Name: Detectie van de Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonisatie in lymfkliertest Host door niet-invasieve In Vivo bioluminescentie systeem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Leer een niet-invasieve bioluminescentie-methode om EHEC-kolonisatie in muizen te detecteren met behulp van een in vivo imaging-systeem. Deze techniek maakt real-time monitoring van bacteriële aanwezigheid mogelijk zonder dieren te hoeven offeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen Chi-Chung Chen van het departement van medische Research, Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) voor de hulp in muis infectie, en de steun van het laboratorium dierlijke midden van nationale Cheng Kung Universiteit. Dit werk wordt ondersteund door de Minister van wetenschap en technologie (MOST) verleent (meest 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006--011, and106-2321-B-006-005) tot CC.

Let op: EHEC-O157:H7 is een bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) pathogen volgens de Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bioveiligheid instructie (https://www.cdc.gov/). Daarom moeten alle experimentele procedures waarbij EHEC worden uitgevoerd in een faciliteit BSL-2. Draag labjassen en handschoenen tijdens het uitvoeren van het experiment. Werken in een gecertificeerde bioveiligheid kabinet (BSC). Desinfecteer de experimentele Bank vóór en na de experimentele procedure met 70% ethanol. Alle instrumenten of apparatuur dat contact (of potentieel contact) EHEC moet worden ontsmet met 70% ethanol of bleekmiddel. Verontreinigde (of potentieel verontreinigde) afval moeten worden verzegeld en gesteriliseerde met autoclaaf zorgvuldig. Draag een masker, oogbescherming, dubbele handschoenen of een jumpsuit, indien nodig. De 6-week-oude C57BL/6 vrouwelijke muizen werden gekocht en onderhouden aan de Universiteit van het laboratorium dier Center van nationale Cheng Kung (NCKU). De dierproeven werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van NCKU (erkenningsnummer 104-039).
1. Bioluciferase-geëtiketteerden EHEC bacterie generatie
<ol><li>Mix-50 ng deoxyribonucleic acid (DNA), 1 μL van 10 μM vooruit en achteruit primers, 2 μL 2.5 mM deoxynucleotides (dNTPs), 2 μL 10 x buffer, 0.2 μL DNA-polymerase, en steriele tweemaal gedestilleerd water (ddH2van O) tot een eindvolume van 20 μL te versterken de anti-kanamycine cassette, nptII gen24. De DNA-sjabloon is van pBSL18024, die is gekocht van de nationale BioResource Project (NBRP). De PCR voorwaarden zijn vermeld in tabel 1 en de primer-reeks is beschikbaar in tabel 2.</li>
	<li>De PCR producten op een commerciële klonen vector na de kit afbinden protocol (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Het nptII gen fragment uit het klonen vector door NsiI en SmaI accijnzen en klonen in pBBR1MCS4, die wordt verteerd door de NsiI en ScaI van pAKlux2,9 tot het maken van de plasmide resistente kanamycine, pWF27813.</li>
	<li>Accijnzen het operon van de luxCDABE , van de uiting van de plasmide9, pAKlux2, door SpeI-HF en ScaI en kloon luciferase verteerd SpeI-HF en SmaI pWF278 voor het genereren van kanamycine resistente en luciferase plasmide, pWF27913te uiten. Opmerking: Voor de plasmide extracties en de zuivering van de verwijderde fragment, gebruikt de commerciële plasmide-extractie en de gel extractie kit, respectievelijk. Voor een enzym vertering, meng 100 ng DNA, 1 μL 10 x buffer, 1 μL van elke geselecteerde restrictie-enzym en steriele ddH2O tot een totaal volume van 10 μL, en Incubeer bij 37 ° C gedurende 2,5-3 uur.</li>
	<li>Het plasmide pWF279 omvormen door E. coli O157:H7 EDL933 bevoegde cellen door electroporation met 2.500 V voor 4 ms.</li>
	<li>Incubeer de cellen van de getransformeerde bacteriën in 1 mL Luria Bertani (LB) medium bij 37 ° C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Plaat van de bacteriën op een LB agarplaat aangevuld met 50 µg/mL kanamycine bij 37 ° C gedurende 16-18 h.</li>
	<li>Controleer de bioluminescente signaal van de plaat door een in vivo imaging machine de volgende dag. Kies een één kolonie van de plaat en cultuur het in 3 mL LB aangevuld met 50 µg Mo/mL kanamycine bij 37 ° C gedurende 16-18 h.</li>
	<li>Bereiden van bacteriële voorraad medium door verdunning van 100% glycerol in steriele ddH2O om de 30% glycerol oplossing te maken.</li>
	<li>Bevriezen de kanamycine resistente E. coli O157:H7 EDL933 bacteriën herbergen de plasmide luciferase als een bacteriële voorraad in een schroefdop cryovial als een 1:1 verhouding van bacteriën cultuur en 30% glycerol oplossing bij-80 ° C. De uiteindelijke concentratie van glycerol is 15%.</li>
</ol>2. bioluminescente EHEC bacterie voorbereiding, mondelinge inoculatie
Opmerking: Het stroomdiagram van de tijdlijn van de experimentele procedures voor EHEC voorbereiding en muis mondelinge maagsonde wordt gepresenteerd in Figuur 1 op steun in experimentele voorbereiding.
<ol><li>Streak E. coli O157:H7 EDL933 bacteriën herbergen luciferase plasmide op een bord van de agar LB met 50 µg Mo/mL kanamycine uit voorraad-80 ° C. Groeien de bacteriën voor 16-18 h bij 37 ° C.</li>
	<li>Kies een één kolonie uit de overnachting plaat en cultuur in 3 mL LB medium met 50 µg Mo/mL kanamycine voor 16-18 h in een incubator 37 ° C op 220 toeren per minuut.</li>
	<li>Subcultuur de bacteriën (1:100 verdunning) in kanamycine (50 µg/mL) met de pond-Bouillon gedurende 2,5-3 uur in een incubator 37 ° C bij 200 omwentelingen per minuut. (Bijvoorbeeld, voeg toe 2 mL's nachts gekweekte bacteriën medium van de 200 mL LB met kanamycine (50 µg/mL) aangevuld).</li>
	<li>Incubeer de bacteriën voor 2,5-3 h en meet de optische dichtheid waarde op 600 nm (OD600) tot de waarde is tussen 0,9 tot 1. De bacteriële cel nummer is op een dichtheid van ongeveer 108 kolonie vormende eenheden (kve) / mL.</li>
