten, wat leidt tot de interpretatie die c VA op zichzelf niet volstaat om Or67d ORNs 8 te activeren. Deze interpretatie werd later uitgedaagd door een andere studie met behulp van een Luchtafgifte-methode 9. Het is dus imperaEen robuuste geurafleveringssysteem ontwikkelen voor de effectieve presentatie van geurstoffen met een lage vluchtigheid. Onlangs identificeerden we verscheidene lang-keten-cutulaire vetzuren als liganden voor Or47b ORN&#39;s. Ze zijn gehuisvest in het type 4 Antennale Trichoid Sensillum (at4). Onder de long-chain vetzuren geurstoffen, vonden we dat palmitolezuur functioneert als een afrodisiacale feromoon die mannelijke hofschap bevordert door Or47b ORNs 1 te activeren. In een andere studie die gebruik maakte van een gebruikelijke geurafleveringsmethode bleek methyllauraat echter reacties van Or47b ORNs op te wekken, terwijl palmitolezuur geen reactie opleverde bij dezelfde afstand 10 . Vergeleken met c VA zijn langzijdige vetzuren nog minder vluchtig, met dampdrukken minder dan 0.001 mmHg bij 25 ° C 11 . De inherente lage volatiliteit van long-chain vetzuur geurstoffen, waardoor de efficiënte presentatie van de antenne viaConventionele geurafleveringssystemen, die waarschijnlijk in aanmerking komen voor de valse negatieve resultaten 10 . Deze inconsistentie benadrukt de ontoereikendheid van conventionele geurafleveringssystemen bij het presenteren van laagvluchtige geurstoffen. Voorheen werd aangetoond dat de effectieve afgifte van vliegende kuticulaire geuren nauwe nabijheid vereist tussen de geurbron en het doelweefsel 6 . Om de effecten van biologisch actieve feromonen volledig te karakteriseren, terwijl ze de afstand waarna ze waarschijnlijk worden geconfronteerd met fruitvliegen in de natuur 12 , 13 , overeenstemmen, zijn we afgesproken dat minimale afstand in onze procedure een hoge prioriteit moet krijgen. Onze methode bevat nog meer voordelen, waaronder compatibiliteit met standaard elektrofysiologie riggen en technieken. Pre-existing rig setups vereisen minimale aanpassing om dit protocol te behalen, en de meeste SSR-stappen vereisen slechts kleine aanpassingen. DezeMaakt onze techniek gemakkelijk toegankelijk voor onderzoekers die in SSR ervaren zijn. Bovendien staat onze techniek voor de presentatie van low-volatility odorants met een scherpe aanvang en offset, correlerende stimuluslevering met neuronale respons. Tenslotte vergemakkelijkt de hardware-indeling snelle uitwisseling tussen geurpatronen, waardoor gegevens verzamelen worden over een gewenst doseringsbereik. We beginnen met het evalueren van de voorbereiding van referentie- en opnameelektroden, Volwassen Hemolymph-Like (AHL) -oplossing, Reukpatronen voor geurstoffen en de bijbehorende olfactometer. Vervolgens bespreken we de bereiding van de palmitolezuur-geuroplossingen, gevolgd door de voorbereiding van de vlieg voor opname. We gaan door naar de criteria voor het selecteren van een trichoid sensillum om de positionering van de geurcartridge te registreren en nauwkeuriger te onderzoeken alvorens de representatieve data die verkregen zijn met behulp van deze methode te presenteren. Tenslotte concluderen we nuttige toepassingen van deze techniekUe, sommige problemen, en hun oplossingen.

