Stroom Cytometry gebaseerde Drug Screening systeem voor de identificatie van kleine moleculen die bevordering van celdifferentiatie van Glioblastoma stamcellen

Het algemene doel van deze procedure is het screenen van bibliotheken met kleine moleculen op zoek naar agentia die astrogliale differentiatie in glioblastoomstamcellen bevorderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van kankerstamcellen, zoals welke signaleringspaden vereist zijn om glioblastoomstamcellen in de ongedifferentieerde staat te houden. Een correcte uitvoering van deze techniek maakt de eenvoudige identificatie mogelijk van kleine moleculen die de differentiatie van glioblastoomstamcellen bevorderen.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie voor glioblastoom bij het syndroom van Ehlers-Danlos, omdat het verminderen van het percentage glioblastoomstamcellen de kans op recidief kan verkleinen. Deze methode kan ook worden toegepast om differentiatie naar andere cellijnen in gang te zetten met behulp van andere reporterconstructen. Ons verslag is het eerste dat een high-throughputbenadering vaststelt om te screenen op middelen die glioma-stamcellen dwingen tot differentiatie.

Het werken met lentivirale deeltjes in kankercellen afkomstig van patiënten kan uiterst gevaarlijk zijn. Daarom moet de standaardprocedure voor het werken met bloedoverdraagbare pathogenen altijd worden gevolgd. Begin met het uitplaten van één miljoen glioblastoomstamcellen of GSC's in twee milliliters volledig neuraal stamcelgroeimedium in een six-well plaat.

Transduceer vervolgens de cellen met de lentivirale reporter bij een multiplicity of infection gelijk aan vijf. Voeg twee microliters polybrene toe aan het mengsel van cellen en virus, zodanig dat de uiteindelijke concentratie acht micrograms per milliliter is, en incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 degrees Celsius en 5%CO2. Vervang na incubatie het groeimedium om ongebonden virus te verwijderen.

Centrifugeer de cellen vervolgens 5 minuten bij 360 ×g. Aspireer daarna voorzichtig het medium en zaai de cellen opnieuw uit in een six-well plaat. Incubeer de cellen vervolgens nog 24 uur.

Oogst 0,5 milliliters van het totale cultuurvolume. Pelleteer de cellen door centrifugatie bij 360 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen in 0,5 milliliters vers groeimedium voor neurale stamcellen.

Plaats de plaat terug in de incubator om uitbreiding gedurende ten minste 72 uur mogelijk te maken. Voeg 200 µL dissociatiereagens toe en incubeer vijf minuten in een waterbad ingesteld op 37 °C. Dissocieer de cellen door voorzichtig op en neer te pipetteren.

Voeg 800 microliters HBSS toe aan de gedissocieerde cellen om minimale celhechting of aggregatie te waarborgen. Draag vervolgens 200 microliters van elke celsuspensie over naar de putjes van een 96-wells plaat. Bepaal het percentage cellen dat het groen fluorescerende eiwit tot expressie brengt via flowcytometrie.

Registreer ten minste 10.000 levensvatbare cellen per acquisitie. Gebruik bij alle flowcytometrische analyses ouderlijke niet-getransduceerde cellen of vector-getransduceerde niet-fluorescerende cellen om de basisfluorescentie vast te stellen. Om individuele subclonen te selecteren en te expanderen, worden cellen gezaaid met een dichtheid van 0,7 cellen per putje in 100 µL neuraal stamcelmedium in een 96-well plaat.

Houd deze klonen 11 dagen in cultuur. Let op neurosferen met een diameter groter dan 100 microns. Wij hebben deze afkapwaarde eerder vastgesteld om retrospectief te bepalen of de neurosfeer is ontstaan uit een zelfvernieuwende glioblastoomstamcel.

Deze afsnijwaarde moet mogelijk worden geoptimaliseerd bij het werken met verschillende glioblastoomcelmodellen. Observeer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een FITC-filter en markeer de wells die een enkele neurosfeer bevatten waarin ongeveer 1% tot 5% van de cellen GFP-positief is. Breid na het markeren de individuele klonen uit totdat er een voldoende aantal cellen beschikbaar is voor flowcytometrie-analyse.

