Toepassing van MultiColor FlpOut techniek om hoge resolutie eencellige Morphologies en cel interacties van Glia in Drosophila te studeren
20 oktober 2017
Cellen weergeven van verschillende morphologies en stellen een verscheidenheid van interacties met hun buren. Dit protocol wordt beschreven hoe te onthullen van de morfologie van afzonderlijke cellen en cel-cel interactie onderzoeken met behulp van de gevestigde Gal4/UAS expressie systeem.
Het algemene doel van deze techniek is om de morfologie van afzonderlijke cellen in complexe anatomische weefsels te visualiseren, waardoor het onderzoek naar cel-cel interactie in Drosophila wordt vereenvoudigd. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over complexe morfologieën en cel-cel interacties met behulp van de fruitvlieg. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden aangepast aan het onderzoek naar de morfologie van afzonderlijke cellen in elk weefsel en in elk ontwikkelingsstadium.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Anja Kieser, een technicus in ons laboratorium. De MCFO-techniek wijzigt de standaard FlpOut-techniek als volgt. Een hitteschok FLP recombinase en verschillende reporters blijven onder UAS-controle, maar elke reporter heeft een gemeenschappelijke ruggengraat van een myristoylerde superfolder GFP, waarin kopieën van een epitoop tag zijn ingezet.
De resulterende niet-fluorescente eiwitten worden spaghetti monster GFP's genoemd en worden geïdentificeerd met antilichamen. Afhankelijk van het aantal excisies, wordt een andere combinatie van epitopen tot expressie gebracht. Omdat de HSP-promotor op 25 graden Celsius lichtjes actief is, moet u kruisen bij 18 graden Celsius waar het echt inactief is.
Wacht vervolgens ongeveer 20 dagen om de F1-generatie te verkrijgen. Sorteer de F1-vrouwtjes en mannetjes in afzonderlijke flesjes. Om ze te hitteschok, breng ze eerst over naar verse voedselflesjes wanneer ze drie tot vier dagen oud zijn.
Jongere vliegen kunnen te delicaat zijn voor hitteschok. Breng vervolgens de flesjes over in een waterbad van 37 graden Celsius. Dompel ze diep onder om een homogene hitteschok te garanderen.
Voor schaarse markering van gliacellen, begint u met vijf tot acht minuten hitteschok en optimaliseert u vervolgens. De optimale hitteschoktijd zal de doelcellen schaars markeren en de relatie ervan hangt af van de specifieke GAL4-driver die wordt gebruikt. Na de hitteschok, legt u de flesjes enkele minuten horizontaal op de werkbank om ze af te koelen.
Begin nu de vliegen te onderhouden bij 25 graden Celsius in dezelfde flesjes. Na twee dagen zal de reporterexpressie optimaal zijn en kunnen de vliegen worden gedissecteerd. Bereid u voor door drie diepe deuken op ijs te plaatsen.
Vul één deuk met 70%ethanol, één met PBS en één met S2-celkweekmedium. Laad vervolgens een drie centimeter dissectieschaal bekleed met zwart siliconen met koud S2. Voer de volledige dissecties uit in S2 om de weefsels gezond te houden. Verdoof nu de vliegen met koolstofdioxide.
Plaats vervolgens de vliegen met behulp van een pincet of een veer in koud 70%ethanol gedurende ongeveer 30 seconden gevolgd door koud PBS gedurende ongeveer 30 seconden en breng ze vervolgens over in koud S2. Was dus alle vliegen die worden gedissecteerd. Tot 10 vliegen van één genotype is meestal voldoende. Dissect nu binnen 30 minuten alle hersenen uit.
Los eerst het hoofd los van de rest van het lichaam en gooi het lichaam weg. Houd het hoofd met de vrije hand vast tijdens de volledige dissectie, anders zal het erg moeilijk zijn om het weer vast te pakken. Trek vervolgens één oog uit door het weefsel net onder de retina vast te grijpen.
