Name: Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Leer dissectie en immunefluorescentie van volwassen Drosophila melanogaster hersenen om neuronale ontwikkeling en connectiviteit te bestuderen. Deze methode maakt visualisatie van mushroom body en fotoreceptor neuronen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag bedanken Changhui Pak en Alysia Vrailas Mortimer voor aanvankelijk onderwijs SMK de hersendissectie techniek. Wij danken ook leden van de Ken Moberg lab groep, met name Chris rondes, voor het kritisch lezen van het manuscript. Herkennen van Fas2 antilichamen (1 d 4) en chaoptin (24B10) werden verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank. Antilichaam 24B10 werd gestort op de DSHB door Seymour Benzer en Nansi Colley24,60,,61, antilichaam 1 d 4 werd gestort op de DSHB door Corey Goodman 22,23,56. Vliegen voorraden werden verkregen vanuit het midden van de voorraad Bloomington. Wij willen ook danken de Ohio landbouwkundig onderzoek en ontwikkeling Center (OARDC) MCIC Imaging Center voor gebruik van de confocal microscoop om het imago van de hersenen in figuur 4A en B. SMK wordt ondersteund door een subsidie van NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De dissectie en visualisatie hierboven beschreven methode kan worden gebruikt in een breed scala van immunokleuring en beeldbewerkingstoepassingen leven. Wij een algemene immunokleuring protocol heb geschetst en hebben gewezen op een manier waarin MARCM kan worden gebruikt voor het visualiseren van axonale morfologie van individuele paddestoel lichaam neuronen. Bovendien, deze algemene procedures kunnen ook worden gebruikt voor andere hersengebieden in vaste imaging of vers ontleed volwassene hersenen48,65. Levende imaging voorschrijven een efficiëntere aanpak bij het analyseren van expressiepatronen enhancer vallen, of reporter genen, MiMIC lijnen66, bijvoorbeeld. Om te voorkomen dat artefacten van celdood tijdens live beeldvorming van GFP in nietgefixeerde weefsel vastleggen, hersenen moeten worden ontleed in 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of HL3 media48, gemonteerd op brug dia's in 1 x PBS (of HL3) en beeld in minder dan 15-20 min. Zorg moet ook worden genomen om het verwijderen van zoveel luchtpijp mogelijk van de ontleed hersenen vóór imaging, aangezien het met de visualisatie van GFP fluorescentie interfereren kan.
Terwijl kleuring voorwaarden voor de beoordeling van de morfologie van de paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen relatief gevestigde24,61,67, de lokalisatie van een specifieke proteïne van belang in deze cel zijn typen kunnen vereisen uitgebreide probleemoplossing en optimalisatie. Verschillende kritische stappen, met inbegrip van antilichaam verdunning, blokkerende buffer component concentratie en fixatie, moeten met name worden geoptimaliseerd voor het genereren van de meest reproduceerbaar en betrouwbare resultaten. Ten eerste, de optimale concentratie van primair antilichaam moet worden bepaald. Hoewel verkrijgbare antilichamen vaak een voorgestelde verdunning hebben (en we vaak in eerste instantie beginnen met behulp van die concentratie), wordt deze waarden worden zelden empirisch bepaald op Drosophila weefsels. Dus, het testen van een reeks verdunningen van primair antilichaam dat bereik boven en onder de fabrikant startende suggestie vaak in meer specifieke kleuring resulteert. Terwijl verdunning van het primaire antilichaam kan een significant effect hebben op kleuring van nauwkeurigheid en nauwkeurig moet worden bepaald, de hersenen van de tijd worden geïncubeerd in primair antilichaam bevattende kunnen oplossingen aanzienlijk variëren met weinig effect op het eindresultaat. Bijvoorbeeld, hebben we vergelijkbare resultaten waargenomen wanneer het broeden ontleed hersenen met de Fas2 antilichaam primair antilichaam voor twee, drie of zelfs vier dagen bij 4 ° C. Hoewel we ten minste twee nachten aanraden, hebben wij ook hersenen in primair antilichaam oplossing voor een enkele nacht geïncubeerd en verkregen reproduceerbare kleuring. Nog belangrijker is, helpt beperking van de hoeveelheid tijd hersenen worden geïncubeerd in het secundaire antilichaam tot 3 uur op kamertemperatuur (of één nacht bij 4 ° C) limiet niet-specifieke binding van secundaire antilichamen aan hersenweefsel.
Ten tweede, kan het nodig met extra "blokkeren" reagentia te elimineren van ongewenste achtergrond signaal zijn. Opties omvatten verhoging van de concentratie van NGS ~ 10%, 1-10% boviene serumalbumine (BSA) toe te voegen aan de blokkerende en primaire/secundaire antilichaam oplossingen, of pre adsorptie van primaire antilichamen 's nachts bij 4 ° C met Drosophila embryo's (Zie verwijst naar68, punt 2.9, stap 3).
Terwijl we het bovenstaande protocol gebruikt PTN als de voorgestelde buffer voor alle fixatie hebben geschreven, wassen, en antilichaam-incubatie stappen, weefsel fixatie in andere buffers (zoals PLP en PEM, vermeld in de Materialen tabel) kan leiden tot diepgaande verschillen in de sterkte van het signaal. Bijvoorbeeld, hebben vorige studies aangetoond dat cycline E niet detecteerbaar in larvale imaginaire schijven is wanneer weefsels worden opgelost in traditionele 4% paraformaldehyde verdund in PBS, maar duidelijk zichtbaar is wanneer weefsels worden opgelost in PLP buffer (Ken Moberg, persoonlijke communicatie en verwijzing69). Naast wijzigingen in buffer componenten, wijziging van de tijd en temperatuur voor weefsel fixatie ook aanzienlijk immunefluorescentie beïnvloeden kan kleuring en empirisch kan worden bepaald indien nodig. In het algemeen, fixatie tijd moet lang genoeg om te voorzien in voldoende crosslinking van cellulaire componenten en onderhoud op lange termijn van algemene cellulaire morfologie terwijl ze beperkt genoeg om te voorkomen dat over-crosslinking en "begraven" van eiwit epitopes. Daarom, wanneer aanvankelijk optimaliseren kleuring voorwaarden voor een nieuw verworven primair antilichaam, we meestal beperken fixatie tijd aan ongeveer 20 min en koudere temperaturen vaak weefsels zal vaststellen.
