Name: In Vivo Multimodale beeldvorming en analyse van Laser-geïnduceerde Choroidal Neovascularization muismodel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Leer multimodale beeldvorming van laser-geïnduceerde choroidale neovascularisatie in muizen met SD-OCT en fluoresceïne-angiografie. Deze methode volgt CNV-progressie objectief voor oogaandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank Yuliya Naumchuk (Loyola Universiteit Chicago) en Agne Žiniauskaitė (Experimentica Ltd.) voor uitstekende technische en videografische steun. Dr. Kaja het onderzoeksprogramma wordt ondersteund door de Dr. John P. en Therese E. Mulcahy begiftigd hoogleraarschap in oogheelkunde aan de Loyola Universiteit van Chicago.

Alle dieren waren behandeld in overeenstemming met de verklaring van ARVO voor het gebruik van dieren in Ophthalmic en onderzoek van de visie en de EG-richtlijn 86/609/EEG voor dierproeven, met behulp van protocollen goedgekeurd en gecontroleerd door het dier Experiment Board van Finland.
1. laser-geïnduceerde muis CNV model 5
<ol><li>Inspecteer de ogen van het dier macroscopisch voor eventuele afwijkingen.</li>
	<li>Weeg de muis.</li>
	<li>Berekenen en bereiden een passend bedrag van verdoving te gebruiken, gebaseerd op het gewicht van het dier, bijvoorbeeld een mengsel van medetomidine (1 mg/kg), ketamine (75 mg/kg) en gedestilleerd water (0,9% NaCl-oplossing) in een verhouding van 1:1.5:2.5 of ketamine (40-75 mg/kg), xylazine (5 mg/kg), en gedestilleerd water (0,9% NaCl-oplossing) in een verhouding van 1:2. 5:1; injecteren voor een muis-20 g, 0,1 mL van het mengsel.</li>
	<li>Injecteren verdoving intraperitoneally.</li>
	<li>Plaats de muis terug in de kooi en wacht totdat het dier wordt verdoofd. Bevestig dat de muis is goed verdoofd door gebrek aan een pedaal reflex.</li>
	<li>Zorgen voor het gebruik van laser veiligheid persoonlijke beschermingsmiddelen.</li>
	<li>Zet een spleetlamp en een 532 nm diodelaser.</li>
	<li>Verwijder de muis uit de kooi en de plaats op de verwarming pad.</li>
	<li>Een druppel Tropicamide voor bestaat dilatatie van toepassing. 3-5 min wachten voor full (3 mm) bestaat dilatatie.</li>
	<li>Plaats de muis op het podium van de spleetlamp.</li>
	<li>Plaats één druppel van oogheelkundig vloeibare gel op een dekglaasje aan aan zaden het hoornvlies.</li>
	<li>Het oog van de muis met het hoofd van de oogzenuw in het midden te oriënteren.</li>
	<li>Stel de macht van de laser om 100 mW, de duur aan 100 ms en de spot vergroot tot 50 µm.</li>
	<li>Richten de laserstraal op de retinale pigment epitheel (RPE).</li>
	<li>Maak drie schoten van de laser in één oog door het vermijden van retinale bloedvaten ideaal op de 4, 8, en 12 uur posities rond de oogzenuw, respectievelijk. Inspecteer de fundus van het oog na graveer-schoten voor de afwezigheid van retinale bloedingen. Het contralaterale oog dient als een besturingselement niet-lasered.</li>