	<li>Centrifugeer het opnieuw gekweekte bacteriën bij 8.000 x g gedurende 30 min, 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant zonder schudden van de pellet van bacteriën en wassen van de pellet met 100 mL 0,9% steriele normale zout door zachte agitatie.</li>
	<li>Herhaal stap 2.5 en 2.6 eens.</li>
	<li>Na het wassen, centrifugeren van de bacteriecultuur bij 8.000 x g gedurende 30 min, 4 ° C en verwijder het supernatant zachtjes.</li>
	<li>Condensaat de pellet op 100-fold met de steriele normale zoutoplossing 0,9%. Bijvoorbeeld, als 200 mL bacteriën worden gecentrifugeerd, voeg 2 mL normale zout op te schorten de pellet.</li>
	<li>Bevestig de bacteriën CFU (het moet ongeveer 109 kve/100 μl na condensatie in normale zout) door de geconcentreerde bacteriën via een 10-fold seriële verdunning25plating.</li>
</ol>3. muis mondelinge maagsonde van EHEC
<ol><li>6 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen met streptomycine water (5 g/L) voor 24 uur per dag behandelen.</li>
	<li>Na 24u, overschakelen naar reguliere drinkwater voor een andere 24 h vóór maagsonde. Na behandeling met gewoon water gedurende 24 uur, zijn de muizen klaar voor de mondelinge maagsonde van EHEC.</li>
	<li>Vul de injectiespuit met 100 μl EHEC-bacteriën door terug te trekken op de plunjer. Ervoor zorgen geen luchtbellen in de spuit. Verwijder de bubbels door breuk van de spuit met de vingers.</li>
	<li>Til het dier voorzichtig en plaats deze op de bovenkant van de kooi met zorg.</li>
	<li>Pak de muis door de staart zorgvuldig, en het dier zal grip van de bovenkant van de kooi en probeert te gaan weg.</li>
	<li>Zachtjes beperken de muis door grijpen de losse huid van de nek en de achterkant van het dier met duim en wijsvinger om te verhinderen dat het hoofd van de muis verplaatsen.</li>
	<li>Houd de muis in een verticale positie invoegen van de maagsonde naald en zorgen dat het hoofd van de muis is geïmmobiliseerdet en verticale.</li>
	<li>Plaats de naald van de maagsonde in de mond van de muis na het dak van de mond en omlaag in de slokdarm en de richting van de maag.</li>
	<li>Als de ingevoegde naald de helft of tweederde lengte in de muis is, injecteren de 100 μl EHEC-bacteriën, die ongeveer 109 CFU cellen bevatten.</li>
</ol>4. visualisatie
<ol><li>Na de mondelinge maagsonde, detecteert de bioluminescente signalen op 1 en 2 dagen.</li>
	<li>Alvorens de bioluminescente signalen van dieren, anesthetize hen door ze te plaatsen in een kamer van 2,5% Isofluraan met 1,5 L/min zuurstof.</li>
	<li>2-5 min wachten totdat alle muizen onbewuste en stop verplaatsen geworden. Dieren zijn klaar voor in vivo detectie van bioluminescentie.</li>
	<li>Detecteren en beeld bioluminescente signalen van dieren door een in vivo imaging systeem. Raadpleeg hoofdstuk 5 "Data-acquisitie" voor de werking van de software. Tijdens de procedure staan alle dieren onder een voortdurende aanvoer van 2,5% Isofluraan met 1,5 L/min zuurstof.<ol>
<li>Klik op Bestand > live, en handmatig richten zich op de muis.</li>
		<li>Selecteer de blootstelling tijd en laser-intensiteit.</li>
		<li>Klik op verwerven > vastleggen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor ex vivo imaging, euthanaseren van de muizen door cervicale dislocatie en verwijder de hele darm van geïnfecteerde muizen. Breng de darmen in een 9-cm petrischaal en beeld door de in vivo imaging systeem. De instelling is hetzelfde als de in vivo imaging behalve het gezichtsveld is ingesteld als A/B. Zie hoofdstuk 5 "Data-acquisitie" voor details. Opmerking: Methode voor cervicale dislocatie: bedwingen van de muizen op de bovenkant van kooi door de staart met één hand te grijpen zodat de dieren greep de kooi. Plaats een viltstift of de duim en de eerste vinger van de andere hand tegen de achterkant van de nek op de onderkant van de schedel. Snel vooruit met de hand of object terwijl de beteugeling van het hoofd en trek achteruit met de hand met de staart. Selectievakje nauw te bevestigen respiratoire arrestatie en geen hartslag.</li>
</ol>5. data-acquisitie
Opmerking: De software die wordt gebruikt voor data-acquisitie wordt vermeld in de Tabel van materialen.
<ol><li>Voor Beeldacquisitie, opent u het Configuratiescherm van de overname van de software (Figuur 2).</li>
	<li>Selecteer "Verlichte", "fotograferen", en "Overlay".</li>
	<li>Stelt u blootstellingstijd als "Auto." Stel weggooien als "Medium."</li>
	<li>Ƒ/stop als 1 set voor verlichte en 8 voor foto. Ƒ/stop-controles in de hoeveelheid licht die door de CCD-detector wordt ontvangen.</li>
	<li>Instellen van het gezichtsveld die is gebaseerd op het veld van beelden die voor het verwerven van belang zijn. Optie "D" kan passen vijf 6-week-oude muizen en beeld ze allemaal op een moment. "C" beeld kunt drie 6-week-oude muizen in één veld.</li>
	<li>Zodra de muizen/monsters klaar voor imaging bent, klikt u op "Verwerven" voor Beeldacquisitie.</li>
	<li>Open de afbeeldingsgegevens die werd overgenomen.</li>
	<li>Open het deelvenster Tool palet (Figuur 3).</li>
	<li>Selecteer ROI extra. Het is raadzaam de cirkel (de meest linkse knop) aan het bereik van de bioluminescente gebied op beelden (Figuur 4).</li>
	<li>Klik op "Maatregel ROIs" (pictogram met potlood) voor het meten van de oppervlakte bioluminescente intensiteit (Figuur 3). Het deelvenster ROI metingen en de kwantificering waarden weergegeven (Figuur 5).</li>
	<li>Gebruik de meting configureren op de linker hoek van het deelvenster ROI metingen om te selecteren waarden/informatie die nodig is (Figuur 6), anders klik op "Export" om deze gegevenstabel exporteren en opslaan als CSV-bestand (Figuur 5).</li>
	<li>De waarden van de kolom "Totale Flux (p/s)" gebruiken als de kwantificering van de bioluminescente intensiteit in het CSV-bestand.</li>
</ol>

