Fourier-Based diffractie analyse van levende Caenorhabditis elegans

Het algemene doel van deze fourier-gebaseerde diffractieanalyse is om de voortbeweging van C elegans in realtime te karakteriseren terwijl de soort zich vrij beweegt in een driedimensionale ruimte. Deze methode kan sleutelvragen in het veld van de neurobiologie beantwoorden door soortenreacties op verschillende dichtheden van oplossing of locomotorische mutanten te beschrijven. Deze methode dient als basislijn voor fourieranalyse van microscopische soorten.

Het heeft het voordeel dat elke microscopische soort zijn eigen unieke fourierspectrum zal hebben. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de voortbeweging van C elegans, kan het ook worden toegepast op andere micro-organismen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het vinden van de rondworm in de cuvet, onder de laserstraal, een uitdaging kan zijn.

We hadden eerst het idee voor deze methode in een poging om meer te weten te komen over het zwemgedrag vanuit het temporele diffractiesignaal, op zichzelf een rumoerig signaal. Om te beginnen, plaats een helium-neonlaser in de linker achterhoek van de optische werkbank en verbind deze met een stroombron. Plaats een neutrale dichtheidsfilter tussen de laser en de monsterlocatie, zodat de laserstraal door de filter reist voordat deze het monster bereikt.

Gebruik twee aluminium besturingsspiegels aan de voorzijde om een periscoop te bouwen door de eerste spiegel te bevestigen na de neutrale dichtheidsfilter. Bevestig vervolgens de tweede spiegel ongeveer 10 centimeter onder de eerste spiegel om ruimte te geven om de laserstraal te sturen. Plaats een cuvet tussen de spiegels en lijn de laserstraal en cuvet uit zodat de laserstraal verticaal door de cuvet reist.

Bevestig vervolgens de fotodiode direct tegenover de tweede spiegel zodat de sensor van de fotodiode naar de spiegel is gericht. Plaats vervolgens een met water gevulde cuvet op een standaard. Pas de hoogte van de standaard en de hoeken van spiegel een en twee aan zodat de laserstraal door de cuvet reist en gericht is in de buurt van, maar niet direct op de fotodiode.

Gebruik een hefboom om ervoor te zorgen dat de standaard een vlak oppervlak vormt voor de cuvet. Als de standaard niet vlak is, maak de juiste aanpassingen totdat deze is geleveld. Verbind tenslotte de fotodiode met de digitale oscilloscoop met behulp van de meegeleverde USB-kabel en verbind deze met de computer.

Laad de oscilloscoopsoftware en stel de sample rate in op minimaal acht hertz om de trilcyclus van de worm voldoende op te lossen. Gebruik een dunne, afgeplatte platinadraad om vier volwassen rondwormen over te brengen in een nieuwe NGM-agar gevulde petrischaal. Vervolgens, verwijder een wegwerpplastic cuvet uit de verpakking, zorg ervoor dat u de cuvet alleen aanraakt op de geribbelde zijden.

Gebruik vervolgens een micropipet om gedestilleerd water in een cuvet te pipetten tot de cuvet ongeveer 80% gevuld is met gedestilleerd water. Plaats de petrischaal met de C elegans onder een dissectiemicroscoop. Gebruik vervolgens de platina-pick om een volwassen C elegans uit de petrischaal te verwijderen en dompel de pick in de cuvet.

Beweeg de pick in cirkels om de rondworm los te maken als dat nodig is. Behandel de rondwormen voorzichtig en schud de cuvet niet. Schudden van de cuvet kan ervoor zorgen dat de wormen niet reageren.

Om te voorkomen dat er luchtbellen in de cuvet ontstaan, vul de cuvet met gedestilleerd water tot het lichtjes over de bovenkant van de cuvet uitkomt. Vul vervolgens de dop met water en doe de dop snel op de cuvet. Gebruik lenspapier om eventuele waterdruppels die op de cuvet kunnen zijn gemorst te verwijderen.

Gebruik bovendien lenspapier om eventuele kleine resterende druppels te verwijderen. Schakel de helium-neonlaser in en pas de frequentie-instelling aan zodat deze een rode straal produceert. Schakel vervolgens de sensor in.

Houd de cuvet aan de geribbelde zijden vast en kantelt deze voorzichtig tot de rondworm zich ongeveer in het midden van de cuvet bevindt. Plaats vervolgens de cuvet op de standaard in het optische systeem, waarbij de worm centraal staat binnen de laserstraal die van spiegel één naar spiegel twee reist. Plaats vervolgens de fotodiode in het diffractiepatroon zodat de locatie van de fotodiode en de centrale maximum van het diffractiepatroon niet samenvallen.

Roteer vervolgens de neutrale dichtheidsfilters zodat er een opmerkelijke spanningsuitvoer van de fotodiode is. Zorg ervoor dat u het licht beperkt met behulp van de neutrale dichtheidsfilter om te voorkomen dat de fotodiode verzadigd raakt. Een platte lijn duidt op oververzadiging of een gebrek aan intensiteit.

Zodra het bewegende diffractiepatroon zichtbaar is, verzamel gegevens met de fotodiode door op de startknop op de software te klikken, die de oscilloscoop bestuurt terwijl u de beweging van de worm in de gaten houdt. Blijf metingen doen totdat de worm uit de laserstraal beweegt en het diffractiepatroon verdwijnt. Als de cuvet is bekrast, gooi deze en de worm weg en begin opnieuw.

Na ongeveer 20 seconden, stop het gegevensverzamelingsproces door op de stopknop op de software voor de oscilloscoop te klikken. Sla de gegevens van elke proef op in komma-gescheiden waarden of tekstformaat. Verzamel minimaal 50 gegevenssets voor elk fenotype en gebruik acht tot tien dieren per proef.

Voorbeelden van gemodelleerde opeenvolgende wormbewegingen en bijbehorende diffractiepatronen worden hier getoond. De gemodelleerde diffractiepatronen lijken kwalitatief op experimentele patronen en geven aan dat de simulatie de rondworm met succes heeft gemodelleerd. Bovendien kan het temporele diffractie-signatuur van de roller en wild-type c elegans kwantitatief worden weergegeven.

Zoals hier te zien is, trilt elke rondworm met verschillende snelheden en amplitudes. De gemiddelde digitale fouriertransformaties maken het mogelijk om de rondworm te identificeren aan de hand van de amplitude van hun diffractiefrequentiespectrum. Het spectrum van de wilde type worm wordt gedomineerd door lagere frequenties dan het spectrum van de rollerbeweging.

Hier is een voorbeeld van de w-oscillatie die kan worden gezien als twee tegengestelde zeebewegingen