	<li>Gooi de dekglaasje aan en plaats de muis weer op de verwarming pad.</li>
	<li>Breng een druppel van PEG gel druppels op beide ogen.</li>
</ol>2. SD-OCT 6,7
<ol><li>Plaatst u de muisaanwijzer in het werkgebied knaagdier uitlijning en immobiliseren van het hoofd.</li>
	<li>Hiermee lijnt u de lens van de SD-OCT-systeem (bijvoorbeeld, Bioptigen/Leica Envisu R2200) aan het gezicht van het oog voor in vivo imaging met behulp van de X - en Y-fase controllers.</li>
	<li>SD-OCT scans om te controleren of de einden van de Bruch membraan uitvoeren: zodra de SD-OCT het hele oog scant, handmatig verplaatsen de referentielijn op de lasered sites. Einden van de Bruch membraan moet duidelijk zichtbaar zijn in lasered gebieden (Zie Figuur 1).</li>
</ol>3. fluoresceïne-angiografie 7,8,9
<ol><li>Muis verwijderen met de houder, en plaats deze op de VA-systeem (bijvoorbeeldHeidelberg Spectralis HRA2).</li>
	<li>Focus op laser branden gebieden van de fundus van het oog met behulp van Infrarood reflectie modus met het hoofd van de oogzenuw in het midden van het weergavevenster.</li>
	<li>0,1 mL 5% fluoresceïne natriumzout voor een muis 20 g injecteren subcutaan of intraperitoneally.</li>
	<li>Focus op het choroidal niveau.</li>
	<li>Neem een beeld van het niveau van de choroidal focus.</li>
	<li>Heroriënteren op het netvlies niveau en een foto.</li>
	<li>Wacht 30 s en herhaal stappen 3.4-3.6.</li>
	<li>Verwijder de muis uit de houder en plaats deze op de verwarming pad.</li>
	<li>Omgekeerde verdoving door alpha2-antagonist voor medetomidine, atipamezole (0,5 mg/kg, i.p.) of wachten op dierlijke herstel van anesthesie.</li>
	<li>Herhaal in vivo SD-OCT en FA imaging in narcose dieren op de follow-up dagen 5, 10 en 14.</li>
</ol>4. CNV sortering
<ol><li>Rang de schade van de Bruch membraan van OCT beelden en choroidal FA beelden genomen onmiddellijk na het laseren op dag 0 als volgt: 0 - Bruch van membraan werd niet beschadigd. 1 - succesvolle schade van Bruch van membraan</li>
	<li>Rang de aanwezigheid van CNV van lasered plekken die had lekkage zoals waargenomen door het vergelijken van de dynamiek van fluoresceïne signaal in een reeks van retinale FA afbeeldingen als volgt: 0 - normale weergave van het netvlies 0,5 - flauw kleuring van lekkage 1.0 - lekkende CNV gebieden Opmerking: Gebruik de OCT beeldvorming voor extra bevestiging van CNV of in twijfelachtig FA waar de aanwezigheid van intraretinal vloeistof in OCT beelden stel CNV sortering.</li>
</ol>5. retinale diktemetingen
<ol><li>Gebruik een software van automatische segmentatie voor retinale diktemetingen. Zorgen dat de totale dikte van het netvlies wordt beschouwd, als de dikte van alle lagen van de zenuw vezel laag RPE (gezonde meting sites), of een denkbeeldige lijn aansluiten RPE rond de site van schade (lasered plaatsen) (Zie ook Figuur 7).</li>
</ol>