Meerdere besturingselementen moeten worden opgenomen in eventuele immunofluorescentie experiment te onderzoeken van de specificiteit van de primaire en secundaire antilichamen en het effect van transgenen/genetische achtergrond op het waargenomen fenotype. Om na te gaan of het primaire antilichaam specifiek wordt gebruikt de proteïne van belang herkent, moet weefsel van vliegen ontbreekt deze eiwitten en/of weefsel overexpressing het eiwit worden opgenomen als besturingselementen. De toevoeging van overtollige gezuiverd antigeen eiwit kan ook worden opgenomen om te bepalen of het primaire antilichaam andere epitopes in de vlieg hersenen herkent. Tot slot, elke fluorescent signaal aanwezig bij de primaire antilichamen worden weggelaten vertegenwoordigt het niveau van niet-specifieke binding door de geselecteerde secundaire antilichamen.
Verschillende belangrijke besturingselementen moeten ook worden opgenomen voor de beoordeling van de bijdrage van genetische achtergrond of de aanwezigheid van transgenen kleuring intensiteit of neuronale morfologie. Bijvoorbeeld, het vliegen gebruikt in het experiment van de MARCM in Figuur 5 bevatten meerdere transgenen (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, Bad &#62; GAL80 en OK107-GAL4), die elk afzonderlijk moet worden geanalyseerd voor effecten op de morfologie van de paddestoel lichaam. Op een zeer minimale, paddestoel lichaam morfologie van vliegen moet met zowel OK107-GAL4 en UAS-CD8-GFP worden geanalyseerd. Het kan ook zijn nodig om te beoordelen van het effect van warmte schok en Flp recombinase productie door het analyseren van ontwikkelingssamenwerking paddestoel lichaam vliegt die zowel hsFLP als FRT82B bevatten. Hoewel MARCM significante inzicht of een bepaald eiwit autonoom axonale begeleiding bieden kan bepaalt, kunnen het aantal controles nodig zijn om nauwkeurig deze conclusie een kleine beperking van deze techniek. Soortgelijke besturingselementen zijn in minder ingewikkeld experimenten, ook van toepassing. Bijvoorbeeld, neem een experiment waarin het GAL4/UAS -systeem wordt gebruikt in combinatie met een RNAi transgenic tot vechtpartij uitdrukking van een proteïne van belang in alle neuronen. In dit experiment, zullen ten minste twee transgenen aanwezig zijn: een pan-neuronale GAL4 stuurprogramma, zoals elav-GAL4, en de UAS-RNAi transgenic. De morfologie van de paddestoel lichaam neuronen in vliegen met elk van deze transgenen alleen moet naast de experimentele conditie waar vliegen beide transgenen in de dezelfde Vlieg haven worden onderzocht.
Tot slot, om te bepalen of de proteïne van belang wordt uitgedrukt in champignon lichaam neuronen er meestal moet mede vlek hersenen met antilichamen tegen Fas2. Als alternatief, fluorescente proteïnen zoals GFP, RFP of het membraan gebonden CD8-GFP kunnen ook worden uitgedrukt met behulp van de GAL4/UAS -systeem en gebruikt in combinatie met antistoffen herkennen van de proteïne van belang. Fas2 herkent alleen de fasciculated axonen die de paddestoel lichaam α en β lobben vormen, is het gebruik van GAL4-gedreven, membraan-gebonden CD8-GFP sinds vooral handig voor het markeren van de paddestoel lichaam neuronen.
Defecten in axonale begeleiding zijn vaak niet 100% penetrant en zelfs hersenen dezelfde genotype mei uiterlijk vertoon sommige variabiliteit. Daarom, wanneer analyseren nieuw gegenereerd mutant allelen voor gebreken in champignon lichaam of fotoreceptor vastloper, een combinatie van verschillende allelen en benaderingen moet worden benut. De meeste studies in de literatuur gebruiken verscheidene verschillende benaderingen om te onderzoeken of een eiwit een cel-autonome rol speelt in de controle van axonale begeleiding: ik) analyse van vastloper gebreken in homozygoot null vliegen (bij voorkeur met behulp van verschillende null allelen), ii) analyse van vastloper gebreken in vliegen ontbreekt de proteïne van belang alleen in neuronen (meestal via RNAi), iii) MARCM analyse van vastloper gebreken, en iv) redden experimenten waar het gen opnieuw uitgedrukt in de neuronen van homozygoot null is vliegen. Verscheidene dozijn hersenen per genotype moeten idealiter worden geanalyseerd voor gebreken in neuronale morfologie.
Hoewel het protocol hier voornamelijk richt zich op immunefluorescentie lokalisatie van eiwitten binnen vaste weefsel beschreven, worden verschillende toekomstige toepassingen van deze techniek ontwikkeld naar afbeelding live hersenweefsel. Zodra de hersenen worden ontleed (meestal in cel voedingsbodems), kunnen zij vervolgens worden gekweekt voor meerdere dagen bij 25 ° C. Deze ex vivo kweken methoden worden ontwikkeld om te onderzoeken van een breed scala aan biologische processen, zoals de activiteit van het eiwit die axon regeneratie na letsel70,71, intracellulaire bevordert signalering dynamics72en73van de neuronale ontwikkeling.

