Name: Afleiding van stamcellijnen uit muis voor inplanting embryo s (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Leer een efficiënt protocol voor het afleiden van muizenembryonale stamcellijnen met hoge opbrengst. Deze methode gebruikt standaardculturen met humane voorhuidfibroblasten als voedercellen voor regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Jonatan Lucas voor zijn technische bijstand met feeder celcultuur, à Estabulari de la UAB voor verzorging van de dieren en Domènec Martín voor het vastleggen van de video. Dit werk werd ondersteund door Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R en de Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC is een begunstigde van een PIF-UAB fellowship.

het gebruik van de dieren die zijn beschreven in de onderstaande secties is goedgekeurd door de ethische Commissie op dierlijke en menselijke onderzoek van de Universitat Autònoma de Barcelona en de bestuurlijke gebied d &#39; Agricultura, Ramaderia, Pesca ik Alimentació van de Generalitat de Catalunya (protocol #8741).
 1. feeder cel inactivering en opslag Opmerking: menselijke voorhuid fibroblasten (HFF-1) werden eerder bevroren in 1 mL van bevriezing oplossing bestaande uit 90% foetale boviene Serum (FBS) en 10% dimethyl sulfoxide () DMSO) en in vloeibare stikstof tot gebruik opgeslagen.
<ol><li>Ontdooien van een cryogene Injectieflacon van HFF-1 (1 mL) door de ampul in een waterbad 37 ° C onder te dompelen.</li>
	<li>De ontdooide inhoud van de cryogene flacon toevoegen aan voorverwarmde Dulbecco &#39; s gewijzigd Eagle &#39; s Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS te maken van een 1:10 verdunning.</li>
	<li>De verdunde cellen (10 mL) in een maatkolf van T75 zaad en cultuur hen bij 37 ° C en 5% CO 2.</li>
	<li>De volgende dag, wijzigen de middellange tot het elimineren van de overblijfselen van DMSO. Verwijder het medium en voeg toe 10 mL voorverwarmde DMEM aangevuld met 10% FBS.</li>
	<li>De HFFs cultuur en wijzigen van het medium elke 48 uur totdat de cultuur de confluente fase bereikt. Dit kan ongeveer 7 tot 10 dagen duren.</li>
	<li>Bereid de inactivatie-oplossing, mitomycine C in DMEM aangevuld met 10% verdunnen FBS op een eindconcentratie van 10 µg/mL. Incubeer de cellen met de inactivering oplossing gedurende 3 uur bij 37 ° C en 5% CO 2.</li>
	<li>Verwijderen van de inactivatie-oplossing en spoel de cellen driemaal met 2 mL van Hanks evenwichtig zout oplossing (HBSS) te elimineren mitomycine C restanten.</li>
	<li>Als u wilt loskoppelen van de geïnactiveerd cellen, voeg 1 mL voorverwarmde trypsine-EDTA-oplossing toe en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C en 5% CO 2.</li>
	<li>Observeren de cellen onder een omgekeerde Microscoop om ervoor te zorgen dat ze zijn vrijstaand (10 x doelstelling met 0.3 numerieke diafragma of NB). Als zij niet zijn, incubeer hen voor een paar meer minuten bij 37 ° C en 5% CO 2. Controleer de cellen opnieuw onder de omgekeerde Microscoop.</li>
	<li>De oplossing met een pipet van Pasteur Pipetteer om zich te distantiëren van de cel bosjes.</li>
	<li>De enzymatische oplossing te neutraliseren door toevoeging van DMEM aangevuld met 10% FBS en resuspendeer 4 mL.</li>
	<li>Nemen een aliquoot gedeelte van de celsuspensie en maak een verdunning van 1:100 in HBSS. Om te bepalen van het aantal cellen, 10 µL van de verdunning te laden in een Neubauer &#39; s kamer. Gelegen in één van de grote pleinen van de kamer onder een omgekeerde Microscoop (20 x doelstelling met een 0,45 nb) cellen tellen.
	<ol><li>Herhalen het tellen in een totaal van vier grote pleinen. Bereken het totale aantal cellen (N) als N = gemiddeld aantal cellen getelde x totale volume x verdunning x 10 4.</li>
	</ol></li> <li>Centrifugeren van de rest van het monster gedurende 5 min. op 200 x g. negeren het supernatant en resuspendeer de pellet met het bevriezen van de oplossing bij een concentratie van 10 6 cellen per mL.</li>
	<li>De schorsing in cryogene flacons met 10 6 cellen (1 mL) elk aliquot. Plaats de cryogene flesjes in een bevriezing container en bevriezen bij -80 ° C.</li>