<ol><li>Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+experimental+choroidal+neovascularization+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol.+Chic.+Ill+1960%22%5BJournal%5D)">A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat.</a> Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).</li>
<li>Tobe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+neovascularization+in+mice+with+overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).</li>
<li>Seo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+inhibition+of+retinal+and+choroidal+neovascularization+by+oral+administration+of+a+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor.</a> Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).</li>
<li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).</li>
<li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+for+Laser-induced+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization.</a> J Vis Exp. (106), e53502(2015).</li>
<li>Giani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evaluation+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+an+Image-Guided+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization+Model+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice.</a> PloS One. 10, e0132643(2015).</li>
<li>Sheets, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotectin+D1+attenuates+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse.</a> Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).</li>
<li>Hoerster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+and+ex-vivo+characterization+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+variability+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol.+Albrecht+Von+Graefes+Arch.+Klin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).</li>
<li>Sulaiman, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Optical+Coherence+Tomography+Quantification+Method+for+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ocul.+Pharmacol.+Ther.+Off.+J.+Assoc.+Ocul.+Pharmacol.+Ther.+Off.+J.+Assoc.+Ocul.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).</li>
</ol>

De auteur Symantas Ragauskas, Ph.D. is een werknemer (onderzoeker) en aandeelhouder van Experimentica Ltd. dat aanbiedingen contract onderzoeksservices dienst de preklinische CNV model gebruikt in dit artikel.
De auteur Eva Kielczewski is een werknemer (onderzoek toepassingen ingenieur, OCT) van Leica Microsystems dat SD-OCT-systemen die worden gebruikt in dit artikel produceert.
De auteur Joseph Vance is een werknemer (nb OCT Sales Director) van Leica Microsystems dat SD-OCT-systemen die worden gebruikt in dit artikel produceert. Joseph Vance is ook voorzitter en managing director van Spective, LLC.
De auteur Simon Kaja, Ph.D. is consultant Chief Scientific Officer en aandeelhouder van Experimentica Ltd., een preklinische contract onderzoek organisatie die aanbiedingen contract onderzoeksservices, incl. de preklinische CNV-model in dit artikel gebruikt. Simon Kaja, Ph.D. is ook CEO van K & P wetenschappelijke, LLC, een adviesbureau, biowetenschappen en fungeert als Dr. John P. en Therese E. Mulcahy begiftigd hoogleraar oogheelkunde aan Loyola Universiteit Chicago, Stritch School of Medicine. De bepalingen van deze overeenkomst zijn herzien en goedgekeurd door de Loyola Universiteit Chicago overeenkomstig haar beleid van belangenverstrengeling.
De auteur Giedrius Kalesnykas, Ph.D. is een werknemer (CEO) en aandeelhouder van Experimentica Ltd. dat aanbiedingen contract onderzoeksservices dienst de preklinische CNV model gebruikt in dit artikel.

Multimodale imaging biedt waardevolle hulpmiddelen voor CNV pathologie evaluatie. Hier presenteerden we een imaging protocol bestaande uit FA, SD-OCT, en automatische segmentatie voor de snelle, reproduceerbare en betrouwbare evaluatie van CNV pathologie. Een onderbreking van de Bruch membraan na laser regering werd bevestigd. Bovendien mag het gebruik van SD-OCT in dit stadium ook directe visualisatie van mogelijke intraretinal en subretinal bloeduitstortingen, die de interpretatie van resultaten verwarren kunnen. Netvl...

De eerste succesvolle poging om na te bootsen de pathologie van menselijke CNV bij knaagdieren werd bijna drie decennia geleden aangetoond met een laser krypton in Long-Evans ratten1. Daarna werd een krypton laser gebruikt om breken Bruch de membraan in de meest populaire muis spanning, C57BL/6J2,3,4. Het slagingspercentage van CNV inductie werd gecontroleerd met FA en histologische vlekken. Een snelle ontwikkeling van noninvasive beeldvormende modaliteiten, zoals okt, bevorderd de groei van het gebied van knaagdier preklinische modellen. De mogelijkheid om te controleren van morfologische veranderingen in het netvlies op meerdere tijdstippen in de dezelfde ogen aanzienlijk bijdraagt aan de vermindering van dierlijke gebruik en verhoogt de efficiëntie in experimentele studies. Histologische evaluatie van CNV laesies is eerder ongecompliceerd, en vereist labeling van abnormale vasculaire groei rond de site van laser administratie en beeldacquisitie gebied/volume schatting met behulp van de software van de analyse van een afbeelding. In vivo imaging modaliteiten introduceren daarentegen meer complexe analyses van CNV pathologie en de interpretatie ervan.
Hier presenteren we een eenvoudige en relatief snelle methode om de rang inductie, progressie en regressie van CNV met behulp van FA, SD-OCT, en de automatische segmentatie methode in de muis laser-geïnduceerde CNV model.