Hoewel het zenuwstelsel Drosophila kleiner dan die van de mens en knaagdieren is, biedt de complexiteit ervan een krachtige, aanspreekbaar model om beter te begrijpen zijn gewervelde tegenhangers. In veel gevallen coderen het genoom van de gewervelde dieren en vliegen zeer vergelijkbaar eiwitten die de mechanismen van ontwikkeling van het zenuwstelsel dicteren. In feite, nodig veel van de genen voor neuronale ontwikkeling in gewervelde dieren orthologs in vliegen, met inbegrip van die betrokken zijn bij signaalroutes dat controle patronen, neurogenese en axonale begeleiding1,2,3 ,4,5. Netrin is bijvoorbeeld een ligand die nodig zijn voor de oriëntatie van de axonale in zoogdieren en D. melanogaster6,7,8. Terwijl netrin oorspronkelijk geïsoleerd van embryonale chick hersenen weefsel6 was, latere studies is gebleken dat netrin een geconserveerde rol speelt tijdens de ontwikkeling van de embryonale centrale zenuwstelsel (CNS) in Drosophila8. Andere studies hebben genetische schermen waarmee in de embryonale Drosophila CNS geconserveerde liganden en receptoren vereist voor vastloper in zowel Drosophila en gewervelde dieren9aangeduid.
Terwijl de embryonale vlieg CNS heeft uitgebreid in het verleden is gebruikt als aanduiding van liganden, receptoren en intracellulaire signalering eiwitten nodig voor axonale begeleiding8,9, heeft recent werk waar velen van de manieren onderzocht deze eiwitten ook bepalen vastloper besluiten tijdens de latere stadia van ontwikkeling. In het bijzonder heeft onderzoek van paddestoel lichaam (MB) en de retinale fotoreceptor neuron ontwikkeling (Figuur 1) verstrekt inzicht in de mechanismen die controle vastloper, synaps formatie, axon snoeien en verschillende andere aspecten van neuronale ontwikkeling10,11,12,13,14,15,16,17. Fotoreceptor neuronen het vliegen netvlies verbinden met regio's van de volwassen hersenen genaamd de lamina en medulla en zijn essentieel voor het doorgeven van visuele informatie naar de hersenen (herzien door18,-19), terwijl de paddestoel lichaam neuronen zijn Centraal gelegen in de vlieg hersenen en zijn nodig voor leren en geheugen20,-21. Fotoreceptor neuronen zowel de intrinsieke neuronen van de paddestoel organen, Kenyon cellen, genaamd gebruiken evolutionair geconserveerde diffusible en contact-afhankelijke axonale begeleiding mechanismen om te zoeken naar hun post synaptic doelen. Naast het feit dat zichtbaar in volwassen vliegen, kunnen fotoreceptor en MB neuronen ook worden rechtstreeks gevisualiseerd in larven en poppen met antilichamen of verslaggever genen22,23,24,25. De mogelijkheid om gemakkelijk het visualiseren van deze twee sets van neuronen op verschillende ontwikkelings tijd punten heeft het gebruik ervan als prachtige modellen voor vele aspecten van neuronale ontwikkeling bevorderd.
Naast wordt gebruikt als een model om te begrijpen van de mechanismen van de normale zenuwstelsel ontwikkeling, hebben recente studies aangetoond dat vliegen ook als accurate modellen van een breed scala van ziekten bij de mens dienen kunnen, met inbegrip van fragiele X syndroom (FXS)26 , Intellectuele handicap (ID)27,28,29,30,31, e.a.32. Bijvoorbeeld om te bestuderen van de moleculaire functie van ZC3H14, een gen onlangs gekoppeld aan menselijke verstandelijke beperking, we vliegen heeft een model gemaakt van ID met behulp van een null-allel van de vlieg ZC3H14 ortholog, Nab230genoemd. Vliegen ontbreekt Nab2 hebben ernstige geheugen waardeverminderingen en uitgebreid poly(A) staarten, Recapitulerend wat is waargenomen in menselijke patiënten of patiënt afgeleid cel lijnen33,34. Bovenal weergeven vliegen ontbreekt Nab2 ook ernstige hersenen morfologie gebreken in hun volwassen paddestoel organen34, vergelijkbaar met wat is waargenomen in vliegen de FXS syndroom gen, FMR135ontbreekt. Vliegen kunnen dus dienen als een belangrijk model-organisme om te studeren zowel normale hersenontwikkeling en ziekten die verstoren.
Tot slot, de toegankelijkheid van hoge-doorvoer methoden om te controleren van gedrag, gecombineerd met het enorme aantal beschikbare genetische hulpmiddelen, zorg Drosophila een modelorganisme van keuze voor het identificeren van de hersengebieden waarmee complexe gedrag, zoals leren en geheugen, slaap, verkering, dorst en anderen36,37,38,39. Een bijzonder nuttig instrument dat in het midden van een vlieg geneticus "gereedschapskist" is de GAL4/UAS-systeem (Figuur 2). Dit systeem40,41 gebruikt de specifieke expressie weefsel van de transcriptionele activator van Gal4 om de expressie van genen of transgenen stroomafwaarts van een Upstream activeren sequentie (UAS). Wijzigingen van dit systeem zijn toegestaan onderzoekers, bijvoorbeeld, exact bepalen de prikkelbaarheid van specifieke neuronen42,43, overexpress of knock-down specifieke genen van belang44, 45, real-time calcium dynamiek in vivo46analyseren en express reporter genen ter gelegenheid van de neuronale lineages41. De combinatie van het GAL4/UAS-systeem met Mitotische recombinatie ook toegestaan voor de oprichting van het mozaïek-analyse met een Repressible cel Marker (MARCM) systeem12,47. MARCM is gebruikt uitgebreid in enkel neuron tracering om de cellulaire signalering onderdelen vereist voor axonale begeleiding12,47te identificeren. Hoewel deze en andere technieken een aantal waardevolle inzichten over de cellulaire mechanismen die nodig zijn voor de functie van het zenuwstelsel verschaft hebben, de meeste vereisen dat de hersenen van Drosophila eerst worden ontleed; zorgvuldige verwijdering van de hersenen is verplicht te houden juiste hersenen morfologie en verbinding patronen tussen hersengebieden. Het volgende protocol gebruikt paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen alsvoorbeeld neuronale populaties als het begeleidt u doorheen de dissectie en immunefluorescentie kleuring van volwassene Drosophila hersenen.

