Stroom Cytometry gebaseerde Drug Screening systeem voor de identificatie van kleine moleculen die bevordering van celdifferentiatie van Glioblastoma stamcellen
10 januari 2018
Een efficiënte screening-protocol wordt gepresenteerd voor de identificatie van kleine moleculen ter bevordering van astroglial differentiatie in glioblastoma stamcellen (GSCs). De bepaling is gebaseerd op een stamcel differentiatie verslaggever waarbij de expressie van de verbeterde GFP (eGFP) wordt gedreven door de menselijke promotor van het algemeen kaderakkoord voor vrede.
Het algemene doel van deze procedure is om kleine molecuulbibliotheken te screenen op agentia die astrogliale differentiatie in glioblastoma-stamcellen bevorderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van kankerstamcellen, zoals wat de signaalroutes zijn die nodig zijn om glioblastoma-stamcellen in de ongedifferentieerde toestand te behouden. Juiste uitvoering van deze techniek maakt de eenvoudige identificatie mogelijk van kleine moleculen die de differentiatie van glioblastoma-stamcellen bevorderen.
De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot therapie voor Ehlers-Danlos glioblastoma omdat het verminderen van het percentage glioblastoma-stamcellen de kans op recidief kan verminderen. Deze methode kan ook worden toegepast om differentiatie in andere cellijnen te initiëren met behulp van andere reporterconstructen. Ons rapport is de eerste die een high-throughput benadering vestigt om te screenen op agentia die glioma-stamcellen dwingen te differentiëren.
Het werken met lentivirusdeeltjes in kankercellen afkomstig van patiënten kan uiterst gevaarlijk zijn. Daarom moeten altijd de standaardprocedures voor het werken met bloeddragende pathogenen worden gevolgd. Om te beginnen, zaai één miljoen glioblastoma-stamcellen of GSC's in twee milliliters volledig neurale stamcelgroeimedium in een zes-putsplaat.
Transduceer vervolgens de cellen met de lentivirusreporter bij een infectiemultipliciteit gelijk aan vijf. Voeg aan het cel- en virusmengsel twee microliters polybren toe zodat de eindconcentratie acht microgram per milliliter is, en incubeer de cellen overnacht bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Na incubatie, vervang het groeimedium om ongebonden virus te verwijderen.
En centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 360 keer G. Aspiraat vervolgens voorzichtig het medium en plateer de cellen terug in een zes-putsplaat. En blijf de cellen gedurende 24 uur incuberen.
Verzamel 0,5 milliliter van het totale kweekvolume. Pellet cellen door centrifugatie bij 360 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer cellen in 0,5 milliliter vers neurale stamcelgroeimedium.
Plaats de plaat terug in de incubator om uitbreiding gedurende ten minste 72 uur mogelijk te maken. Voeg 200 microliters dissociatiereagens toe en incubeer gedurende vijf minuten in een waterbad ingesteld op 37 graden Celsius. Dissocieer cellen door voorzichtig op en neer te pipetten.
Voeg aan de gedissocieerde cellen 800 microliters HBSS toe om minimale celadhesie of aggregatie te garanderen. Transfer vervolgens 200 microliters van elke celsuspensie naar de putjes van een 96-multiputsplaat. Bepaal het percentage cellen dat het groen fluorescente eiwit tot expressie brengt door middel van flowcytometrie.
Neem minimaal 10.000 levensvatbare cellen op in elke acquisitie. Gebruik bij alle flowcytometrische analyses ouderlijke niet-getransduceerde cellen of vector-getransduceerde niet-fluorescente cellen om de baseline fluorescentie vast te stellen. Om individuele subklonen te selecteren en uit te breiden, zaai cellen met een dichtheid van 0,7 cellen per put in 100 microliters neurale stamcelmedium in een 96-putsplaat.
Bewaar deze klonen gedurende 11 dagen in cultuur. Let op neurosferen met een diameter groter dan 100 micron. We hebben eerder deze grenswaarde vastgesteld om retrospectief te bepalen of de neurosfeer afkomstig was van een zelfvernieuwende glioblastoma-stamcel.