<table><tbody><tr><td>Prep Setup &amp; Diverse Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Puller Instrument&nbsp;</td><td>Sutter Instruments Novato CA USA</td><td>P97</td><td>Pipette Puller</td></tr><tr><td>Borosiliekaatglas Capillaire</td><td>World Precision Instruments Sarasota FL USA</td><td>1B100F-4</td><td>om holding rods te maken</td></tr><tr><td>Aluminosiliekaatglas Capillaire&nbsp;</td><td>Sutter Instruments Novato CA USA</td><td>AF100-64-10</td><td>om elektroden te maken</td></tr><tr><td>Superfrost Microscoopglazen</td><td>Fisher Scientific Pittsburgh PA USA</td><td>12-550-143</td><td>voor vlieg-prep station</td></tr><tr><td>Permanent Dubbelzijdige Tape</td><td>Scotch St. Paul MN USA</td><td>NA</td><td>voor vlieg-prep station</td></tr><tr><td>Staande microscoop</td><td>Olympus Shinjuku Tokyo Japan</td><td>BX51</td><td>voor opname rig</td></tr><tr><td>Plastalina modelklei</td><td>Van Aken North Charleston SC USA</td><td>B0019QZMQQ</td><td>voor prep station en om de holding rod te stabiliseren</td></tr><tr><td>Rapid-Flow steriele wegwerpfiltereenheid met SFCA-membraan, 0,45 mm</td><td>Nalgene Rochester NY USA</td><td>#156-4045</td><td>om AHL-oplossing te steriliseren</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Cartridge Materialen</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;L pipettetip&nbsp;</td><td>VWR Radnor PA USA</td><td>53508-810</td><td>om geurcartridges en vlieg-prep te maken</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Whatman Maidstone Kent UK</td><td>740-E</td><td>om geurcartridges te maken&nbsp;</td></tr><tr><td>Vacuum Droogkast&nbsp;</td><td>Cole-Parmer Vernon Hills IL USA</td><td>VX-06514-30</td><td>om ethanol op te lossen</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Geurmaterialen</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cis-palmitoleic zuur</td><td>Cayman Chemical Ann Arbor MI USA</td><td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td><td>Or47b geur</td></tr><tr><td>trans-palmitoleic zuur</td><td>Cayman Chemical Ann Arbor MI USA</td><td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td><td>Or47b geur</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Spectrum Chemical MFG.&nbsp; New Brunswick NJ USA</td><td>E1028-500MLGL</td><td>om palmitoleic zuur te verdunnen&nbsp;</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Rig Setup Materialen</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geurcartridge Micromanipulator</td><td>Siskiyou Grants Pass OR USA</td><td>MX130R</td><td>om de olfactometer te positioneren</td></tr><tr><td>Flow Vision software&nbsp;</td><td>Alicat Tuscon AZ USA</td><td>FLOWVISIONSC</td><td>software om de stroomsnelheid te regelen</td></tr><tr><td>Mass Controller</td><td>Alicat Tuscon AZ USA</td><td>MC-2SLPM-D</td><td>om de stroomsnelheid voor bevochtigde lucht te regelen</td></tr><tr><td>Mass Controller</td><td>Alicat Tuscon AZ USA</td><td>MC-500SCCM-D</td><td>om de stroomsnelheid voor geuropwekkende stimulatie te regelen</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>Data-acquisitiesoftware</td></tr><tr><td>Luchttoevoerbuis</td><td>Ace Glass Vineland NJ USA</td><td>8802-936&nbsp;</td><td>om bevochtigde lucht te leveren</td></tr><tr><td>50X objectieflens&nbsp;</td><td>Olympus Shinjuku Tokyo Japan</td><td>LMPLFL50X</td><td>opname rig</td></tr><tr><td>Clampfit 10</td><td>Molecular Devices Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>software voor spike-analyse&nbsp;</td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>WaveMetrics Lake Oswego OR USA</td><td>Ver. 6.37</td><td>software voor gegevensanalyse&nbsp;</td></tr><tr><td>Audio Monitor</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXB-AUDIS-08B</td><td>Rapporteert akoestisch individuele spikes</td></tr><tr><td>Extracellulaire Versterker</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXT-02F</td><td>om de amplitude van elektrische signalen te verhogen</td></tr><tr><td>Ventilatie Controller</td><td>Warner Instruments&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>VC-8</td><td>om de opening van de klep voor geuropwekkende stimulatie te regelen</td></tr><tr><td>Opname Elektrode Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments Novato CA USA</td><td>MP-285</td><td>om opname elektrode te positioneren</td></tr><tr><td>Headstage Versterker</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA</td><td>EQ-16.0008</td><td>om de amplitude van elektrische signalen te verhogen</td></tr><tr><td>Oscilloscoop</td><td>Tektronix Beaverton OR USA</td><td>TDS2000C</td><td>Visueel rapport van individuele spikes</td></tr></tbody></table>

elektrofysiologische opname van<em&gt; drosophila</em&gt; trichoid sensilla in reactie op geurstoffen met lage volatiliteit