	<li>De volgende dag, slaan de cryogene flesjes in vloeibare stikstof.</li>
</ol> 2. De cultuur van de cel van de feeder <ol><li>een tot vier dagen vóór het begin van het proces van afleiding, dooi een cryogene flacon met 1 x 10 6 geïnactiveerd HFF-1 cellen in een waterbad bij 37 ° C.</li>
	<li>Maken een verdunning van 1:6 voor de ontdooide HFF-1 in vooraf opgewarmd DMEM aangevuld met 10% FBS en houd de temperatuur bij 37 ° C.</li>
	<li>Vul elk putje van de plaat van een 4-well met 500 µL voorverwarmde 0,2% gelatine van varkens huid en houden de plaat bij 37 ° C gedurende 10 minuten</li>
	<li>Verwijder de 500 µL van gelatine uit de putten en voeg 500 µL van de HFFs-verdunning. Zachtjes rock de plaat om te zorgen voor een gelijkmatige verdeling van de HFFs op de bodem van de putten. Vermijd rondgaande bewegingen, anders zal de cellen zich concentreren in het midden van de put.</li>
	<li>Broeden van de plaat ten minste 24 uur bij 37 ° C en 5% CO 2 te verkrijgen van een monolayer van geïnactiveerd HFFs in elk putje.</li>
	<li>De volgende dag, de cellen onder een omgekeerde Microscoop (10 X doelstelling met 0.3 nb) observeren en controleren of ze zijn aangesloten en homogeen verspreid. Het wijzigen van het medium te elimineren van de overblijfselen van DMSO. Verwijder het medium en voeg toe 500 µL voorverwarmde DMEM aangevuld met 10% FBS.</li>
</ol> 3. Embryo's worden verzameld en cultuur <ol><li>vier dagen voor embryo's worden verzameld, beheren 5 IU van zwangere merrie &#39; s serum gonadotrofinen door intraperitoneale injectie met 6-12 weken oude vrouwelijke muizen. 
	Opmerking: We hebben gebruikt vrouwtjes uit de 129S2 of de B6CFAF1 stammen, hoewel vrouwen van andere stammen van de muis kunnen worden gebruikt. Niettemin, wanneer werken met vrouwen van niet-tolerante stammen (bijvoorbeeld CBA) medium moet worden aangevuld met 2i zoals vermeld in stap 4.2.</li>
	<li>Na 48 h, 5 IU van humaan choriongonadotrofine beheren door intraperitoneale injectie en mate van de vrouwtjes met mannen, ten minste 8 weken oud zijn, op een 1:1 verhouding. Scheiden de vrouwtjes van de mannetjes's anderendaags.</li>
	<li>De dag vóór de embryo's worden verzameld, bereiden een 35-mm celcultuur petrischaal met enkele 40 µL druppels KSOMaag medium aangevuld met 4 mg/mL bovien serumalbumine (BSA) en vul de plaat met minerale olie aan de druppels volledig te dekken. Incubeer de schotel op 37 ° C en 5% CO 2 aan het medium equilibreer.</li>
	<li>Te bereiden embryo manipulatie pipetten, verwarm het dunnere deel van een lang-tipped glas Pasteur Pipetteer met behulp van een bunsenbrander. Zodra zacht, het opzeggen van de vlam en de twee uiteinden uit elkaar trekken. Breken op de gewenste lengte. De inwendige diameter aan het uiteinde moet 100-150 µm.</li>
	<li>De vrouwelijke muizen door cervicale dislocatie 45-48 h post coitum (in pct.) euthanaseren.</li>
	<li>Ontleden de muizen om de buikholte door het snijden van de huid met een gebogen goede scherpe schaar en het buikvlies met rechte scherpe schaar bloot te stellen. Pak een baarmoeder met een tang, afgesneden van het oviduct met behulp van rechte scherpe schaar, en plaats deze in Hepes-buffer CZB medium (HCZB) 13 bij 37 ° C. Herhaal het proces voor het verwijderen van de andere oviduct.</li>
	<li>Flush de oviducts met een spuit van 1 mL met HCZB geladen op zijn plaats gehouden door horlogemaker pincet voor het verzamelen van de embryo 2-cel. 
	Opmerking: Om te bereiden de afboekingsmethode naald nemen een 30 G hypodermische naald, knippen het einde, en tot een botte uiteinde op een schurende steen.</li>
	<li>Met behulp van de mond Pipetteer apparatuur, halen de embryo's, was ze in HCZB en cultuur hen in de schotel cultuur eerder bereid embryo bij 37 ° C en 5% CO 2 tot het blastocyst-stadium. Maximaal 50 embryo's kunnen worden gekweekt in elke 40 µL daling. Controleren van embryo-ontwikkeling elke 24 uur onder een stereomicroscoop. 
	Opmerking: U kunt ook embryo's kunnen worden verzameld in het blastocyst stadium te verkorten in vitro embryocultuur. In dit geval, de vrouwtjes euthanaseren ten dage 3,5-4,5 pct., ontleden van de baarmoeder. en spoel het met HCZB.</li>