<table><tbody><tr><td>Microdissectiepincet/pincet</td><td>Ted Pella</td><td>505-NM</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard schotels</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-50-S-BLK</td><td>Beschikbaar via amazon.com</td></tr><tr><td>Fas2 Antilichaam</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>1D4</td><td></td></tr><tr><td>Chaoptin Antilichaam</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP Antilichaam</td><td>Aves Lab</td><td>GFP-1010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 geit anti-muis secundair antilichaam</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 geit anti-kip secundair antilichaam</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 geit anti-muis secundair antilichaam</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyd</td><td>Electron Microscope Services</td><td>RT15713</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slides</td><td>ThermoFisher</td><td>99-910-01</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>ThermoFisher</td><td>12-553-454</td><td></td></tr><tr><td>Na Phosphate Buffer monobasic</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Na phosphate Buffer dibasic</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ml</td><td></td></tr><tr><td>nagellak</td><td>Electron Microscope Services (EMS)</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>stereomicroscoop</td><td>Leica S6D met KL300 LED lichtbron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9-well dish (spot plate)</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>nutator/rocker</td><td>Fisher</td><td>22-363-152 of 88-861-041</td><td></td></tr><tr><td>35mm dish</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Fisher</td><td>50-366-794</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Mogelijke fixatiebuffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTN-buffer</td><td></td><td></td><td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Maak doorgaans 0.5 L van 0.1M NaPhosphate-buffer en verdeel in 50 ml porties als dat nodig is</td></tr><tr><td>PLP-buffer</td><td></td><td></td><td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Los 0.36 g lysine op in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 op ijs. Meng vlak voor gebruik 15 ml van deze gebufferde lysine-oplossing met 50 mg NaIO4 (natriumperiodaat) + 2 ml van de 20% hoge kwaliteit paraformaldehyde (EMS) + 3 ml H2O</td></tr><tr><td>PEM-buffer</td><td></td><td></td><td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, Deze buffer kan gemakkelijk worden gemaakt als 2x stock en verdund met 8% paraformaldehyde (PFA) om een ​​uiteindelijke concentratie van 4% PFA te geven</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Fly Stocks beschikbaar van Bloomington</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elav (c155)-GAL4</td><td></td><td>BL458</td><td>Pan-neuronaal GAL4-driver</td></tr><tr><td>w*;;;OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 854</td><td>GAL4-driver voor alle paddenstoellichaamneuronen (OK107-GAL4-insertie bevindt zich op het 4e chromosoom)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td><td></td><td>BL 7362</td><td>GAL4-driver voor alpha en beta lobben (op 2e chromosoom)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64305</td><td>GAL4-driver voor alpha en beta lobben, bevat ook UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*; 201Y-GAL4</td><td></td><td>BL 4440</td><td>GAL4-driver voor voornamelijk de gamma lobben van paddenstoellichaam (op 2e chromosoom)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64296</td><td>GAL4-driver voor paddenstoellichaam gamma lobben, bevat ook UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyO</td><td></td><td>BL 5145</td><td>MARCM-stam, bevat FRT-site en GAL80 op 2e chromosoom</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL5146</td><td>MARCM-stam, bevat hsFLP, pan-neuronaal GAL4 en CD8-GFP op X-chromosoom</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44408</td><td>MARCM-stam voor het omdraaien van het 3e chromosoom</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub>GAL80;OK107-GAL4</td><td></td><td>BL44406</td><td>MARCM-stam voor het omdraaien van het 2e chromosoom</td></tr><tr><td>w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44407</td><td>MARCM-stam voor het omdraaien van X-chromosoom</td></tr><tr><td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td><td></td><td>BL 5137</td><td>GFP labelt celoppervlak (CD8 is een transmembraaneiwit)</td></tr><tr><td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 5139</td><td>MARCM-stam, bevat FRT-site en CD8-GFP op 2e chromosoom</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td><td></td><td>BL 28832</td><td>MARCM-stam, bevat h