<ol><li>Pennington, H. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(10)60963-4/abstract">Escherichia coli O157.</a> Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).</li>
<li>Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga+toxins+and+the+pathophysiology+of+hemolytic+uremic+syndrome+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals.</a> Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).</li>
<li>Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga-toxin-producing+Escherichia+coli+and+haemolytic+uraemic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome.</a> Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).</li>
<li>Obrig, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+Shiga+Toxin+Mechanisms+of+Action+in+Renal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease.</a> Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).</li>
<li>Nguyen, Y., Sperandio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohemorrhagic+E.+coli+%28EHEC%29+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis.</a> Front Cell Infect Microbiol. 2, 90(2012).</li>
<li>Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+monitoring+of+in+vivo+colonization+and+clearance+dynamics+by+light-emitting+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria.</a> Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).</li>
<li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).</li>
<li>Rhee, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+spatial+and+temporal+colonization+of+enteropathogenic+E.+coli+and+enterohemorrhagic+E.+coli+in+mice+using+bioluminescent+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging.</a> Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).</li>
<li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).</li>
<li>Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+flagella+is+coincident+with+uropathogenic+Escherichia+coli+ascension+to+the+upper+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).</li>
<li>Roxas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohemorrhagic+E.+coli+alters+murine+intestinal+epithelial+tight+junction+protein+expression+and+barrier+function+in+a+Shiga+toxin+independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner.</a> Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).</li>
<li>Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSiragusa%2C+GR+%22Real-Time+Monitoring+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+Adherence+to+Beef+Carcass+Surface+Tissues+with+a+Bioluminescent+Reporter%22">Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter</a>. , (1999).</li>
<li>Kuo, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+Core+LPS+Biosynthesis+Enzyme+RfaD+Confers+Hypersusceptibility+to+Host+Intestinal+Innate+Immunity+In+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo.</a> Front Cell Infect Microbiol. 6, 82(2016).</li>
<li>Wiles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+specificity%2C+colonization+and+clearance+dynamics+in+vivo+following+oral+challenges+with+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).</li>
<li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).</li>
<li>Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).</li>
<li>Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+replication+of+Listeria+monocytogenes+in+the+murine+gall+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder.</a> Science. 303 (5659), 851-853 (2004).</li>
<li>Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+Yersinia+enterocolitica+in+Murine+and+Bovine+Feces+on+the+Basis+of+the+Chromosomally+Integrated+luxAB+Marker+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene.</a> Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).</li>
<li>Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Yersinia+enterocolitica+invasin+expression+in+vitro+and+in+vivo+using+a+novel+luxCDABE+reporter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system.</a> Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).</li>
<li>Morin, C. E., Kaper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+stabilized+luciferase-expressing+plasmids+to+examine+in+vivo-induced+promoters+in+the+Vibrio+cholerae+vaccine+strain+CVD+103-HgR%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).</li>
<li>Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+model+systems+for+studying+enteropathogenic+Escherichia+coli+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977(2013).</li>
<li>Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection.</a> Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013(2014).</li>
<li>Chou, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157%3AH7+Shiga-like+toxin+1+is+required+for+full+pathogenicity+and+activation+of+the+p38+mitogen-activated+protein+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).</li>
<li>Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7628717">Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria.</a> Gene. 160 (1), 59-62 (1995).</li>
<li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+%28MIC%29+of+antimicrobial+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).</li>
<li>Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Long-Wavelength+Optical+and+NIR+Imaging+Materials%3A+Contrast+Agents%2C+Fluorophores+and+Multifunctional+Nano+Carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Mater%22%5BJournal%5D)">Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers.</a> Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).</li>
<li>Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+green+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Improved green fluorescence.</a> Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).</li>
<li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).</li>
<li>Frangioni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).</li>
<li>Collins, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrobacter+rodentium%3A+infection%2C+inflammation+and+the+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).</li>
<li>Mallick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+murine+infection+model+for+Shiga+toxin-producing+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli.</a> J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).</li>
<li>Petty, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Citrobacter+rodentium+genome+sequence+reveals+convergent+evolution+with+human+pathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).</li>
<li>Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M. II, Peterson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+new+derivatives+of+the+broad-host-range+cloning+vector+pBBR1MCS%2C+carrying+different+antibiotic-resistance+cassettes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.</a> Gene. 166 (1), 175-176 (1995).</li>
<li>Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Plasmid+Maintenance+in+the+Attenuated+Live+Vector+Vaccine+Strain+Salmonella+typhiCVD+908-htrA%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA.</a> Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).</li>
<li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).</li>
<li>Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+%28EHEC%29+infection+and+hemolytic+uremic+syndrome+%28HUS%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS).</a> BMC Med. 10, (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er werd gemeld dat EHEC getransformeerd met luciferase plasmide is gebruikt om te onderzoeken van de lokalisatie in de hosts of gen expressie in vivo8,11,12. De lymfkliertest model hier gedemonstreerd heeft ook gemeld om te ontdekken de EHEC gekoloniseerd timing en localisatie in lymfkliertest host8. Niettemin, wij bieden het detail protocol van hoe EHEC inoculatie met muizen intragastrically beh...