<table><tbody><tr><td>Medetomidine (commercial name Domitor)</td><td>Orion</td><td>Vnr 01 56 02</td><td>Anesthesie</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Vnr 51 14 85</td><td>Anesthesie</td></tr><tr><td>0,9% NaCl</td><td>B Braun</td><td>357 0340</td><td>Anesthesie</td></tr><tr><td>Xylazine (commercial name Rompun vet)</td><td>Bayer</td><td>vnr 14 89 99</td><td>Anesthesie</td></tr><tr><td>Tropicamide</td><td>Santen</td><td>Vnr 04 12 36</td><td>Mydriaticum</td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Alcon</td><td>Vnr 44 54 81</td><td>Smeermiddel</td></tr><tr><td>Systane</td><td>Alcon</td><td>&nbsp;-</td><td>Smeermiddel</td></tr><tr><td>5% Fluorescein sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6377-100G</td><td>Fluorescent middel</td></tr><tr><td>Atipamezole (commercial name Antisedan)</td><td>Orion</td><td>Vnr 47 19 53</td><td>Anesthesie</td></tr></tbody></table>

in vivo multimodale beeldvorming en analyse van laser-geïnduceerde choroidal neovascularization muismodel

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-geïnduceerde choroidal neovascularization (CNV) is een reeds lang gevestigde model na te bootsen de natte vorm van leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (AMD). In dit protocol willen we de lezer niet alleen door de technische overwegingen voor het genereren van laser-geïnduceerde laesies om te activeren neovascular processen, maar eerder de nadruk op de krachtige informatie die kan worden verkregen vanuit de multimodale longitudinale gids in vivo imaging in de follow-up periode.
De laser-geïnduceerde muis CNV model werd gegenereerd door een diode laser rechtsbedeling. Multimodale in vivo imaging technieken werden gebruikt voor het controleren van CNV inductie, progressie en regressie. Eerste, spectrale domein optische coherentie tomografie (SD-OCT) werd uitgevoerd onmiddellijk na het laseren om te controleren of een onderbreking van de Bruch membraan. Latere in vivo imaging met fluoresceïne-angiografie (FA) bevestigd succesvolle schade van Bruch de membraan van seriële beelden verworven op choroidal niveau. Longitudinale follow-up van CNV proliferatie en regressie op dagen 5, 10 en 14 na het laseren werd uitgevoerd met behulp van zowel de SD-OCT en de FA. Eenvoudige en betrouwbare sortering van lekkende CNV leasions van FA beelden wordt gepresenteerd. Automatische segmentatie voor meting van de totale dikte van het netvlies, gecombineerd met handmatige kaliber toepassing voor meting dikte van de retinale bij CNV sites, toestaan onbevooroordeelde evaluatie van de aanwezigheid van oedeem. Ten slotte is de histologische verificatie van CNV uitgevoerd met behulp van isolectin GS-IB4 kleuring op choroidal flatmounts. De kleuring is thresholded, en het gebied isolectin-positief wordt berekend met ImageJ.
Dit protocol is vooral handig in therapeutics studies vereisen hoge-doorvoer-achtige screening van CNV pathologie aangezien het toestaat snel, multimodale en betrouwbare classificatie van CNV pathologie en retinale oedeem. Bovendien, kan hoge resolutie SD-OCT de opname van andere pathologische kenmerken, zoals de vochtophoping subretinal of intraretinal. Deze methode biedt echter geen mogelijkheid voor het automatiseren van CNV volume analyse van SD-OCT beelden, die moet handmatig worden uitgevoerd.

Een zeepbel of subretinal bloeden onmiddellijk na het laseren is niet altijd zichtbaar. SD-OCT is daarom bijzonder belangrijk om te controleren of de schade van de Bruch membraan. Figuur 1 toont een voorbeeld van OCT imaging op verschillende tijdstippen na toediening van de laser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56173/56173fig1.jpg"> Figuur 1</stron...

Hier presenteren we het nut van longitudinale in vivo imaging in de follow-up van de morfologische veranderingen van laser-geïnduceerde choroidal neovascularization in muizen.

In Vivo Multimodale beeldvorming en analyse van Laser-geïnduceerde Choroidal Neovascularization muismodel