dissectie en immunefluorescentie kleuring van mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen drosophila melanogaster

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Zenuwstelsel ontwikkeling betekent een opeenvolgende reeks van gebeurtenissen die door verschillende signaalroutes en regulerende netwerken worden gecoördineerd. Veel van de eiwitten die betrokken zijn in deze trajecten zijn evolutionair bewaard tussen zoogdieren en andere eukaryoten, zoals de fruitvlieg Drosophila melanogaster, suggereren dat soortgelijke organiserende beginselen bestaan tijdens de ontwikkeling van deze genetisch gemodificeerde organismen. Bovenal is Drosophila gebruikt uitgebreid te identificeren van cellulaire en moleculaire mechanismen tot regeling van de processen die nodig zijn bij zoogdieren waaronder neurogenese, differentiatie, axonale begeleiding en synaptogenese. Vliegen zijn ook met succes gebruikt om het model van een scala van menselijke neurologische ziekten. Hier beschrijven we een protocol voor de stapsgewijze microdissection, fixatie en immunefluorescentie lokalisatie van eiwitten in de hersenen Drosophila volwassen. Dit protocol is gericht op twee voorbeeld neuronale populaties, paddestoel lichaam neuronen en netvlies researchdieren en bevat optionele stappen wilt traceren van individuele paddestoel lichaam neuronen mozaïek analyse met een Repressible cel Marker (MARCM)-techniek. Voorbeeldgegevens uit zowel wild-type en mutant hersenen worden getoond samen met een korte beschrijving van een scorende criteria voor axonale begeleiding gebreken. Terwijl dit protocol twee gevestigde antilichamen benadrukt voor het onderzoeken van de morfologie van de paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen, andere Drosophila hersengebieden en de lokalisatie van eiwitten binnen andere hersengebieden kan ook worden onderzocht met behulp van dit protocol.