</ol> 4. Afleiding van de cel van de stam <ol><li>voorbereiding van de afleiding-platen <ol><li>op de dag van het embryo zaaien, bereiden het medium afleiding door aanvulling DMEM medium met 100 µM 2-β-mercaptoethanol, 1 x niet-essentiële aminozuren , 20% van serum vervanging, en 10 3 U/mL LIF.</li>
		<li>Indien gewenst ook toevoegen 1 µM van de MEK-remmer PD0325901 en 3 µM van de GSK3 remmer CHIR99021 te verkrijgen van een medium 2i.</li>
		<li>Nemen de 4-well plaat met de enkelgelaagde van geïnactiveerd HFFs (stap 2.6) van de Incubator. Verwijder het medium en 800 µL voorverwarmde afleiding medium toevoegen aan elk putje. De plaat terug te keren naar de incubator.</li>
	</ol></li> <li>Zona zitten verwijdering en embryo zaaien <ol><li>bereiden een 35 mm-celkweek petrischaal met drie 30 µL druppels van zure Tyrode &#39; s oplossing 14 en drie 30 µL druppels van afleiding medium. Dekking van de druppels met minerale olie en houd de schotel bij 37 ° C.</li>
		<li>Nemen de embryo cultuur schotel uit de incubator. Één voor één, de blastocysten van de cultuur-druppels overbrengen naar een zure Tyrode &#39; s voor een daling van de oplossing met behulp van een precisiepipet embryo manipulatie. Indien mogelijk, selecteert u alleen de uitgebreide blastocysten voor voorsprong naar de procédé afleiding.</li>
		<li>Volgen de spijsvertering van de zona zitten onder de stereomicroscoop. Zodra de zona zitten verdwijnt, overbrengen in de blastocyst een afleiding middellange druppel om te wassen de zure Tyrode &#39; s oplossing.</li>
		<li>Nemen de plaat 4-well afleiding uit de incubator en seed een zona-vrije blastocyst op de feeder cellen in elk putje.</li>
		<li>De 4-well afleiding plaat terug te keren naar de couveuse en cultuur bij 37 ° C en 5% CO 2.</li>
	</ol></li> <li>Monitoring stamcel groei en medium wijzigen <ol><li>volgen de culturen elke 24 uur onder een omgekeerde Microscoop (20 X doelstelling met 0,45 nb). Het is belangrijk op te merken of er zijn tekenen van stamcel differentiatie, zoals gezwollen refractieve cellen rondom de uitgroei of zelfs duwen de feeder cellen opzij.</li>
		<li>Om de andere dag, wijzigt het medium van de cultuur. Neem de plaat 4-well uit de incubator, het medium verwijderen uit elk putje en toevoegen van 800 µL voorverwarmde afleiding medium aangevuld met LIF en 2i, als gebruikt. De cultuur handhaven totdat uitwassen worden waargenomen (6-8 dagen).</li>
	</ol></li></ol> 5. Cultuur van de cel van de stam en onderhoud <ol><li>voorbereiden Kolle-achtige handgrepen en stamcel manipulatie pipetten. Volg stap 3.4 ter voorbereiding van de stamcel manipulatie pipetten met een inwendige diameter op het puntje van 250-300 µm. gebruik het andere deel van de getrokken Pipet van Pasteur te bereiden handgreepsteun Kolle-achtige. Warmte en vorm het tot het verkrijgen van een haak.</li>
	<li>Nemen de plaat 4-well cultuur uit de incubator en zoek de uitgroei onder een stereomicroscoop. Gebruik de hendel weg te duwen de gedifferentieerde cellen en de feeders die de uitgroei omringen. 
	Opmerking: Om te voorkomen dat een eventuele differentiatie van de uitgroei, het is belangrijk om alle gedifferentieerde cellen van de rand van de uitgroei.</li>
	<li>Gecombineerd de uitgroei met een stamcel manipulatie pipet en plaats deze in een nieuwe schotel een daling van 50 µL trypsine-EDTA.</li>
	<li>Gebruik van een scalpel te snijden de uitgroei in verschillende delen om het gedesag, zowel mechanisch als enzymatisch.</li>
	<li>Breng meteen, de uitgroei fragmenten in een verse daling van afleiding medium te neutraliseren trypsine actie.</li>
	<li>De uitgroei fragmenten overbrengen in een nieuwe 4-well-plaat met een enkelgelaagde van feeders. Overdracht van maximaal 10 fragmenten per putje en cultuur ze met afleiding medium bij 37 ° C en 5% CO 2.</li>
	<li>Onderhouden de stamcel-achtige culturen voor ten minste zes weken alvorens de regel van de mESC opgericht. Het medium wijzigen elke andere dag en subcultuur hen wekelijks.</li>
</ol>