Deze grenswaarde kan optimalisatie vereisen bij het werken met verschillende glioblastoma-celmodellen. Observeer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een FITC-filter en markeer putjes die een enkele neurosfeer bevatten waarin ongeveer 1% tot 5% van de cellen GFP-positief is. Na het markeren, breidt u individuele klonen uit totdat er voldoende cellen beschikbaar zijn voor flowcytometrieanalyse.
Ervan uitgaande dat de reporterklonen 1% tot 5% GFP-positieve cellen bevatten, verzamel 0,5 milliliter van elke kloon samen met een gelijke hoeveelheid niet-getransduceerde controlecellen om het exacte percentage GFP-positieve cellen te bepalen. Na pelleting van cellen bij 360 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, aspireer het supernatant. Voeg 200 microliters dissociatiereagens toe aan elk pellet en incubeer de buisjes in een waterbad ingesteld op 37 graden Celsius.
Na incubatie, tritureer de cellen ongeveer 20 tot 30 keer om een enkele celsuspensie te verkrijgen. Voeg vervolgens 800 microliters HBSS toe om minimale celadhesie of aggregatie te garanderen. Transfer nu 200 microliters van elke celsuspensie naar de putjes van een 96-multiputsplaat.
Voer tenslotte flowcytometrie uit en neem minimaal 10.000 levensvatbare cellen op in elke acquisitie. Om de klonogene capaciteit te beoordelen, bereid enkele celsuspensies van differentiatiereportersubklonen voor door de cellen ongeveer 20 tot 30 keer te tritureren. Plateer vervolgens deze cellen in 100 microliters compleet neurale stamcelgroeimedium met een dichtheid van ongeveer vijf tot 500 cellen per put in 96-multiputsplaten.
Bewaar deze cellen gedurende negen tot 11 dagen in cultuur. Zoek naar neurosferen onder een lichtmicroscoop. Een put die ten minste één enkele grote neurosfeer bevat, wordt als positief beschouwd.
Gezien ouderlijke niet-getransduceerde cellen en GFP-positieve lentivirus-getransduceerde cellen als controles, voer de totaal geanalyseerde putten en het aantal positieve cellen in op de ELDA online interface. Om met screening te beginnen, plateer 5000 cellen in 99 microliters compleet neurale stamcelgroeimedium in een 96-putsplaat. Behandel vervolgens de cellen met een 12-kanaals pipetteerder met een eindconcentratie van twee micromolar verdunde bibliotheekverbindingen of met de DMSO-controle.
Incubeer de cellen gedurende 72 uur. Voeg nu 150 microliters celdissociatiereagens toe met behulp van een 12-kanaals pipetteerder in elke put en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 20 minuten. Tritureer vervolgens de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een screeningprotocol voor het identificeren van kleine moleculen die astrogliale differentiatie bevorderen in glioblastoom stamcellen (GSCs). De methode maakt gebruik van een stamceldifferentiatie reporter, waarbij de expressie van verbeterde GFP (eGFP) wordt aangestuurd door de humane GFAP promotor.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Kankerbiologie
- Stamcellenonderzoek
Achtergrond
- Glioblastoom stamcellen (GSCs) zijn cruciaal voor het begrijpen van glioblastoom recidief.
- Het identificeren van routes die GSCs in een ongedifferentieerde toestand houden is essentieel.
- Astrogliale differentiatie kan GSC populaties verminderen.
- Deze studie introduceert een high-throughput screening methode voor differentiatie agentia.
Doel van Studie
- Om kleine molecuulbibliotheken te screenen op agentia die astrogliale differentiatie in GSCs bevorderen.
- Om signaalroutes te onderzoeken die betrokken zijn bij GSC onderhoud.
- Om een methode te bieden die toepasbaar is op andere cel lijnen met verschillende reporter constructies.