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Het algemene doel van dit protocol voor de dissectie van Drosophila-hersenen is het verkrijgen van intacte hersenen van volwassen vliegen die gebruikt kunnen worden in een breed scala aan toepassingen, zoals immunofluorescentie, lokalisatie van GFP-gelabelde eiwitten en ex-vivo kweekexperimenten. Deze methode kan ons helpen om cruciale vragen in de velden van de ontwikkelingsbiologie en neurowetenschappen te beantwoorden, zoals de rollen van specifieke eiwitten en signaleringspaden en het vaststellen van patronen van neuronale connectiviteit tijdens de hersenontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat, zodra deze onder de knie is, het een snelle en effectieve methode biedt voor de immunologische identificatie van morfologische defecten in specifieke regio's van de volwassen hersenen.Deze procedure kan moeilijk te leren zijn, omdat het verwijderen van het exoskelet van de vliegenkop veel zorg en oefening vereist. Uw bewegingen moeten langzaam en weloverwogen zijn, en de armen van de dissectieset moeten goed ondersteund worden om stabiel te blijven. Het is raadzaam om eerst te oefenen op roodogige vliegen en vervolgens op witogige vliegen voordat u daadwerkelijk genotypes dissecteert die van belang zijn voor de eigenlijke experimenten.Om de dissectie voor te bereiden, plaatst u de geanestheseerde vliegen op een koud metalen plaatje of in een Petrischaal die op ijs staat. Gebruik alternatief een vliegenplaatje dat koolstofdioxide afgeeft. Plaats vervolgens een kleine hoeveelheid PTN in het midden van de dissectieschaal om een bel PTN te vormen.Vul vervolgens, onder een stereomicroscoop, het gezichtsveld met de PTN-bel onder uniforme verlichting. Manipuleer de vliegen nu zodanig dat ze op hun rug liggen en breng ze één voor één via het abdomen over naar de PTN. Dompel het dier volledig onder in de PTN en voer de volledige dissectie ondergedompeld in PTN uit.Pak met een tweede pincet de proboscis vast en trek de kop van het lichaam af. Soms wordt de proboscis verwijderd, maar blijft de kop aan het lichaam zitten. Als dit gebeurt, pak dan de mediale rand van één retina vast en oefen zijwaartse kracht uit om de kop te verwijderen.Verwijder het abdomen en het thorax. Het is cruciaal om de kop in de PTN te houden tijdens deze stap. Verbindingen van het centrale brein naar het VNC kunnen duidelijk niet met deze methode worden geanalyseerd.Pak vervolgens de mediale rand van het linkerretina vast bij de rand van het centrale gat in de cuticula en trek de pincetten langzaam recht van elkaar af om scheuring van de optic lobe te voorkomen, wat de ondoorzichtige structuur is die bedekt is met witte, draderige trachea. Terwijl het retina loslaat, zal de spanning enigszins afnemen. Om te voorkomen dat het brein scheurt, is het van cruciaal belang om de mediale rand van elk oog vast te pakken en de pincetten zeer langzaam uit elkaar te trekken.Te snel bewegen kan leiden tot een veranderde hersenmorfologie of beschadiging van het hersenweefsel. Zoals hier wordt getoond, pakt u de cuticula vast met elk paar pincetten en trekt u deze zeer langzaam in tegenovergestelde richtingen uit elkaar. Als dit correct wordt uitgevoerd, moet de cuticula loskomen van het hersenweefsel, waardoor de hersenen intact blijven.Voor deze stap zijn zeer scherpe pincetten nodig. Verwijder vervolgens voorzichtig de omringende cuticula stukje voor stukje. Bij het verwijderen van hardnekkig vastzittende cuticula kan het helpen om de hersenen te fixeren door het resterende VNC vast te pakken om te voorkomen dat de hersenen worden geplet.Gebruik tot slot een P200-pipet om de gedissecteerde hersenen over te brengen naar een well van een plaat gevuld met PTN voor fixatie en immunokleuring. Gebruik onder de microscoop een P200-pipet om 10 tot 15 gedissecteerde hersenen van hetzelfde genotype over te brengen naar een microcentrifugebuisje van 0,5 milliliter gevuld met 4%paraformaldehyde verdund in PTN. Incubeer de hersenen vervolgens gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met langzame schudbewegingen.Laat de hersenen na de fixatie naar de bodem van de buis zakken en verwijder vervolgens het fixatief. Voer daarna twee korte wasbeurten uit met 500 µL PTN per wasbeurt. Vervang de PTN zodra de hersenen in de buis zijn gezakt.Voer vervolgens drie lange wasbeurten uit met PTN onder zachte agitatie bij kamertemperatuur. Na deze wasbeurten kunnen de hersenen gedurende de nacht bij 4 °C in PTN worden bewaard. Na het verwijderen van de laatste PTN-wasbeurt worden de hersenen gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur en onder zachte agitatie geïncubeerd in 0,5 milliliters blokkeeroplossing.Verwijder de blokkeringsoplossing, voeg de primaire antilichamen toe die zijn verdund in blokkeringsoplossing, en incubeer de hersenen twee dagen bij vier graden Celsius onder lichte agitatie. Verwijder het primaire antilichaam met het PTN-wasregime van vijf wasbeurten. Breng vervolgens de secundaire antilichamen aan.Laat deze antilichamen drie uur bij kamertemperatuur incuberen met de weefsels, terwijl ze worden afgeschermd van licht en worden geschud. Pas na incubatie van de hersenen in de secundaire antilichaamoplossing het PTN-wasregime toe. Dek de monsters na elke wasbeurt af met folie en sluit af door zoveel mogelijk buffer te verwijderen.Voeg vervolgens 75 µL fluorescent anti-fade monteermedium toe en spoel de hersenen en het medium slechts één keer in en uit de pipetpunt. De buis kan daarna in folie worden gewikkeld en enkele dagen bij 4 °C worden bewaard, maar bij voorkeur gaat u direct over tot het monteren. Om de hersenen te monteren, maakt u een brugobjectglas.Plaats twee dekglasplaatjes met een tussenruimte van ongeveer 1 centimeter op een positief geladen objectglas. Zorg ervoor dat de positief geladen zijde naar boven is gericht. Bevestig vervolgens de dekglasplaatjes aan het objectglas met nagellak en laat de lak volledig drogen voordat u verdergaat.Plaats vervolgens het objectglas onder een stereomicroscoop en pipetteer de hersenen en het medium in de ruimte tussen de dekglasjes. Zorg ervoor dat de verlichting wordt aangepast om de visualisatie van de hersenen te verbeteren. Aspireer daarna het overtollige montagemedium van het objectglas, waarbij u er voorzichtig op let dat u de hersenen vermijdt.Zuig vervolgens het resterende overtollige montage medium weg. Hierdoor kunnen de hersenen nauwkeuriger worden gepositioneerd. Richt de hersenen nu met een pincet in een rasterpatroon, met de antennalobes naar boven gericht.Plaats vervolgens een dekglas over de hersenen en gebruik nagellak om de randen van het bovenste dekglas die vastzitten aan de onderste dekglazen af te dichten. Vul nu de centrale holte druppelsgewijs met vers montage medium, zodat het medium door capillaire werking onder het dekglas wordt getrokken. Wanneer de holte gevuld is, wordt deze volledig afgesloten met transparante nagellak.De beschreven methode kan worden gebruikt om vrijwel elke structuur in het volwassen brein te visualiseren, inclusief de mushroom bodies. Dit hersengebied is noodzakelijk voor leren en geheugen. De mushroom bodies kunnen eenvoudig worden gevisualiseerd met behulp van antilichamen die het fasciculin 2-eiwit herkennen.Dit eiwit komt sterk tot expressie in de alfa- en betalobben, evenals in het centraal gelegen ellipsoïde lichaam. Deze techniek heeft de identificatie mogelijk gemaakt van meerdere cellulaire processen die nodig zijn voor de correcte axonale geleiding van neuronen in het mushroom body. Verstoring van deze processen veroorzaakt een diverse reeks mutante fenotypen, zoals onjuiste axonale projectie over de midline-regio van de hersenen en het ontbreken van alfalobben.Deze mutante fenotypes zijn vaak onvolledig penetrant en vereisen daarom het onderzoek van meerdere hersenen. Om de autonome rol van een eiwit bij axonale padvinding te onderzoeken, kan de Markham-techniek ook worden gebruikt om axonale sturingsbeslissingen van individuele GFP-positieve mutante of wild-type neuronen in een niet-fluorescerende wild-type achtergrond te visualiseren. De hier beschreven methode maakt een betrouwbare en reproduceerbare visualisatie van vrijwel elke regio van de volwassen Drosophila-hersenen mogelijk.Hier hebben we ons gericht op de neuronen van het mushroom body. In de tekstversie van dit protocol hebben we ook de visualisatie van de optische lobben gedemonstreerd. Andere studies hebben vergelijkbare technieken gebruikt om onder andere de pars intercerebralis, klokneuronen en projectieneuronen van de antennalobus te visualiseren.Zodra de techniek onder de knie is, kan elk brein in 3 tot 5 minuten worden gedisseceerd, mits dit correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om uw armen nabij de microscoop te stabiliseren. Het is daarnaast van belang om langzaam te werken en kleine stukjes cuticula één voor één te verwijderen.Te snelle bewegingen kunnen ongewenste schade aan het onderliggende hersenweefsel veroorzaken. Naast het gebruik van gedissecteerde hersenen voor microscopie-experimenten op basis van immunofluorescentie, kan het hersenweefsel ook worden gebruikt voor aanvullende experimenten.