<ol><li>Biswas, A., Hutchins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells.</a> Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).</li>
<li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+stem+cell+states%3A+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).</li>
<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells%3A+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).</li>
<li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prot%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).</li>
<li>Smith, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pluripotential+embryonic+stem+cell+differentiation+by+purified+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.</a> Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).</li>
<li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li>
<li>Brook, F. A., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+efficient+derivation+of+embryonic+stem+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).</li>
<li>Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+germline+transmission+of+mouse+embryonic+stem+cells+grown+in+synthetic+serum+in+the+absence+of+a+fibroblast+feeder+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer.</a> Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Wakayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+establishment+of+mouse+embryonic+stem+cell+lines+from+single+blastomeres+and+polar+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+%28Dayton%2C+Ohio%29%22%5BJournal%5D)">Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).</li>
<li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2760894">An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).</li>
<li>Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).</li>
<li>Lee, K. H. <a target="_blank" href="https://www.intechopen.com/books/pluripotent-stem-cells/conditions-and-techniques-for-mouse-embryonic-stem-cell-derivation-and-culture">Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture.</a> Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).</li>
<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+foreskin+fibroblast+produces+interleukin-6+to+support+derivation+and+self-renewal+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).</li>
<li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+generation+of+C57BL%2F6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).</li>
<li>Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+medium+composition+and+serum+or+serum+replacement+concentration+influences+on+the+maintenance+of+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells.</a> Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).</li>
<li>Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+difference+in+establishment+of+mouse+embryonic+stem+%28ES%29+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines.</a> Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).</li>
<li>Gonzalez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+culture+conditions+support+distinct+states+associated+with+different+developmental+stages+and+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency.</a> Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