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

Neovasculaire processen zijn een kenmerkend aspect van verschillende veelvoorkomende oculaire pathologieën. De belangrijkste zijn exudatieve maculadegeneratie door ouderdom (of kortweg Wet AMD), proliferatieve diabetische retinopathie en retinopathie van de vroeggeboorene. Samen zijn deze aandoeningen verantwoordelijk voor de meeste gevallen van wettelijke blindheid wereldwijd en zijn ze geassocieerd met aanvullende oculaire complicaties, zoals glasvochtbloedingen en neovasculair glaucoom.Ondanks hun prevalentie zijn de therapeutische opties voor oculaire neovasculaire aandoeningen echter beperkt. De huidige standaardzorg voor neovascularisatie geassocieerd met AMD en proliferatieve diabetische retinopathie is de intravitreale injectie van gehumaniseerde antilichamen gericht tegen een cruciale mediator van angiogenese en neovascularisatie, de vasculaire endotheliale groeifactor of VEGF. Hoewel deze injecties effectief zijn in het stopzetten van de ziekteprogressie en het verbeteren van het functionele gezichtsvermogen, zijn intravitreale injecties kostbaar en zeker niet risicovrij.Complicaties kunnen infecties, endoftalmitis, netvliesloslating en oculaire bloedingen omvatten. Daarom is er een dringende behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe behandelingsopties die effectief, veilig en minder kostbaar zijn. Om de ontwikkeling van geneesmiddelen voor neovasculaire aandoeningen vooruit te helpen, zijn kleine diermodellen van cruciaal belang.Dergelijke modellen moeten reproduceerbaar zijn, beschikken over gevestigde en gevalideerde read-outs en eindpunten, en idealiter een klinisch relevante referentieverbinding gebruiken als positieve controle. In dit protocol presenteren we het muismodel voor choroidale neovascularisatie, of CNV-model, dat een van de meest gebruikte modellen is voor zowel de studie naar pathofysiologische mechanismen die bijdragen aan CNV als voor de ontwikkeling van nieuwe anti-neovasculaire middelen. In het CNV-model wordt het membraan van Bruch geruptureerd met een argonlaser.Hierdoor worden neovasculaire processen geïnitieerd die vanuit het choroïdea ontstaan. Door gebruik te maken van longitudinale in vivo beeldvorming via spectral-domain optische coherentietomografie, afgekort als SD-OCT, en fluoresceïne-angiografie, kan de proliferatie en regressie van CNV worden gevolgd. Hiermee kan de effectiviteit en het verloop van nieuwe farmaceutische interventies worden beoordeeld.Recente vooruitgang in beeldverwerking maakt bovendien geautomatiseerde segmentatie voor de meting van de retinadikte mogelijk, waardoor een methodologie ontstaat die vrij is van onderzoekersbias om de aanwezigheid van oedeem te evalueren. Hierin zullen we het nut bespreken van de nieuwe InVivoVue Diver-software van Leica Microsystems voor de geautomatiseerde segmentatie van retinale lagen in het muis-CNV-model. Tot slot zullen we bespreken hoe de histologische analyse van gehele retina-preparaten de longitudinale in vivo beeldvorming in dit model kan aanvullen.Voor pupildilatatie wordt een enkele druppel tropicamide in elk oog aangebracht. Vervolgens wordt het dier voorzichtig in de uitlijningshouder voor knaagdieren geplaatst. De muis wordt zo gepositioneerd dat het oog zichtbaar is en wordt vastgezet met de neushouder en een stuk laboratoriumtape dat voorzichtig over de rug wordt geplaatst.Vervolgens wordt een druppel smeermiddel op het oog aangebracht om het te bevochtigen, waarna overtollige vloeistof zorgvuldig met filterpapierstiften wordt verwijderd. Ten slotte wordt de tafel voor het OCT-apparaat uitgelijnd voor de baseline OCT-beeldvorming. In vivo spectral-domain optische coherentietomografie-beeldvorming wordt bij baseline uitgevoerd, voorafgaand aan de laserapplicatie, om de afwezigheid van retinale afwijkingen te verifiëren.Verwijder de muis voorzichtig uit de houder. Plaats één druppel Viscotears