EHEC-O157:H7 is een ziekteverwekker die diarree1HS2, HUS3, en zelfs acuut nierfalen4 via besmet water of voedsel veroorzaakt. EHEC is een pathogene enterobacterium en koloniseert aan het maag-darmkanaal van de mens1. Wanneer EHEC eerst voldoen aan host intestinaal epitheel, injecteren ze de kolonisatie factoren gastheer cellen via het type III secretie systeem (T3SS), die fungeert als een moleculaire spuit inducerende een koppelen en uitwissen (A/E) laesie om vervolgens af te dwingen hechting (kolonisatie)5. Deze genen die betrokken zijn bij de vorming van de A/E laesie worden gecodeerd door de locus van enterocyte geweest (LEE) pathogeniteit eiland5.
Bioluminescentie is een licht-producerende chemische reactie, in welke luciferase katalyseert de luciferine substraat voor het genereren van zichtbaar licht6. Deze enzymatische proces vereist vaak de aanwezigheid van zuurstof of adenosinetrifosfaat (ATP)6. Bioluminescentie imaging (BLI) kan onderzoekers de visualisatie en de kwantisatie van gastheer-pathogeen interacties in levende dieren7. BLI kan het karakteriseren van de cyclus van de bacteriële infectie in levende dieren door de bioluminescente bacterie te volgen als ze naar migreren en het binnenvallen van de verschillende weefsels en7; Dit blijkt een dynamische progressie van de infectie. Bovendien, de bacteriële belasting bij dieren is gerelateerd aan de bioluminescente signaal8; Dus, het is een handige indicator om te schatten van de pathologische condities van proefdieren in een eenvoudige en directe manier.
Het plasmide gebruikt hier bevatte het luciferase operon, luxCDABE, die is van de bacterie Photorhabdus luminescens dat eigen luciferase substraat7,9 codeert. Door het omzetten van deze plasmide luciferase-uitdrukken in bacteriën, kunnen de kolonisatie en infectie processen worden gecontroleerd door het observeren van deze bioluminescente bacterie in levende dieren. Globaal, BLI en bioluminescentie-geëtiketteerden bacteriën kunnen onderzoekers om te controleren de bacteriële getallen en de locatie, de bacteriële levensvatbaarheid met antibiotica/therapie behandeling en bacteriële genexpressie in infectie/kolonisatie6, 7. talrijke pathogene bacteriën hebben gemeld dat het luxCDABE -operon te onderzoeken hun infectie cyclus en/of gen expressie in infectie express. Deze bacteriën, inclusief uropathogenic E. coli10, EHEC8,11,12,13, enteropathogenic E. coli (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, en Vibrio cholerae20, zijn gedocumenteerd.
Verschillende experimentele modellen zijn ontwikkeld ter vergemakkelijking van de studie van EHEC kolonisatie in vitro en in vivo21,22,23. Er is echter een gebrek aan geschikte dierlijke modellen om te studeren de EHEC kolonisatie in vivo, en dus een daaruit voortvloeiende gebrek aan details. Ter vergemakkelijking van de studie van de EHEC kolonisatie mechanisme in vivo, is het waardevol om te bouwen van diermodellen om te observeren en te kwantificeren EHEC kolonisatie in levende dieren in een niet-invasieve methode.
Dit manuscript beschrijft een muis-EHEC kolonisatie model dat een bioluminescente waarin systeem gebruikt om te controleren EHEC kolonisatie na verloop van tijd in levende hosts. Muizen zijn intragastrically geënt met EHEC bioluminescentie-label en de bioluminescente signaal is gevonden in muizen met een niet-invasieve in vivo imaging systeem13. Muizen geïnfecteerd met bioluminescentie-geëtiketteerden EHEC toonde significante bioluminescente signalen in hun darm na 2 dagen boeken van infectie, die suggereerde dat deze bacteriën in de darm host gekoloniseerd, na 2 dagen boeken van infectie. Ex vivo afbeeldingsgegevens toonde aan dat deze kolonisatie specifiek in de blindedarm en dikke darm van muizen. Met behulp van deze muis-EHEC-model, kan de bioluminescente EHEC-kolonisatie in de levende gastheer worden gedetecteerd door een in vivo imaging systeem, om te bestuderen van de precieze werking van de darmen bacteriën kolonisatie, die verder inzicht in kan bevorderen EHEC-geïnduceerde fysiologische en pathologische veranderingen.