MESC lijn afleiding is een bekende procedure routinematig gebruikt in veel laboratoria, is de doeltreffendheid ervan niet altijd zo hoog zoals verwacht als gevolg van meerdere factoren die pluripotent onderhoud kan verstoren. In dit artikel tonen we stap voor stap hoe om mESC lijnen met hoge rendementen met behulp van een eenvoudige en betrouwbare protocol. Deze efficiëntie zijn vergelijkbaar met die in de literatuur gemeld.
Om ervoor te zorgen maximale efficiëntie, is het belangrijk om te con...

Embryonale stamcellen (ESC) zijn pluripotente cellen, afgeleid van inplanting embryo's, die de mogelijkheid om zelf vernieuwen of onderscheid onder specifieke voorwaarden1te behouden. Op basis van deze eigenschappen, ESC geworden een nuttig hulpmiddel voor regeneratieve geneeskunde, ziekte modellering en weefsel engineering studies2.
ESC waren ontleend voor inplanting muis embryo's, van oorsprong muis ESC (mESC) lijnen met lage succes3,4voor de eerste keer. Jarenlang bleef de efficiëntie van de afleiding laag vanwege de moeilijkheid van het handhaven van pluripotent in vitro. Naast de aanwezigheid van feeder cellen5, die de efficiëntie van de afleiding, kolonie gehechtheid bevorderen, en vergroten van de stabiliteit van de karyotypic6, verschillende wijzigingen van het protocol tot een verbetering in pluripotent onderhoud. De belangrijkste moesten de toevoeging van leukemie Inhibitory Factor (LIF) mESC kweekmedium7,8, het gebruik van embryo's uit de 129S2 tolerante achtergrond9 en de cultuur van mESC met medium aangevuld met gedefinieerd serum, potentiële factoren van de differentiatie10gratis. Recenter, dwingend bewijs blijkt dat toevoeging van een cocktail van twee kleine-molecuul modulatoren van signaalroutes aan het mESC kweekmedium (bekend als 2i) is het beste om pluripotent. De cocktail 2i bestaat uit een combinatie van de MEK-remmer PD0325901, waardoor de differentiatie signalen door remming van het traject van mitogeen-geactiveerd proteïne kinase (MAPK), en de GSK3β-remmer CHIR99021, die overleving van de cel bij lage dichtheid verbetert door het activeren van de Wnt traject11.
In dit artikel beschrijven we een eenvoudig protocol om efficiënt ontlenen muis blastocysten mESC lijnen. We volgen standaardprocedures, kweken van embryo's uit tolerante stammen op feeder cellen in afleiding medium aangevuld met LIF en een serum vervanging12. Na dit protocol, mESC lijnen kan worden afgeleid met efficiëntie gelijkwaardig zijn aan die verkregen in 2i medium. Desondanks kunnen 2i worden toegevoegd om te voorkomen dat eventuele problemen met pluripotent onderhoud of bij het werken met niet-tolerante stammen.

