Toepassing van MultiColor FlpOut techniek om hoge resolutie eencellige Morphologies en cel interacties van Glia in Drosophila te studeren
October 20th, 2017
Cellen weergeven van verschillende morphologies en stellen een verscheidenheid van interacties met hun buren. Dit protocol wordt beschreven hoe te onthullen van de morfologie van afzonderlijke cellen en cel-cel interactie onderzoeken met behulp van de gevestigde Gal4/UAS expressie systeem.
Het algemene doel van deze techniek is om de morfologie van afzonderlijke cellen in complexe anatomische weefsels te visualiseren, waardoor het onderzoek naar cel-cel interactie in Drosophila wordt vereenvoudigd. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over complexe morfologieën en cel-cel interacties met behulp van de fruitvlieg. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden aangepast aan het onderzoek naar de morfologie van afzonderlijke cellen in elk weefsel en in elk ontwikkelingsstadium.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Anja Kieser, een technicus in ons laboratorium. De MCFO-techniek wijzigt de standaard FlpOut-techniek als volgt. Een hitteschok FLP recombinase en verschillende reporters blijven onder UAS-controle, maar elke reporter heeft een gemeenschappelijke ruggengraat van een myristoylerde superfolder GFP, waarin kopieën van een epitoop tag zijn ingezet.
De resulterende niet-fluorescente eiwitten worden spaghetti monster GFP's genoemd en worden geïdentificeerd met antilichamen. Afhankelijk van het aantal excisies, wordt een andere combinatie van epitopen tot expressie gebracht. Omdat de HSP-promotor op 25 graden Celsius lichtjes actief is, moet u kruisen bij 18 graden Celsius waar het echt inactief is.
Wacht vervolgens ongeveer 20 dagen om de F1-generatie te verkrijgen. Sorteer de F1-vrouwtjes en mannetjes in afzonderlijke flesjes. Om ze te hitteschok, breng ze eerst over naar verse voedselflesjes wanneer ze drie tot vier dagen oud zijn.
Jongere vliegen kunnen te delicaat zijn voor hitteschok. Breng vervolgens de flesjes over in een waterbad van 37 graden Celsius. Dompel ze diep onder om een homogene hitteschok te garanderen.
Voor schaarse markering van gliacellen, begint u met vijf tot acht minuten hitteschok en optimaliseert u vervolgens. De optimale hitteschoktijd zal de doelcellen schaars markeren en de relatie ervan hangt af van de specifieke GAL4-driver die wordt gebruikt. Na de hitteschok, legt u de flesjes enkele minuten horizontaal op de werkbank om ze af te koelen.
Begin nu de vliegen te onderhouden bij 25 graden Celsius in dezelfde flesjes. Na twee dagen zal de reporterexpressie optimaal zijn en kunnen de vliegen worden gedissecteerd. Bereid u voor door drie diepe deuken op ijs te plaatsen.
Vul één deuk met 70%ethanol, één met PBS en één met S2-celkweekmedium. Laad vervolgens een drie centimeter dissectieschaal bekleed met zwart siliconen met koud S2. Voer de volledige dissecties uit in S2 om de weefsels gezond te houden. Verdoof nu de vliegen met koolstofdioxide.
Plaats vervolgens de vliegen met behulp van een pincet of een veer in koud 70%ethanol gedurende ongeveer 30 seconden gevolgd door koud PBS gedurende ongeveer 30 seconden en breng ze vervolgens over in koud S2. Was dus alle vliegen die worden gedissecteerd. Tot 10 vliegen van één genotype is meestal voldoende. Dissect nu binnen 30 minuten alle hersenen uit.
Los eerst het hoofd los van de rest van het lichaam en gooi het lichaam weg. Houd het hoofd met de vrije hand vast tijdens de volledige dissectie, anders zal het erg moeilijk zijn om het weer vast te pakken. Trek vervolgens één oog uit door het weefsel net onder de retina vast te grijpen.
Trek vervolgens het andere oog eraf en ontbloot zodoende de hersenen en omliggende weefsels. Verwijder vervolgens al het tracheavlies en overblijvende cuticula rond de hersenen, totdat het hersenweefsel er schoon uitziet. Al het tracheavlies moet worden verwijderd voor optimale kleuringsresultaten.
Dit is alles wat nodig is om de hersenen voor te bereiden op fixatie. Ga verder met het dissecteren van alle hersenen, terwijl de gedissecteerde hersenen in koud S2 worden gehouden. Probeer voor optimale kleuring tot 10 hersenen per microcentrifugebuisje voor te bereiden. Breng de geïsoleerde hersenen over met behulp van een P10 pipettentip in een microcentrifugebuisje van 200 microliter met fixeeroplossing.
Gebruik nooit pincetten om de hersenen te hanteren. Incubeer de weefsels beschermd tegen licht. Vermijd het aspireren van de hersenen tijdens oplossingsoverdracht.
Gebruik drie of meer wasbeurten van 15 minuten met wasoplossing om de fixeermiddelen te verwijderen. Blokkeer vervolgens de weefsels met blokkeringsoplossing gedurende 30 minuten of langer. Vervang vervolgens de blokkeringsoplossing door primaire antilichamen verdund in wasoplossing en incubeer de hersenen een nacht bij vier graden Celsius.