<table><tbody><tr><td>Shaker incubator</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>bacteria incubatie</td></tr><tr><td>Orbital shaking incubator</td><td>FIRSTEK</td><td>S300</td><td>bacteria incubatie</td></tr><tr><td>pBSL180</td><td></td><td></td><td>bron van nptII-gen</td></tr><tr><td>pAKlux2</td><td></td><td></td><td>bron van luxCDABE operon</td></tr><tr><td>T&amp;A Cloning Kit</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYC001-20P</td><td>gebruik voor TA-klonen</td></tr><tr><td>Nsi I</td><td>NEB</td><td>R0127S</td><td>gebruik voor plasmide klonering</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>NEB</td><td>R0122S</td><td>gebruik voor plasmide klonering</td></tr><tr><td>Spe I-HF</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td>gebruik voor plasmide klonering</td></tr><tr><td>Sma I</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td>gebruik voor plasmide klonering</td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td>gebruik voor plasmide klonering</td></tr><tr><td>Ex Taq</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>gebruik voor PCR-amplificatie</td></tr><tr><td>10X Ex Taq Buffer</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>gebruik voor PCR-amplificatie</td></tr><tr><td>dNTP Mixture</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>gebruik voor PCR-amplificatie</td></tr><tr><td>PCR-machine</td><td>applied Biosystem</td><td>2720 thermal cycler</td><td>voor PCR-amplificatie</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>SIGMA</td><td>G5516-1L</td><td>gebruik voor bacteriën stockoplossing</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434-5KG-R</td><td>chemische stof voor het maken van LB-medium, 10 g/L</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1612.00</td><td>chemische stof voor het maken van LB-medium, 10 g/L</td></tr><tr><td>Gistextractpoeder</td><td>Affymetrix</td><td>23547-1 KG</td><td>chemische stof voor het maken van LB-medium, 5 g/L</td></tr><tr><td>Agar</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1802.00</td><td>chemische stof voor het maken van LB-agar</td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Sigma</td><td>K4000-5G</td><td>antibiotica, gebruik voor selectie</td></tr><tr><td>streptomycine</td><td>Sigma</td><td>S6501-100G</td><td>antibiotica, elimineert de microbiota in muizen</td></tr><tr><td>EDL933 competente cel</td><td>Homemade</td><td></td><td>methode is op supplementair document</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>MicroPulser</td><td></td><td>voor elektroporatie</td></tr><tr><td>Elektroporatiecuvettes</td><td>Gene Pulser/MicroPulser</td><td>1652086</td><td>voor elektroporatie</td></tr><tr><td>Hogesnelheidscentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti, J-26S XP</td><td>gebruik voor het centrifugeren van bacteriën</td></tr><tr><td>Vaste hoekrotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA25.5</td><td>gebruik voor het centrifugeren van bacteriën</td></tr><tr><td>Vaste hoekrotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JLA10.5</td><td>gebruik voor het centrifugeren van bacteriën</td></tr><tr><td>centrifugeflessen</td><td>Beckman Coulter</td><td>REF357003</td><td>gebruik voor het centrifugeren van bacteriën</td></tr><tr><td>centrifugeflessen</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>3141-0500</td><td>gebruik voor het centrifugeren van bacteriën</td></tr><tr><td>eppendorf biophotometer plus</td><td>eppendorf</td><td>AG 22331 hamburg</td><td>voor het meten van de OD600-waarde van bacteriën</td></tr><tr><td>C57BL/6 muizen</td><td>Laboratory Animal Center of NCKU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>labjas, handschoenen</td><td></td><td></td><td>voor bescherming van personeel</td></tr><tr><td>isofluraan</td><td>Panion &amp; BF Biotech Inc.</td><td>G-8669</td><td>voor anesthesie bij muizen, farmaceutische kwaliteit</td></tr><tr><td>1ml-spruit</td><td></td><td></td><td>gebruik voor orale intubatie van muizen</td></tr><tr><td>Herbruikbare 22 G balpuntvoedingsnaald</td><td></td><td>&phi;0.9 mm X L 50 mm</td><td>gebruik voor orale intubatie van muizen</td></tr><tr><td>Chirurgische</td><td></td><td></td><td>gebruik voor muizenexperiment</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200 beeldvormingssysteem</td><td>Perkin Elmer</td><td>IVIS spectrum</td><td>gebruik voor bioluminescente beeldacquisitie</td></tr><tr><td>Living Image Software</td><td>Perkin Elmer</td><td>versie 4.1</td><td>gebruik voor het kwantificeren van de beeldgegevens</td></tr></tbody></table>