Gel op een dekglas om het hoornvlies af te vlakken. Positioneer de muis zodanig dat de papil van de oogzenuw in het midden staat en focus de laserstraal op het retinaal pigmentepitheel.Zet drie laserschoten door retinale bloedvaten te vermijden op de posities van 4, 8 en 12 uur rond de oogzenuw. Controleer na alle laserschoten de stevigheid van het oog om vast te stellen dat er geen retinale bloedingen zijn. Lijn de muis opnieuw uit in de houder en voer een fluoresceïne-angiografie en OCT-beeldvorming uit om de beschadiging van het membraan van Bruch te bevestigen.Voor fluoresceïne-angiografie wordt eerst gefocust op de plekken met laserbrandwonden met behulp van de infraroodreflectiemodus, waardoor de locaties waar de laser is toegediend gevisualiseerd kunnen worden. Injecteer voorzichtig 0,1 milliliters van 5%fluoresceïne-natriumzout, voor ongeveer 20 grams lichaamsgewicht van de muis, zonder de positie van het oog van de muis te veranderen. Begin met het maken van fluoresceïne-angiografiebeelden op het niveau van het choroidea en op het niveau van het netvlies, ongeveer elke 30 seconden.Lijn het oog uit voor OCT-beeldvorming zoals eerder beschreven en start de beeldvorming. Het middelen van het SD-OCT-signaal helpt om de gedetailleerde retinale morfologie beter te visualiseren, zoals getoond in deze sequentie. Zodra de SD-OCT-beeldvorming is voltooid, wordt de muis voorzichtig uit de houder verwijderd.Breng oogmiddel aan in beide ogen. Op dit punt kunt u ervoor kiezen om de anesthesie ongedaan te maken door middel van een subcutane injectie van de alfa-2 antagonist voor medetomidine, atipamezool, of wachten tot het dier zich herstelt van de anesthesie. Herhaal de in vivo SD-OCT en FA-beeldvorming bij geanestheseerde dieren op de follow-updagen vijf, 10 en 14.Gebruik de automatische segmentatiefunctie van de InVivoVue Diver-software voor metingen van de retinale dikte. Voor het gezonde netvlies wordt de totale retinale dikte beschouwd als de dikte van alle lagen, van de zenuwvezellaag tot het RPE. In het gezonde netvlies kan automatische segmentatie individuele retinale lagen nauwkeurig detecteren, zoals in dit voorbeeld te zien is.Het is vermeldenswaard dat op plaatsen waar CNV aanwezig is, de handmatige meting van de retinadikte voor elke CNV-laesieplaats afzonderlijk moet worden uitgevoerd. Van de zenuwvezellaag tot een denkbeeldige lijn die door de RPE-laag loopt. Deze reeks toont de workflow voor handmatige diktemetingen op plaatsen waar CNV-laesies aanwezig zijn.De zenuwvezellaag bevindt zich bovenaan, het choroidea onderaan in de afbeelding. Met de muis of het touchpad worden de grenzen van de zenuwvezellaag en het choroidea handmatig bepaald, waarna de software automatisch de totale retinale dikte berekent op basis van deze coördinaten. Deze figuur toont seriële beelden die elke 20 seconden op het niveau van het choroidea zijn genomen.Afbeelding één werd verkregen in de infraroodreflectiemodus. De overige afbeeldingen zijn gemaakt na intraperitonele injectie van fluoresceïne. De witte pijlen in afbeelding één wijzen naar gelaserde plaatsen, waar op latere tijdstippen lekkage van fluoresceïne zichtbaar is, zoals aangegeven door de witte pijlen in afbeelding 18.Deze afbeelding toont seriële FA-beeldvorming verkregen op het niveau van het netvlies. De witte pijl in afbeelding 18 wijst naar een gelaserde plek, waarbij fluoresceïnelekkage sneller zichtbaar wordt dan bij de andere twee, die in afbeelding 18 door cirkels zijn omlijnd. Deze samenvattende figuur toont het verloop van SD-OCT-beelden over de tijd.Bij de nulmeting, direct na het laseren en op de follow-up tijdstippen op dag vijf, 10 en 14. Samenvattend maakt het protocol voor longitudinale in vivo beeldvorming van CNV-laesies met SD-OCT en FA-beeldvorming een snelle, multimodale en betrouwbare classificatie van CNV-pathologie en de aanwezigheid van retinaal oedeem mogelijk. Bedankt voor uw interesse.