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Insecten vertrouwen op hun reukzin om een ​​breed scala aan gedragingen te leiden die kritisch zijn voor hun overleving, zoals voedselzoekende, roofdier vermijding, ovipositie en paring. Veelvoudige chemische stoffen met wisselende volatiliteiten zijn geïdentificeerd als natuurlijke geurstoffen die insectenolfactor Receptor Neurons (ORN&#39;s) activeren. Het bestuderen van de geurfactorische reacties op luchtspuiten met een laag volatiliteit is echter belemmerd door een onvermogen om dergelijke stimuli effectief aan te bieden door gebruik te maken van conventionele reukafleveringsmethoden. Hier beschrijven we een procedure die de effectieve presentatie van geurstoffen met een lage vluchtigheid toelaat voor in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). Door de afstand tussen de geurbron en het doelweefsel te minimaliseren, kan deze methode de toepassing van biologisch opvallende maar tot nu toe ontoegankelijke geurstoffen, waaronder palmitoolzuur, een stimulerende feromoon met een aangetoond effect op ORN&#39;s die betrokken zijn bij het hof en het paren gedrag 1 .Onze procedure biedt dus een nieuwe weg om een ​​gastheer van lage-vluchtige geurstoffen te analyseren voor het bestuderen van insuline- en feromooncommunicatie.

Onze techniek werd succesvol toegepast om de relatieve werkzaamheid van de trans ( Figuur 5A ) versus cis ( Figuur 5B ) isomeren van palmitoolzuur te bepalen. De representatieve gegevens tonen aan dat trans -palmitoleic zuur een effectievere ligand voor Or47b ORNs vergeleken met het cis-isovorm (figuur 5C). Een enkele neuron werd geregistreerd van elke vlieg, met ...

Het algemene doel van dit protocol is om aan te tonen hoe geurstoffen met lage volatiliteit voor single-sensillum-opname van Drosophila- olfactorische receptorneuronen kunnen optreden die reageren op lang-keten-cutulaire feromonen.

Elektrofysiologische opname van<em&gt; Drosophila</em&gt; Trichoid Sensilla in reactie op geurstoffen met lage volatiliteit