detectie van de enterohemorrhagic escherichia coli kolonisatie in lymfkliertest host door niet-invasieve in vivo bioluminescentie systeem

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, die is een foodborne ziekteverwekker die causesdiarrhea, hemorragische colitis (HS), en hemolytische uremisch syndroom (HUS), koloniseren aan het darmkanaal van de mens. Om te studeren het gedetailleerde mechanisme van EHEC kolonisatie in vivo is het essentieel dat dierlijke modellen te controleren en te kwantificeren EHEC kolonisatie. Wij tonen hier een muis-EHEC kolonisatie model door de bioluminescente waarin plasmide naar EHEC kwantificeren EHEC kolonisatie in levende hosts te controleren om te zetten. Dieren geënt met bioluminescentie-geëtiketteerden EHEC Toon intens bioluminescente signalen in muizen door detectie met een niet-invasieve in vivo imaging systeem. Na 1 tot 2 dagen boeken van infectie, kunnen bioluminescente signalen nog worden gedetecteerd in besmette dieren, die suggereert dat de EHEC koloniseren in hosts gedurende ten minste 2 dagen. We laten ook zien dat deze bioluminescente EHEC vinden aan muis darm, specifiek in de blindedarm en dikke darm, van ex vivo afbeeldingen. Deze muis-EHEC kolonisatie model kan dienen als een instrument om de huidige kennis van de EHEC kolonisatie mechanisme vooruit te gaan.

We toegediend bioluminescentie-geëtiketteerden EHEC (~ 109 bacteriële cellen) met 6 - weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen mondelinge maagsonde. Na mondelinge inoculatie van EHEC aan muizen binnen 1 uur, werden de dieren onderzocht voor bioluminescente signaal door de in vivo imaging systeem zoals weergegeven in Figuur 7. De resultaten toonden een sterke bioluminescente signaal in maagsonde muizen met EHEC bioluminescentie-label. We hebbe...

Een gedetailleerd protocol voor een muismodel voor enterohemorrhagic E. coli (EHEC) kolonisatie met behulp van bacteriën bioluminescentie-label wordt gepresenteerd. Het opsporen van deze bioluminescente bacterie door een niet-invasieve in vivo imaging systeem in levende dieren kan verder ons huidige begrip van EHEC kolonisatie.