Trek vervolgens het andere oog eraf en ontbloot zodoende de hersenen en omliggende weefsels. Verwijder vervolgens al het tracheavlies en overblijvende cuticula rond de hersenen, totdat het hersenweefsel er schoon uitziet. Al het tracheavlies moet worden verwijderd voor optimale kleuringsresultaten.
Dit is alles wat nodig is om de hersenen voor te bereiden op fixatie. Ga verder met het dissecteren van alle hersenen, terwijl de gedissecteerde hersenen in koud S2 worden gehouden. Probeer voor optimale kleuring tot 10 hersenen per microcentrifugebuisje voor te bereiden. Breng de geïsoleerde hersenen over met behulp van een P10 pipettentip in een microcentrifugebuisje van 200 microliter met fixeeroplossing.
Gebruik nooit pincetten om de hersenen te hanteren. Incubeer de weefsels beschermd tegen licht. Vermijd het aspireren van de hersenen tijdens oplossingsoverdracht.
Gebruik drie of meer wasbeurten van 15 minuten met wasoplossing om de fixeermiddelen te verwijderen. Blokkeer vervolgens de weefsels met blokkeringsoplossing gedurende 30 minuten of langer. Vervang vervolgens de blokkeringsoplossing door primaire antilichamen verdund in wasoplossing en incubeer de hersenen een nacht bij vier graden Celsius.
Gebruik drie wasbeurten van één uur in wasoplossing om de primaire antilichamen te verwijderen. Voeg vervolgens secundaire fluorfosfor geconjugeerde antilichamen toe in wasoplossing en incubeer de hersenen een nacht bij vier graden Celsius of gedurende vier uur bij kamertemperatuur. Gebruik drie wasbeurten van één uur in wasoplossing gevolgd door een langere wasbeurt met PBS om de ongebonden antilichamen volledig te verwijderen.
Monteer vervolgens de hersenen. Bereid twee dekglasjes met een beeldvormingsruimte voor. Breng op de ruimte en op het extra dekglasje 10 microliter montagemedium met een anti-fade middel aan.
Breng vervolgens de hersenen over met behulp van een P10 pipettentip naar het dekglasje, en plaats ze naast het medium samen met wat PBS. Laat het weefsel niet uitdrogen. Verplaats nu voorzichtig de hersenen in het montagemedium met behulp van de pipetten en verplaats ze uiteindelijk naar het medium in de ruimte en rangschik ze met pincetten.
Verwijder vervolgens de zelfklevende voering op de ruimtes en bevestig een dekglasje. Zet het dekglasje vast met een beetje druk met behulp van pincetten en ga direct door met beeldvorming of bewaar de preparaten bij min 20 graden Celsius voor latere analyse. Met behulp van de beschreven methoden worden drie verschillende membraan getagde reporters stil gehouden door transcriptionele terminatoren omringd door FRT-sites.
Toen de dieren werden hitteschokken, werd de FLP-recombinase geëxpresseerd en verwijderde deze willekeurig de terminatoren, wat leidde tot de expressie van verschillende combinaties van reporters. Over het al
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om de morfologie van individuele cellen te visualiseren en cel-celinteracties bij Drosophila te onderzoeken met behulp van het Gal4/UAS-expressiesysteem. De techniek vereenvoudigt de bestudering van complexe anatomische weefsels en kan worden aangepast voor diverse weefsels en ontwikkelingsstadia.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Cellen vertonen diverse morfologieën en interacties.
- Het begrijpen van deze interacties is cruciaal voor de ontwikkelingsbiologie.
- Het Gal4/UAS-systeem is een veelzijdige tool voor genexpressiestudies.
- Drosophila dient als een effectief modelorganisme voor dergelijke studies.
Doel van de studie
- Om de morfologie van individuele cellen in complexe weefsels te visualiseren.
- Om cel-celinteracties in een ontwikkelingscontext te onderzoeken.
- Om de methode aan te passen voor diverse weefsels en stadia.
Gebruikte methoden
- De MCFO-techniek is een modificatie van de FlpOut-techniek.
- Maakt gebruik van hittestok-FLP-recombinase en UAS-gecontroleerde reporters.
- Maakt gebruik van gemyristoyleerd superfolder GFP met epitope-tags.