Uitgaande van het feit dat de reporterklonen 1% tot 5% GFP-positieve cellen bevatten, oogst dan 0,5 milliliters van elke kloon samen met een gelijke hoeveelheid niet-getransduceerde controlecellen om het exacte percentage GFP-positieve cellen te bepalen. Nadat de cellen zijn gecentrifugeerd bij 360 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, wordt het supernatant afgezogen. Voeg 200 microliters dissociatiereagens toe aan elk pellet en incubeer de buisjes in een waterbad ingesteld op 37 °C.

Tritureer de cellen na incubatie ongeveer 20 tot 30 keer om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen. Voeg vervolgens 800 µL HBSS toe om minimale celhechting of aggregatie te waarborgen. Breng nu 200 µL van elke celsuspensie over naar de putjes van een 96-wells plaat.

Voer ten slotte flowcytometrie uit, waarbij ten minste 10, 000 levensvatbare cellen per acquisitie worden geregistreerd. Om de clonogene capaciteit te beoordelen, worden enkelcel-suspensies van differentiatie-reporter-subklonen bereid door de cellen ongeveer 20 tot 30 keer te tritureren. Zaai deze cellen vervolgens uit in 100 µL volledig neuraal stamcelgroeimedium met een dichtheid van ongeveer vijf tot 500 cellen per putje in 96-wells platen.

Houd deze cellen negen tot 11 dagen in cultuur. Zoek met een lichtmicroscoop naar neurosferen. Een putje met minstens één enkele grote neurosfeer wordt als positief beschouwd.

Voer het totaal aantal geanalyseerde putjes en het aantal positieve cellen in op de ELDA online interface, waarbij de ouderlijke niet-getransduceerde cellen en GFP-positieve lentivirus-getransduceerde cellen als controles dienen. Om met de screening te beginnen, plaatst u 5000 cellen in 99 µL volledig neuraal stamcelgroeimedium in een 96-well plaat. Behandel de cellen vervolgens met een 12-kanaals pipet met een eindconcentratie van 2 µM van de verdunde bibliotheekverbindingen of met de DMSO-controle.

Incubeer de cellen gedurende 72 uur. Voeg nu met een 12-kanaals pipet 150 µL cel-dissociatie-reagens toe aan elke well en incubeer dit gedurende 20 minuten bij 37 °C. Tritureer vervolgens de cellen in elke well voorzichtig ongeveer 20 tot 30 keer met een 12-kanaals pipet totdat een enkelcellige suspensie is verkregen.

Voer nu flowcytometrie uit en bepaal het percentage cellen dat de GFAP:GFP-reporter tot expressie brengt. Bepaal eerst de celgrootte en levensvatbaarheid aan de hand van de forward- en side-scatter en gate de populatie levensvatbare cellen. Bepaal vervolgens de GFP-positieve cellen binnen de populatie levensvatbare cellen.

Een toename van het percentage GFP-positieve cellen met drie standaarddeviaties ten opzichte van de controles wordt beschouwd als een positieve hit, wat kan worden aangepast op basis van de door de gebruiker gewenste strengheid. Representatieve afbeeldingen van HSR-GBM1 GSC-subklonen die lage en hoge niveaus van GFAP:GFP tot expressie brengen, worden getoond. De subklonen die positief waren voor GFAP:GFP-expressie werden geselecteerd via flowcytometrie voor de patiëntafgeleide neurosfeerlijn.

Hier geeft een lage GFAP:GFP-waarde aan dat minder dan 5% van de cellen in de kloon GFP-positief is, terwijl een hoge GFAP:GFP-waarde aangeeft dat meer dan 75% van de cellen in de kloon GFP-positief is. Deze resultaten tonen aan dat het in vitro zelfvernieuwingsvermogen van GFAP-lage subclonen hoger is dan dat van hun GFAP-hoge tegenhangers, zoals vastgesteld via ELDA. Bijgevolg zijn GH-subclonen meer gedifferentieerd dan GL-subclonen.

Ten slotte werden drug-bibliotheken gescreend om stoffen te identificeren die in staat zijn astrogliale differentiatie in GSC's te induceren. Er werden 12 geneesmiddelen gevonden die het percentage cellen dat de GFAP:GFP-reporter tot expressie brachten, significant verhoogden. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in enkele weken worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals de alamarBlue-assay, de clonogene assay in semisolide media en flank- of intracraniële xenograft-injectie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het effect van selectieve geneesmiddelen op de cellulaire proliferatie en clonogeniteit in vitro en de tumorigeniciteit in vivo. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u verbindingen kunt identificeren die in staat zijn om astrogliale differentiatie in glioblastoomstamcellen te induceren.