Detectie van de Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonisatie in lymfkliertest Host door niet-invasieve In Vivo bioluminescentie systeem

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Het algemene doel van dit experiment is het detecteren van kolonisatie door enterohemorragische E.coli bij muizen met behulp van een niet-invasief in vivo beeldsysteem. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de pathogeniteit van enterohemorragische E.coli, zoals kolonisatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat EHEC-kolonisatie in levende dieren kan worden gedetecteerd zonder dat de dieren hoeven te worden opgeofferd.Begin met het uitplaten van een negatieve voorraad bij -80 °C van E.coli O157:H7 EDL933-bacteriën die een luciferase-plasmide bevatten op een LB-agarplaat met 50 µg/mL kanamycine. Laat de bacteriën 16 tot 18 uur groeien bij 37 °C. Selecteer een enkele kolonie van de overnight-plaat en inoculeer drie milliliter LB-medium met 50 µg/mL kanamycine.Incubeer de cultuur vervolgens bij 37 °C en 220 rpm gedurende 16 tot 18 uur. Bereid de volgende dag twee ml van een 1:100 verdunning van de overnightcultuur en inoculeer deze in 200 ml LB met kanamycin. Incubeer de cultuur bij 37 °C en 200 rpm gedurende 2,5 tot 3 uur, of totdat de optische dichtheid bij 600 nm een waarde tussen 0,9 en 1 bereikt.Centrifuge vervolgens de hergekweekte bacteriën bij 8000 ×g en 4 °C gedurende 30 minuten. Verwijder het supernatant zonder het pellet te verstoren en was de bacteriën door middel van voorzichtig schudden met 100 milliliters 0,9% steriele normale zoutoplossing. Centrifugeer na het wassen de bacteriecultuur opnieuw en verwijder voorzichtig het supernatant.Gebruik vervolgens 0,9% steriele normale zoutoplossing om het pellet 100 keer te concentreren. Nadat de muizen 24 uur lang met streptomycine-water zijn behandeld volgens het tekstprotocol, vult u een spuit met 100 µL EHEC-bacteriën. Til het dier voorzichtig op en plaats het met zorg bovenop de kooi.Pak vervolgens de muis voorzichtig bij de staart vast, zodat het dier zich aan de bovenkant van de kooi vastklampt en probeert te ontsnappen. Fixeer de muis voorzichtig door met de duim en wijsvinger de losse huid van de nek en rug van het dier vast te pakken om te voorkomen dat de kop beweegt. Houd de muis vervolgens in een verticale positie en zorg ervoor dat de kop van de muis in deze positie is geïmmobiliseerd.Voer de gavage-naald in de mond van het dier in, volg het gehemelte en beweeg naar beneden in de slokdarm richting de maag. Wanneer de ingebrachte naald voor de helft of voor twee derde in de muis zit, injecteer dan de 100 µL EHEC-bacteriën die ongeveer 10⁹ CFU aan cellen bevatten. Nadat de bioluminescente cellen volgens het tekstprotocol zijn gevisualiseerd, opent u het Acquisition Control Panel van de software.Selecteer luminescent, fotografeer en overlay. Stel de belichtingstijd in op auto. Stel vervolgens de binning in op medium.Stel het diafragmagetal (F-stop) in op één voor luminescentie en op acht voor fotografie. Het diafragmagetal regelt de hoeveelheid licht die door de CCD-detector wordt ontvangen. Zodra de muizenmonsters klaar zijn voor beeldvorming, klikt u op 'acquire' voor beeldacquisitie.Open de verkregen beeldata en open vervolgens het palet met hulpmiddelen. Selecteer ROI-instrumenten, zoals de cirkel, om het bioluminescente gebied op de beelden af te bakenen. Klik vervolgens, met behulp van het potloodpictogram, op 'measure ROI's' om de bioluminescentie-intensiteit van het oppervlak te meten.Het paneel voor ROI-metingen en de kwantificatiewaarden verschijnen. Gebruik vervolgens, in de linkerbovenhoek van het paneel voor ROI-metingen, 'configure measurement' om de benodigde waarden/informatie te selecteren. Klik anders op Export om deze datatabel te exporteren en als csv-bestand op te slaan.Gebruik tot slot de waarden uit de kolom 'total flux p/s' als de kwantificering van de bioluminescentie-intensiteit in het csv-bestand. Zoals in deze afbeelding wordt aangetoond, was een sterk bioluminescentiesignaal zichtbaar bij muizen die via orale gavage waren geïnoculeerd met bioluminescentie-gelabelde EHEC. In deze figuur vertoonden muizen die waren geïnoculeerd met bioluminescentie-gelabelde wild-type EHEC EDL933 intense bioluminescentiesignalen, zelfs twee dagen na infectie, wat suggereert dat EHEC de gastheren binnen twee dagen koloniseerde.Muizen die echter waren geïnfecteerd met een gemuteerde E.coli met defecten in de lipopolysachariden vertoonden geen bioluminescentie, wat suggereert dat er een gereduceerd aantal bacteriën of helemaal geen bacteriën deze muizen koloniseerden. Om de bioluminescentie-gelabelde bacteriën te lokaliseren, werden de darmen van de geofferde dieren ex vivo afgebeeld. De organen van muizen die waren geïnfecteerd met bioluminescentie-gelabelde EHEC vertoonden een significant bioluminescentiesignaal in het caecum en het colon, wat duidt op kolonisatie in deze organen.Daarentegen vertoonden muizen die waren geïnfecteerd met een LPS-mutant een verminderde bioluminescentie in het darmweefsel, wat consistent is met het in vivo-beeld. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe het experiment met het IV-systeem kan worden uitgevoerd om de EHEC-kolonisatie in muizen te monitoren.