Gebruik drie wasbeurten van één uur in wasoplossing om de primaire antilichamen te verwijderen. Voeg vervolgens secundaire fluorfosfor geconjugeerde antilichamen toe in wasoplossing en incubeer de hersenen een nacht bij vier graden Celsius of gedurende vier uur bij kamertemperatuur. Gebruik drie wasbeurten van één uur in wasoplossing gevolgd door een langere wasbeurt met PBS om de ongebonden antilichamen volledig te verwijderen.
Monteer vervolgens de hersenen. Bereid twee dekglasjes met een beeldvormingsruimte voor. Breng op de ruimte en op het extra dekglasje 10 microliter montagemedium met een anti-fade middel aan.
Breng vervolgens de hersenen over met behulp van een P10 pipettentip naar het dekglasje, en plaats ze naast het medium samen met wat PBS. Laat het weefsel niet uitdrogen. Verplaats nu voorzichtig de hersenen in het montagemedium met behulp van de pipetten en verplaats ze uiteindelijk naar het medium in de ruimte en rangschik ze met pincetten.
Verwijder vervolgens de zelfklevende voering op de ruimtes en bevestig een dekglasje. Zet het dekglasje vast met een beetje druk met behulp van pincetten en ga direct door met beeldvorming of bewaar de preparaten bij min 20 graden Celsius voor latere analyse. Met behulp van de beschreven methoden worden drie verschillende membraan getagde reporters stil gehouden door transcriptionele terminatoren omringd door FRT-sites.
Toen de dieren werden hitteschokken, werd de FLP-recombinase geëxpresseerd en verwijderde deze willekeurig de terminatoren, wat leidde tot de expressie van verschillende combinaties van reporters. Over het al
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om morfologieën van enkele cellen te visualiseren en cel-cel interacties in Drosophila te onderzoeken met behulp van het Gal4/UAS expressiesysteem. De techniek vereenvoudigt het onderzoek naar complexe anatomische weefsels en kan worden aangepast voor verschillende weefsels en ontwikkelingsstadia.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Cellen vertonen diverse morfologieën en interacties.
- Het begrijpen van deze interacties is cruciaal voor ontwikkelingsbiologie.
- Het Gal4/UAS systeem is een veelzijdig hulpmiddel voor genexpressiestudies.
- Drosophila dient als een effectief modelorganisme voor dergelijke studies.
Doel van het onderzoek
- Om morfologieën van enkele cellen in complexe weefsels te visualiseren.
- Om cel-cel interacties in een ontwikkelingscontext te onderzoeken.
- Om de methode aan te passen voor verschillende weefsels en stadia.
Gebruikte methoden
- MCFO techniek wijzigt de FlpOut techniek.
- Maakt gebruik van heat shock FLP recombinase en UAS-gecontroleerde reporters.
- Gebruikt myristoyleerd superfolder GFP met epitope tags.
- Gedemonstreerd door een laboratoriumtechnicus.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van morfologieën van enkele cellen.
- Verbeterd begrip van cel-cel interacties.
- Aanpasbaarheid van de techniek voor verschillende weefsels.
- Mogelijkheid voor toepassing in verschillende ontwikkelingsstadia.
Conclusies
- De methode biedt inzicht in complexe cellulaire interacties.
- Het kan breed worden toegepast in ontwikkelingsbiologie onderzoek.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek gebruiken voor een dieper begrip.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding glial cell morphology and interaction patterns in vivo is critical for de-risking neurobiological target hypotheses and informing preclinical model selection. The MultiColor FlpOut (MCFO) technique enables high-resolution single-cell labeling in complex tissues, supporting mechanistic de-risking by clarifying cellular architecture and spatial relationships. This capability enhances predictive confidence in target validation efforts within discovery neuroscience programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glial subtype morphology and spatial organization to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible method for visualizing single-cell architectures in intact neural tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively distinguishable single-cell labels for morphological screening and interaction mapping.
- Operational Value: Produces standardized, sparse labeling compatible with imaging-based assay readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling detailed glial phenotyping in Drosophila models of neural function.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery morphology assessment to preclinical validation workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The MCFO technique integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven assessment of glial cell structure and interaction, informing target selection and model relevance prior to lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking through high-resolution visualization of glial morphologies and spatial patterning in vivo.
- Screening: Enables standardized, sparse single-cell labeling for imaging-based phenotypic screening of glial architecture.
- Analytics: Generates multi-color readouts that allow quantitative comparison of cell shape, territory, and interaction patterns across conditions.
- Translational Research: Connects discovery-stage morphology data to preclinical models by establishing glial phenotypic benchmarks.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable labeling platform applicable across neural tissues and developmental stages in Drosophila.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in glial target validation through direct visualization of single-cell morphology and interaction.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization via controlled heat-shock induction and sparse labeling optimization.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing morphological confidence in target relevance and model fidelity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of glial targets based on validated structural and spatial phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, GAL4/UAS systems, and heat-shock inducible Flp recombinase protocols.
- Dependent on access to fluorescence microscopy and antibody-based detection for epitope-tagged reporters (HA, FLAG, V5).
- Necessitates optimization of heat-shock duration to achieve sparse labeling for specific GAL4 drivers.
- Involves standardized dissection, fixation, and immunostaining workflows to preserve tissue integrity and signal quality.
- Limited to epitope-tag detection rather than live fluorescence, requiring fixed-tissue processing and immunostaining steps.