<table><tbody><tr><td>1 mL sryringe</td><td>BD&nbsp;</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>2-&beta;-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Tyrode's solution&nbsp;</td><td>Home-made</td><td></td><td>Zie recept in Nagy et al, 2003. Voor kortetermijnopslag (maximaal 1 maand) bewaar deze bij 4&ordm;C. Alternatief, voor langetermijnopslag bewaar deze bij -20&ordm;C. Als de efficiëntie van de oplossing afneemt, moet deze worden verzuurd door de toevoeging van een kleine druppel HCl 1M.&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes - Invitrogen</td><td>A-21200</td><td>1:500 verdunning. Secundaire antilichaam voor Oct4, Tuj1, &alpha;SMA en AFP muisantilichamen.&nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR990212</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1386</td><td>Reconstitueer met 2,15 ml DMSO voor elke mg poeder, om een 1 mM stockoplossing te verkrijgen. Aliquoteer op gewenst volume en bewaar bij -20&ordm;C. Vermijd bevriezen en ontdooicycli.&nbsp;</td></tr><tr><td>CryoTube</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>3754518</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41640</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>BioWest</td><td>L0107</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td>Inactiveer het voor gebruik door 30 minuten te verwarmen bij 56&ordm;C. Aliquoteer en bewaar bij -20&ordm;C</td></tr><tr><td>Flushing needle</td><td>BD&nbsp;</td><td>304000</td><td>Snijd het uiteinde van de naald af en slijp het tot een stompe punt op een schuursteen</td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Fluka</td><td>48724</td><td>Verdun met 0,2% in gedestilleerd water en autoclaveer het. Elke verdunning kan een maand lang worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td><td>Molecular Probes - Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>1:500 verdunning. Secundair antilichaam voor Sox2 konijnantilichaam.&nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>BioWest</td><td>L0611</td><td></td></tr><tr><td>Hepes-buffered CZB&nbsp;</td><td>Home-made</td><td></td><td>Zie samenstelling in Chatot et al, 1989</td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin</td><td>Divasa-Farmavic</td><td>Veterin-Corion 3000 UI</td><td>Verdun in NaCl 0,9% tot 50 IE/ml. Aliquoteer het in 1 ml en bewaar het tot twee maanden bij -20&ordm;C. Na ontdooien niet opnieuw invriezen.&nbsp;</td></tr><tr><td>Human foreskin fibroblasts</td><td>ATCC</td><td>ATCCSCRC-1041</td><td>Voor langdurige opslag wordt het aanbevolen om ze in vloeibare stikstof op te slaan.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;10828-028</td><td>Fotogevoelig. Het wordt aanbevolen om het in kleine volumes, zoals 10 ml, te alicuoteren en het bij -20&ordm;C te bewaren (controleer de vervaldatum). Vermijd bevriezen en ontdooicycli.&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>KSOMaag Evolve</td><td>Zenith Biotech</td><td>ZEKS-050</td><td>Supplement met 4 mg/ml BSA. Breng in evenwicht bij 37&ordm;C en 5% CO2 een dag voor gebruik.</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>Merk Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Mice&nbsp;</td><td>Charles River/Harlan</td><td></td><td>Het wordt aanbevolen om muizen van een permissive stam te gebruiken in termen van mESC-derivatie (zoals 129S2 of C57BL). Echter, inteeltstammen zijn minder efficiënt in het produceren van embryo's. Daarom wordt het aanbevolen om een hybridestam te gebruiken, zoals 129S2 x C57BL of B6CBAF1 om te profiteren van de hybride kracht.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Embryo getest. Fotogevoelig.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Serva</td><td>2980501</td><td>Reconstitueer het poeder met MilliQ water bij 0,5 mg/ml. Bewaar bij 4&ordm;C beschermd tegen licht. Let op, het is schadelijk en verdacht van het veroorzaken van kanker.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mouse anti-tubulin &beta; III (Tuj1)</td><td>Biolegend</td><td>MMS-435P</td><td>1:500 verdunning</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-&alpha;SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:200 verdunning</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-AFP</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1368</td><td>1:50 verdunning</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti Oct3/4&nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>Sc-5279</td><td>1:50 verdunning</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1408</td><td>Reconstitueer met 2,08 ml DMSO voor elke mg poeder, om een 1 mM stockoplossing te verkrijgen. Aliquoteer op gewenst volume en bewaar bij -20&ordm;C. Vermijd bevriezen en ontdooicycli.</td></tr><tr><td>Petri dish (35mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (60mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Pregnant mare's serum gonadotropin</td><td>Foligon</td><td>Foligon-1000 UI</td><td>Verdun in NaCl 0,9% tot 50 IE/ml. Aliquoteer het in 1 ml en bewaar het tot twee maanden bij -20&ordm;C. Na ontdooien niet opnieuw invriezen.&nbsp;</td></tr><tr><td>Rabbit policlonal anti-Sox2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5603</td><td>1:200 verdunning</td></tr><tr><td>T75 falcon</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 10x</td><td>BioWest</td><td>X0930</td><td>Verdun 1:10 in HBSS om een 1x oplossing te verkrijgen</td></tr></tbody></table>