detection-enterohemorrhagic-escherichia-coli-colonization-murine-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Methoden voor bioluminescentie beeldvorming van bacteriële infecties bij levende dieren beschreven. Ziekteverwekkers worden aangepast om luciferase te drukken waardoor optisch het gehele lichaam van infecties in levende dieren. Diermodellen kunnen besmet zijn met luciferase uitdrukken pathogenen en de daaruit voortvloeiende beloop van de ziekte gevisualiseerd in real-time door bioluminescentie imaging.

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

Bioluminescent Bacteriële Imaging<em&gt; In Vivo</em

Source: Valentine, M. E., et al. Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the use of bioluminescence to visualize and compare the in vivo behavior of virulent and attenuated bacterial strains in mice. It outlines the preparation of bioluminescent bacterial suspensions and their intraperitoneal injection into mice. The virulent strain exhibits...

Tracking Bacterial Infection Dynamics in a Mouse Using Bioluminescence

Source: Kuo, C., et al. Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the preparation of a luciferase-expressing enterohemorrhagic Escherichia coli suspension from frozen stock for use as an oral inoculum in animal models. This enables real-time, bioluminescent tracking of intestinal colonization during in vivo infection studies.

Preparation of Bioluminescent Enterohemorrhagic Escherichia coli Inoculum

Source: de Vries, C. R., et al., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates a bioluminescent imaging technique to monitor bacterial infection progression in a live mouse model. Pathogenic bacteria engineered with the luxABCDE reporter system emit light at the infection site, allowing visualization of metabolically active bacteria. By imaging the mouse over time, researchers can non-invasively track infection...

Bioluminescence Imaging of Bacterial Infections in Mice

Source: Seman, B. G., et al. A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis. J. Vis. Exp. (2020)The video demonstrates a neonatal mouse model for studying systemic infection using encapsulated bioluminescent bacteria. Neonatal pups are injected with high- or low-dose bacterial suspensions and returned to their mother for postnatal care. The encapsulated bacteria evade early immune detection, spread systemically, and are visualized over time using luminescence imaging. This model...

Modeling Infection in Neonatal Mice Using Encapsulated Bioluminescent Bacteria

Source: Valentine, M. E., et al., Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the use of a bioluminescence-based imaging approach to monitor bacterial infection in a live mouse model. Sequential bioluminescent and X-ray imaging enables real-time visualization and anatomical localization of infection spread throughout the host.

Real-Time Imaging of Bacterial Infection in a Mouse Model Using Bioluminescence

Source: Luyts, N., et al. Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the induction and tracking of urinary tract infection in a mouse model using bioluminescent E. coli injected into the bladder, where bacterial adhesion, invasion, and intracellular replication occur. The emitted light from the bioluminescent operon serves as a real-time marker of bacterial load during infection...

Visualization of Urinary Tract Infection in a Mouse Model Using Bioluminescence

Multi-modaliteit beeldvorming is een waardevolle benadering voor het bestuderen van bacteriële kolonisatie in kleine proefdiermodellen. Dit protocol beschrijft infectie van muizen met...

4D multimodale beeldvorming van<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecties in Muizen

Dit manuscript beschrijft de intravesicale toediening van uropathogene bacteriën met een lux operon om een urineweginfectie bij muizen te induceren en de daaropvolgende longitudinale in vivo analyse van de bacteriële belasting met behulp van bioluminescentie beeldvorming.

Longitudinale follow-up van urineweginfecties en hun behandeling bij muizen met behulp van bioluminescentiebeeldvorming

Vroeggeboorte (bevalling &lt; 37 weken) is een urgent wereldwijd gezondheidsprobleem met suboptimale preventie- en behandelingsopties. We presenteren een muismodel van oplopende vaginale bacteriële infectie-geïnduceerde vroeggeboorte en schetsen hoe de resulterende neonatale morbiditeit en mortaliteit kunnen worden geanalyseerd.

Modellering van oplopende vaginale infectie, vroeggeboorte en neonatale morbiditeit bij muizen

Leer een niet-invasieve bioluminescentie-methode om EHEC-kolonisatie in muizen te detecteren met behulp van een in vivo imaging-systeem. Deze techniek maakt real-time monitoring van bacteriële aanwezigheid mogelijk zonder dieren te hoeven offeren.

Detectie van de Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonisatie in lymfkliertest Host door niet-invasieve In Vivo bioluminescentie systeem (Video) | JoVE Journal

Detectie van de Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonisatie in lymfkliertest Host door niet-invasieve In Vivo bioluminescentie systeem

Meer video's verkennen