- Gedemonstreerd door een laboratoriumtechnicus.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van morfologieën van individuele cellen.
- Verbeterd begrip van cel-celinteracties.
- Aanpasbaarheid van de techniek voor verschillende weefsels.
- Potentieel voor toepassing in diverse ontwikkelingsstadia.
Conclusies
- De methode biedt inzicht in complexe cellulaire interacties.
- Deze kan breed worden toegepast in het onderzoek naar ontwikkelingsbiologie.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek benutten voor een dieper begrip.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Het begrijpen van de morfologie van gliacellen en hun interactiepatronen in vivo is cruciaal voor het verminderen van risico's bij neurobiologische doelhypotheses en voor het informeren van de selectie van preklinische modellen. De MultiColor FlpOut (MCFO)-techniek maakt hoogresolutie single-cell labeling mogelijk in complexe weefsels, wat mechanistische risicoanalyse ondersteunt door de cellulaire architectuur en ruimtelijke relaties te verduidelijken. Deze mogelijkheid verhoogt het voorspellend vertrouwen bij inspanningen voor targetvalidatie binnen programma's voor discovery neuroscience.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de morfologie en ruimtelijke organisatie van gliale subtypen te onderzoeken ter ondersteuning van het testen van doelhypotheses.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare methode voor het visualiseren van enkelcelarchitecturen in intact neuraal weefsel.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatief onderscheidbare single-cell labels voor morfologische screening en interactie-mapping.
- Operationele waarde: Produceert gestandaardiseerde, ijl labelen (sparse labeling) die compatibel is met op beeldvorming gebaseerde assay-uitlezingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt systeemmodellering die relevant is voor ziekten door gedetailleerde gliale fenotypering mogelijk te maken in Drosophila-modellen van neurale functies.
- Operationele waarde: Faciliteert de continuïteit van morfologische beoordelingen tijdens de ontdekkingsfase naar workflows voor preklinische validatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De MCFO-techniek integreert in vroege discovery-workflows door een hypothesegestuurde beoordeling van de structuur en interactie van gliacellen mogelijk te maken, wat bijdraagt aan de selectie van targets en de relevantie van modellen vóór de stadia van lead-identificatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische risicoanalyse door middel van visualisatie met hoge resolutie van gliale morfologieën en ruimtelijke patroonvorming in vivo.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde, ijle single-cell labeling mogelijk voor fenotypische screening op basis van beeldvorming van de gliale architectuur.
- Analytics: Genereert meerkleurige read-outs die een kwantitatieve vergelijking maken mogelijk van celvorm, territorium en interactiepatronen tussen verschillende condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt morfologische gegevens uit de ontdekkingsfase met preklinische modellen door gliale fenotypische benchmarks vast te stellen.
- Enterprise Reuse: Vormt een herbruikbaar labelingplatform dat toepasbaar is op diverse neurale weefsels en ontwikkelingsstadia in Drosophila.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van gliale targets door directe visualisatie van morfologie en interacties op single-cell niveau.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid en standaardisatie via gecontroleerde heat-shock inductie en optimalisatie van sparse labeling.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go beslissingen door morfologische zekerheid te bieden over de relevantie van het target en de getrouwheid van het model.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van gliale targets mogelijk op basis van gevalideerde structurele en ruimtelijke fenotypes.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in Drosophila-genetica, GAL4/UAS-systemen en protocollen voor hitte-schok induceerbare Flp-recombinase.
- Afhankelijk van toegang tot fluorescentiemicroscopie en antilichaam-gebaseerde detectie voor epitope-getagde reporters (HA, FLAG, V5).
- Vereist optimalisatie van de hitte-schok duur om een spaarzame labeling te bereiken voor specifieke GAL4-drivers.
- Omvat gestandaardiseerde workflows voor dissectie, fixatie en immunokleuring om de weefselintegriteit en signaalkwaliteit te behouden.
- Beperkt tot epitope-tag detectie in plaats van live fluorescentie, wat verwerking van gefixeerd weefsel en immunokleuringsstappen vereist.