in-vivo-multimodal-imaging-analysis-mouse-laser-induced-choroidal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit artikel beschrijft een optimale volgorde van de gebeurtenissen voor de multimodale beeldvorming van cellulaire grafts in knaagdier hersenen met behulp van: (i) in vivo bioluminescentie en magnetische resonantie beeldvorming, en (ii) post mortem histologische analyse. De combinatie van deze beeldvorming op een enkel dier laat cellulaire graft evaluatie met een hoge resolutie en gevoeligheid en specificiteit.

Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

Source: Bosco, A., et al. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (2015) This video demonstrates in vivo imaging of retinal microglia in a mouse model of glaucoma. A transgenic mouse with fluorescent protein-expressing retinal microglia is positioned under an ophthalmoscope. Infrared illumination is used to locate the optic nerve head (ONH), and the focal plane is...

In Vivo Imaging of Retinal Microglia in a Mouse Model of Glaucoma

Hier presenteren we het protocol voor laser-geïnduceerde choroïdale neovascularisatie (CNV) bij muizen, een experimenteel model dat de vasculaire kenmerken van neovasculaire leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) nastreeft. Eenmaal onder de knie, kan het op betrouwbare en effectieve wijze CNV induceren als modelsysteem om verschillende experimentele maatregelen te testen.

Een muismodel voor Laser-geïnduceerde Choroïdale Neovascularisatie

Dit protocol beschrijft hoe hoge resolutie beeldvormende technieken zoals spectrale domein optische coherentie tomografie en scannen van laser ophthalmoscopy kan worden gebruikt in kleine knaagdieren, met behulp van een oogheelkundige imaging platform systeem, om informatie te verkrijgen over netvlies dikte en microglial cel distributie, respectievelijk.

In Vivo Beeldvorming van Cx3cr1gfp/gfp Reporter muizen met spectrale domein optische coherentie tomografie en scannen Laser Ophthalmoscopy

Hier gepresenteerd is een multiphoton microscopisch platform voor live muis oculaire oppervlakte beeldvorming. Fluorescerende transgene muis maakt de visualisatie van celkernen, celmembranen, zenuwvezels en haarvaten binnen het oculaire oppervlak mogelijk. Niet-lineaire tweede harmonische generatie signalen afgeleid van collageen structuren bieden label-vrije beeldvorming voor stromal architecturen.

Een custom multiphoton microscopie platform voor live beeldvorming van muis hoornvlies en conjunctiva

In vivo beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor de studie van biologie in gezondheid en ziekte. Dit protocol beschrijft transpupillaire beeldvorming van het netvlies van de muis met een standaard microscoop met twee fotonen. Het demonstreert ook verschillende in vivoimaging-methoden om fluorescerend meerdere cellulaire cohorten van het netvlies te labelen.

Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor retinale ader occlusie met behulp van rose bengal en een lasergeleid retinaal beeldvormingscoopsysteem met aanbevelingen om de reproduceerbaarheid ervan in genetisch gemodificeerde stammen te maximaliseren.

Optimalisatie van het Retinal Vein Occlusion Mouse Model om variabiliteit te beperken

Hier beschrijven we een in vivo beeldvormingstechniek met behulp van optische coherentietomografie om de diagnose en kwantitatieve meting van retinopathie bij muizen te vergemakkelijken.

Toepassing van optische coherentietomografie op een muismodel van retinopathie

Hier presenteren we drie data-analyseprotocollen voor fluoresceïneangiografie (FA) en optische coherentietomografie (OCT) beelden in de studie van Retinal Vein Occlusion (RVO).

In vivo Vasculaire letseluitlezingen in het netvlies van muizen om de reproduceerbaarheid te bevorderen

Het huidige protocol beschrijft de implantatie en evaluatie van melanoom in het muriene vaatvlies met behulp van optische coherentietomografie.

Implantatie en evaluatie van melanoom in het muizenvlies via optische coherentietomografie

Leer multimodale beeldvorming van laser-geïnduceerde choroidale neovascularisatie in muizen met SD-OCT en fluoresceïne-angiografie. Deze methode volgt CNV-progressie objectief voor oogaandoeningen.

In Vivo Multimodale beeldvorming en analyse van Laser-geïnduceerde Choroidal Neovascularization muismodel

Meer video's verkennen