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In dit artikel zullen we laten zien hoe het centrale zenuwstelsel ontleden uit derde instar Drosophila larven.

Dissectie van larvale CNS in Drosophila melanogaster

De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

Deze video beschrijft een methode om intacte hersenen van volwassen vliegen onder een brugschuif te monteren en toont het protocol dat wordt uitgevoerd op immunostained hersenen voor fluorescerende microscopie.

Volwassen Drosophila-hersenen monteren: een methode om dia's voor confocale beeldvorming voor te bereiden

Deze video beschrijft hoe de volwassen Drosophila-hersenen kunnen worden ontleed en geïsoleerd - een procedure die nodig is voor het visualiseren van het orgaan, dat anders wordt verduisterd door de cuticula, het oog en het tracheaweefsel. Het voorbeeldprotocol toont een gedetailleerde demonstratie die hoogwaardige preparaten oplevert die kunnen worden gebruikt voor immunostaining- en beeldvormingsmethoden in de drosophila-neurobiologie.

Drosophila Volwassen hersendissectie: een methode in vliegneurobiologie

This video demonstrates a detailed immunostaining protocol to visualize phenotypic defects in the mushroom bodies of mutant Drosophila brains. The protocol involves using antibodies against Fas2, a protein involved in axonal guidance that facilitates the proper morphological and functional development of the mushroom body.

Visualizing Mushroom Body Neurons in Drosophila Brains via Immunostaining

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels<em&gt; In Situ</em

De volwassen structuren van Drosophila zijn afgeleid van zak-achtige structuren die imaginale schijven worden genoemd. Analyse van deze schijven biedt inzicht in vele ontwikkelingsprocessen, waaronder weefselbepaling, oprichting van compartimentgrenzen, celproliferatie, celbestemmingsspecificatie en cellulaire planaire polariteit. Dit protocol wordt gebruikt om imaginale schijven voor te bereiden op licht-/fluorescentiemicroscopie.

Dissectie en Immunokleuring van Imaginal schijven uit Drosophila melanogaster

De volwassen Drosophila hersenen waardevol voor de studie van neuronale circuits, hogere hersenfuncties, en complexe aandoeningen. Een efficiënte methode om hele hersenweefsel van de kleine vlieg hoofd ontleden zal brain-based studies vergemakkelijken. Hier beschrijven we een eenvoudige, een-stap dissectie protocol van volwassen hersenen met goed bewaard gebleven morfologie.

Een eenvoudige één stap Dissection protocol voor Whole-mount voorbereiding van Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

Hier bieden we protocollen om drie eenvoudige door verwondingen veroorzaakte axondegeneratie (axondood) tests in Drosophila melanogaster uit te voeren om het morfologische en functionele behoud van afgehakte axonen en hun synapsen te evalueren.

Morfologische en functionele evaluatie van Axons en hun Synapsen tijdens Axon Death in Drosophila melanogaster

Dit protocol beschrijft drie stappen om larvale en volwassen Drosophila optische kwabben voor te bereiden op beeldvorming: 1) hersendissecties, 2) immunohistochemie en 3) montage. De nadruk wordt gelegd op stap 3, omdat er verschillende montagerichtingen nodig zijn om specifieke optische lobstructuren te visualiseren.

Dissectie, immunohistochemie en montage van larvale en volwassen Drosophila-hersenen voor visualisatie van optische kwabben

Deze studie presenteert een vereenvoudigd protocol voor weefselverwerking met onthoofding, fixatie, cryosectie, fluorescentiekleuring, immunokleuring en beeldvorming, dat kan worden uitgebreid tot confocale en multifotonbeeldvorming. De methode behoudt een werkzaamheid die vergelijkbaar is met complexe dissecties, waarbij de noodzaak van geavanceerde motorische vaardigheden wordt omzeild. Kwantitatieve beeldanalyse biedt een uitgebreid onderzoekspotentieel.

Directe cryosectie van Drosophila-koppen voor verbeterde kleuring en immunokleuring van de hersenen

Leer dissectie en immunefluorescentie van volwassen Drosophila melanogaster hersenen om neuronale ontwikkeling en connectiviteit te bestuderen. Deze methode maakt visualisatie van mushroom body en fotoreceptor neuronen mogelijk.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Meer video's verkennen