afleiding van stamcellijnen uit muis voor inplanting embryo 's

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Muis embryonale stamcellen (mESC) afleiding is het proces door welke pluripotente cellijnen van voor inplanting embryo's zijn gevestigd. Deze lijnen behouden de mogelijkheid om zelf vernieuwen of onderscheid onder bepaalde voorwaarden. Als gevolg van deze eigenschappen, mESC vormen een nuttig instrument in regeneratieve geneeskunde, ziekte modellering en weefsel engineering studies. Dit artikel beschrijft een eenvoudig protocol om te verkrijgen mESC lijnen met hoge afleiding efficiëntie (60-80%) door kweken blastocysten van permissieve muis stammen op feeder cellen in beschreven medium aangevuld met leukemie remmende factor. Het protocol kan ook worden toegepast om efficiënt mESC lijnen ontlenen in niet-tolerante muis stammen, door de eenvoudige toevoeging van een cocktail van twee kleine-molecuul remmers aan het medium van de afleiding (2i medium). Gedetailleerde procedures over de opstelling en de cultuur van feeder cellen, verzameling en cultuur van muis embryo's, en afleiding en de cultuur van mESC lijnen zijn bestemd. Dit protocol vereist geen speciale apparatuur en kan worden uitgevoerd in een laboratorium met eenvoudige zoogdieren cel cultuur expertise.

Naar aanleiding van dit protocol, meer dan 95% van de uitgroei vorming moet gebeuren na de eerste week van de cultuur (figuur 1A). Vestiging van mESC lijnen na zes passages is variabel van experimentele replicaat-organismen, met een gemiddelde succes van 60-80%. De toevoeging van 2i aanzienlijk verbetert niet de resultaten bij het werken met tolerante muis stammen, zoals die met een 129S2 achtergrond, maar het is noodzakelijk bij het werken met niet-tolerante...

Dit artikel beschrijft een protocol om efficiënt ontlenen en cultuur pluripotente stamcellijnen uit muis embryo's in het blastocyst stadium.

Afleiding van stamcellijnen uit muis voor inplanting embryo 's

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Stamcellen zijn pluripotente en gespecialiseerde cellen die worden gekenmerkt door hun langdurige zelfvernieuwing en hun vermogen om onder bepaalde omstandigheden gedifferentieerde cellen uit de drie kiembladlagen voort te brengen. Vanwege deze eigenschappen hebben stamcellen een groot potentieel in de regeneratieve geneeskunde, ziektemodellering en diertechniek. Jarenlang zijn embryonale stamcellijnen voor onderzoeksdoeleinden voornamelijk afgeleid van muisembryo's, maar over het algemeen waren de behaalde derivatie-efficiënties laag.In deze video tonen we een eenvoudig protocol om muizen embryonale stamcellijnen af te leiden onder standaardcondities, wat redelijk hoge afleidingsrendementen oplevert die vergelijkbaar zijn met de rendementen die worden behaald bij het gebruik van modulatoren van signaleringspaden, zoals 2i. In dit protocol gebruiken we menselijke voorhuidfibroblasten als feeder-cellen voor de afleiding en kweek van ESC's. Voordat het proces van ESC-afleiding wordt gestart, is het noodzakelijk om de feeder-cellen te inactiveren.Neem eerst een cryovial met menselijke voorhuidfibroblasten die bewaard zijn in vloeibare stikstof en ontdooi deze door het vial onder te do

derivation-of-stem-cell-lines-from-mouse-preimplantation-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft de afleiding van transplanteerbare hematopoietische stamcellen uit muis embryonale stamcellen (ESC) en de daaropvolgende injectie in dodelijk bestraalde ontvangende muizen. In het kort, worden ESC gedifferentieerd embryoid lichamen, die vervolgens besmet zijn met retrovirale HoxB4 en co-gekweekt met OP9 stromale cellen en hematopoietische cytokines.

Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

Het vermogen van menselijke embryonale stamcellen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in alle celtypen van het lichaam, suggereert dat zij een grote belofte voor zowel de medische toepassingen en als een research tool voor het aanpakken van fundamentele vragen bij ontwikkeling en ziekte vast te houden. Hier bieden wij een beknopte, stap-voor-stap protocol voor de winning van menselijke embryonale stamcellen uit embryo's door immunosurgical isolatie van de binnenste celmassa.

Afleiding van menselijke embryonale stamcellen door Immunosurgery

Het vermogen van embryonale kiemcellen om in primordiale kiemcellen differentiëren tijdens de vroege ontwikkelingsstadia is een perfect model om onze hypothese te pakken over kanker en onvruchtbaarheid. Dit protocol laat zien hoe primordiale kiemcellen van de ontwikkeling van gonaden isoleren in 10.5-11.5 dagen na coitum muizenembryo's.

Isolatie en Afleiding van muis embryonale cellen Germinal

In deze video, tonen we de isolatie van de muis blastocysten en de afleiding van trofoblast stamcellen uit blastocysten. We beschrijven ook de voorwaarden voor het onderhoud van de stamcel terrein en in de inductie van differentiatie in cultuur.

Afleiding van Mouse trofoblast stamcellen uit blastocysten

Het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) lijnen produceert lijnen van verschillende ontwikkelingspotentieel, zelfs als ze passeren standaard tests voor pluripotentie. Hier beschrijven we een protocol muizen volledig zijn verkregen uit iPSCs die de iPSC lijnen gedefinieerd als hebbende full pluripotentie...

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Een eenvoudige methode voor het afleiden van en onderhouden van SSC en stamceltransplantatie lijnen van volwassen muizen wordt hier gepresenteerd. De werkwijze gebruikt voedingscellen afkomstig van de somatische cel compartiment van de volwassen muis testis. Deze techniek is voor het gemeenschappelijk muizenstammen, inclusief transgene, knock-out en knock-in muizen.

Seriële Verrijking van spermatogonia stam-en progenitorcellen (SSC&#39;s) in cultuur voor het afleiden van lange termijn Adult Mouse SSC Lines

In de afgelopen jaren de vorming van kiemcellen middels in vitro kweekmethoden is aangetoond met behulp van verschillende soorten van somatische stamcellen. Dit artikel zal visueel presenteren de differentiatie van pasgeboren muizen afgeleide stamcellen om vroeg eicel-achtige cellen.

Differentiatie van pasgeboren muis Skin afgeleide stamcellen in Germ-achtige cellen<em&gt; In vitro</em

We beschrijven een aantal methoden om kleurstoffen injecteren van DNA vectoren, virussen en cellen om zowel cellot en fenotype van endogene en geënte cellen uit embryonale of pluripotente cellen in muizenembryo's op embryonale dag (E) 9,5 en latere stadia bewaken ontwikkeling.

Cell Labeling en Injectie in ontwikkelingslanden Embryonale Mouse Hearts

Dit protocol geeft een werkwijze kwantitatieve eencellige voeren in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie mouse pre-implantatie embryo bestuderen. De noodzakelijke voor het verzamelen van blastocysten procedures, whole-mount immunofluorescentie detectie van eiwitten, beeldvorming van de monsters op een confocale microscoop, en nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden beschreven.

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

Dit artikel is bedoeld om het gebruik van parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen aan te tonen als vervanging voor sperma voor de bouw van semi-gekloonde embryo's.

Toepassing van muis parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen als een substituut van sperma

Leer een efficiënt protocol voor het afleiden van muizenembryonale stamcellijnen met hoge opbrengst. Deze methode gebruikt standaardculturen met humane voorhuidfibroblasten als voedercellen voor regeneratieve geneeskunde.

Afleiding van stamcellijnen uit muis voor inplanting embryo 's

Meer video's verkennen