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

Het algemene doel van deze techniek is om geuren met lage vluchtigheid effectief te presenteren aan olfactorische receptorneuronen en drosophila voor elektrofysiologisch opnemen. Die neuronen zijn gehuisvest in de trichoïde sensilla en reageren op lange keten cuticulaire feromonen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van insectenferomooncommunicatie te beantwoorden door een verbeterde geuroverdrachtstechniek te bieden.Het grote voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om geuren, die voorheen niet toegankelijk waren vanwege hun lage vluchtigheid, effectief te presenteren tijdens in vivo opname. Specifiek worden feromonen gepresenteerd vanuit korte afstanden die het bereik tussen courterende mannetjes en doelwittenvrouwtjes simuleren. De voorbereiding van de geuroverdrachtscartridge component voor AT4 opnamen begint met het verwijderen van 0,9 centimeter vanaf het smalle uiteinde van een 200-microliter pipettepunt.Vervolgens, verwijder vanaf een tweede pipettepunt 1,7 centimeter vanaf het smalle uiteinde, en 1,5 centimeter vanaf het brede uiteinde om een lengte van 1,8 centimeter te maken. Gebruik vervolgens een pincet om een schijfje filterpapier met een diameter van 1/8 inch op het puntje van de 1,8 centimeter sectie te plaatsen. Laat een kleine opening waardoor lucht kan passeren.Vervolgens zet u de pipettensecties samen met de kleinere sectie naar beneden gericht om op de voorbereiding te richten. Gebruik nu een P10 om de geur op de gewenste verdunning op het filterpapier aan te brengen. Laat vervolgens de geladen cartridges een uur in een vacuümdessiccator staan om het oplosmiddel te laten verdampen.Monteer eerst een voorbereidingsplaatje voor vliegen. Op een glazen plaatje bevestigt u een glazen deksel met modelklei, om een hoek van ongeveer drie graden tussen de plaat en het deksel te creëren. Bevestig vervolgens dubbelzijdig plakband op twee plaatsen, de binnenrand van het deksel en de plaat direct onder het deksel.Gebruik altijd nieuw plakband. Verzamel nu de gewenste vlieg in een aspiratorbuis. Pas vervolgens een 200-microliter pipettepunt over het uiteinde van de buis en tik tegelijkertijd met de buis terwijl u blaast, om de vlieg in het uiteinde van de pipettepunt te duwen.Gebruik vervolgens een scheermes om de punt net onder het lichaam van de vlieg af te snijden. Laad nu voorzichtig modelklei in de brede uiteinden van de punt om het hoofd van de vlieg in de kleinere opening te dwingen. Zodra beide antennes zichtbaar zijn, stopt u met het invullen van klei.Gebruik vervolgens een pincet om de voorbereiding op de plaat te plaatsen. Plaats de clipeus horizontaal met de laterale zijde van de antenne tegen het getapte dekseloppervlak. Plaats vervolgens de houderstang op de arista om de antenne aan het plakband te bevestigen.Plaats vervolgens de voorbereiding op het platform van de rig. Bevestig dat de trichoïden zichtbaar zijn langs de distale laterale rand van het derde segment van de antenne. De sensilla moeten duidelijk tegen de achtergrond worden afgetekend.Houd de voorbereiding onder een constante bevochtigde luchtstroom die via een aparte buis wordt geleverd op een afstand van ongeveer twee centimeter. Om opnames te maken, steekt u de referentie-elektrode met een snelle en soepele beweging in de clipeus. Plaats deze net onder de cuticula waar deze in contact zal komen met de hemolymf.Vervolgens laat u de opname-elektrode langzaam zakken tot deze in hetzelfde zichtveld komt als het doelwit sensillum. Steek vervolgens de opname-elektrode in de sensillaire basis. Zorg ervoor dat er een hoog signaal-ruisverhouding is, met identificeerbare spikes van AT4-A en AT4-C neuronen, voordat u verdergaat.De AT4-A neuronen mogen niet sneller dan 20 hertz vuren. Verbind nu de cartridge met de geuroverdrachtsbuis. Begin met de oplosmiddelcontrole en ga verder naar de hoogste geurconcentratie.In dit geval is een palmitoleïnezuur cartridge bevestigd. Gebruik vervolgens de micromanipulator om de cartridge naar de voorbereiding te manoeuvreren terwijl u deze op het hoofd richt. Plaats het puntje van de cartridge direct op de antenne vanaf een afstand van ongeveer vier millimeter.De cartridge moet ook ongeveer een millimeter boven de plaat zijn. Nauwkeurige positionering van de cartridge ten opzichte van de voorbereiding is de meest cruciale stap van deze procedure. Consistente neuronale reacties zijn afhankelijk van de reproduceerbare positie van de cartridge over proeven heen.De cartridge mag dicht bij de elektroden en de plaat liggen. Het zou idealiter minstens vier millimeter van elke elektrode moeten zijn. Voor stimulatie, stel de geurstroomregelaar in op 500 milliseconde bursts en gebruik een stroomsnelheid van 500 milliliter per minuut.Voor elke stimulus burst, neemt u de elektrische activiteit gedurende 10 seconden op. Trek na een geurtoepassing de cartridge voorzichtig terug voordat u deze vervangt door een cartridge met de volgende hoogste concentratie. Nadat u alle opnames voor de dag hebt gemaakt, spoelt u de opname-elektrode grondig af met gedistilleerd water.Met behulp van de beschreven methoden op zeven dagen oude mannelijke Berlijnse wild-type vliegen, werd de relatieve werkzaamheid van de trans en cis palmitoleïnezuur vergeleken. Trans-palmitoleïnezuur was een sterkere stimulans voor Or47b olfactorische receptorneuronen. Van elke vlieg werd slechts één neuron opgenomen.De afstand tussen de opening van de geurcartridge en het hoofd van de vlieg had een significante invloed op neuronale reacties. Op een afstand van vier millimeter werden er veel meer spikes afgevuurd als reactie op palmitoleïnezuur. Op een afstand van 11 millimeter waren er nauwelijks waarneembare reacties door de O47b neuronen.Presentatie van palmitoleïnezuur op korte afstand was belangrijk voor het bestuderen van de effecten ervan als geur. We hopen dat u na het bekijken van deze video een duidelijk begrip hebt van hoe u palmitoleïnezuur of andere geuren met lage vluchtigheid kunt presenteren aan uw drosophila olfactorische receptorneuronen tijdens in vivo opname van een enkele sensillum. Zodra deze techniek is beheerst, kan het opnemen van een

electrophysiological-recording-from-drosophila-trichoid-sensilla

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In deze video artikel beschrijven we een nieuwe methode waardoor de bouw van odorant hellingen met een stabiele en controleerbaar geometrieën. We in het kort laten zien hoe deze gradiënten gebruikt kunnen worden om te screenen op olfactorische defecten (volledige en gedeeltelijke anosmie) en meer subtiele kenmerken van chemotaxis gedrag te bestuderen.