Gebruikte Methoden
- High-throughput screening van kleine molecuulbibliotheken.
- Gebruik van een stamceldifferentiatie reporter systeem.
- Beoordeling van eGFP expressie aangestuurd door de humane GFAP promotor.
- Analyse van differentiatie effecten op glioblastoom stamcellen.
Belangrijkste Resultaten
- Identificatie van kleine moleculen die effectief astrogliale differentiatie bevorderen.
- Inzichten in de signaalroutes die noodzakelijk zijn voor GSC onderhoud.
- Mogelijke therapeutische implicaties voor het verminderen van glioblastoom recidief.
- Totstandbrenging van een nieuwe high-throughput screening aanpak.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is effectief voor het screenen van differentiatie-bevorderende agentia.
- Bevindingen kunnen bijdragen aan therapeutische strategieën tegen glioblastoom.
- Deze methode kan worden aangepast voor andere differentiatie studies.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This flow cytometry-based screening system enables biopharma R&D to identify small molecules that promote differentiation of glioblastoma stem cells, addressing a key mechanism of tumor recurrence. By quantifying astroglial differentiation via GFAP:GFP reporter expression, the platform provides predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for oncology pipelines. The approach supports lead identification and portfolio triage through scalable, reproducible assays compatible with FDA-approved drug library screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking small molecule treatment to astroglial differentiation in patient-derived GSCs.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative flow cytometry readouts of GFP-positive cells.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying compounds that reduce stemness and self-renewal capacity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a high-throughput flow cytometry platform for screening compound libraries with Z'-factor compatible metrics.
- Quantitative Output: Measures percentage of GFP-positive cells as a direct readout of differentiation efficacy.
- Scalability: Compatible with 96-well format and 12-channel pipetting for screening thousands of compounds.
- Reporter Flexibility: GFAP:GFP construct can be substituted with other lineage-specific promoters for broad target validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models human glioblastoma stem cell biology using patient-derived neurospheres.
- Translational Continuity: Differentiation phenotype aligns with astroglial maturation, a clinically relevant endpoint.
- Preclinical De-risking: Identifies compounds that reduce clonogenic potential, informing go/no-go decisions.
- Biomarker Alignment: GFAP expression serves as a translational biomarker for astroglial commitment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows following target identification and preceding lead optimization, enabling phenotypic screening of differentiation-inducing agents in a disease-relevant system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of signaling pathways governing GSC maintenance via small molecule perturbation.
- Screening: Delivers assay standardization and reproducibility through flow cytometry gating and viability controls.
- Analytics: Enables quantitative comparison of compound effects using GFP-positive cell percentages and statistical hit calling (3 SD over control).
- Translational Research: Connects to preclinical validation by identifying agents that reduce tumorigenic potential in stem cell-enriched populations.
- Enterprise Reuse: Platform is adaptable to other cancer stem cell models and differentiation endpoints via reporter exchange.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into differentiation pathways and reduces ambiguity in stem cell-targeted mechanisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized transduction, selection, and flow cytometry protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by prioritizing compounds with differentiation activity over cytotoxic effects alone.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying differentiation inducers that may synergize with standard-of-care therapies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral transduction, flow cytometry, and neural stem cell culture.
- Dependent on flow cytometer with FITC detection and 96-well plate automation compatibility.
- Necessitates standardization of reporter validation and clonogenic assays across cell lines.
- Adaptation to other models may require optimization of neurosphere size cutoffs and differentiation thresholds.
- Practical limitations include variability in primary GSC cultures and need for careful viability gating.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:17
Generation of Lentiviral Transcriptional Reporter Cell Lines
3:47
Subclone Selection, Expansion, and Validation
4:47
Determination of GFAP:GFP Expression by Flow Cytometry
5:58
ELDA Self-renewal Assay to Assess Clonogenic Capacity
7:01
Drug Screen
8:27
Results: Selection and Drug Screening of Glioblastoma Stem Cell Subclones
9:46
Conclusion