Hoge-resolutie Meting van Geur-Driven gedrag in Drosophila Larven

Elektrofysiologische reacties van olfactorische sensorische neuronen aan geurstoffen kan worden gemeten bij insecten met behulp van enkele sensillum opnames. In deze video artikel zullen we laten zien hoe je een sensillum opnamen in de antennes van de azijn fly uit te voeren...

Single Sensillum Opnamen in de Insecten Drosophila melanogaster En Anopheles gambiae</em

Insect olfactorische systemen bieden unieke mogelijkheden voor het opnemen van geurstof-geïnduceerde responsen in de vorm van electroantennograms (EAG) en enkele sensillum opnames (SSR), die de antwoorden worden samengevat van alle geurstof receptor neuronen (ORNs) gelegen op de antenne en van die ondergebracht in afzonderlijke sensilla, respectievelijk.

Elektrofysiologische metingen van een Moth olfactorisch systeem

We beschrijven een gevestigde techniek om te meten en geur-opgeroepen calcium antwoorden te analyseren in de antennaal kwab van het...

Calcium Imaging van Geur-reacties van de consument in de Drosophila Antennaal Lobe

In this video, a live Drosophila fly is mounted in a tube for electrophysiological studies. Electrodes are positioned at the base of the sensillum to record specific neuronal responses to pheromones with the fly's olfactory receptor neurons.

Electrophysiological Recordings from Drosophila Sensilla in Response to Volatile Odorants

Dit protocol beschrijft extracellulaire van de actiepotentiaal reacties afgevuurd door labellar smaak neuronen in Drosophila.

Elektrofysiologische Opnemen vanaf<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Proef sensilla

De voorpoten en slurf van Drosophila bevatten een rijk repertoire van gustatoire sensorische neuronen. Hier presenteren we een methode met behulp van calciumbeeldvorming om fysiologische reacties van sensorische neuronen in de voorpoot en slurf van levende vliegen te meten na exogeen aanbrengen van een gustatoir feromoon.

Meten van fysiologische reacties<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensorische neuronen te Lipid Feromonen met Live Calcium Imaging

De automatische tracking systeem Flywalk wordt gebruikt voor hoge-resolutie kwantificering van geur-begeleide gedrag in Drosophila melanogaster.

Hoge-resolutie Kwantificering van Geur-begeleide Gedrag in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Met behulp van de<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

Dit witboek beschrijft een gedetailleerde en zeer effectieve protocol voor één sensillum opnamen van de sensilla basiconica op de ook voor insecten monddelen.

Enkele Sensillum opnames voor Locust Palp Sensilla Basiconica

Dit protocol beschrijft een methode om vast te leggen van de aflopende elektrische activiteit van het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster zodat de kosten-efficiënte en handige testen van farmacologische agenten, genetische mutaties van neurale eiwitten, en/of de rol van onontgonnen fysiologische trajecten.

Elektrofysiologische opname van de activiteit van het centrale zenuwstelsel van derde-Instar Drosophila Melanogaster

Een zelden gebruikte methode van elektrofysiologische registratie, basisregistratie, maakt analyse mogelijk van kenmerken van smaakcodering die niet kunnen worden onderzocht met conventionele registratiemethoden. Basisregistratie maakt ook de analyse mogelijk van smaakreacties op hydrofobe stimuli die niet kunnen worden bestudeerd met behulp van traditionele elektrofysiologische methoden.

Basisopname: een techniek voor het analyseren van reacties van smaakneuronen in Drosophila

Leer elektrofysiologische opname van Drosophila trichoïde sensilla bij lage-vluchtigheid geurstoffen. Deze methode maakt effectieve presentatie van feromonen mogelijk voor onderzoek naar insectencommunicatie.

Elektrofysiologische opname van

Meer video's verkennen