Name: Optische cross-sectionele spier gebied bepaling van Drosophila Melanogaster volwassen indirecte vlucht spieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Leer een methode om spieroppervlak te kwantificeren bij volwassen Drosophila als indirecte maat voor spiermassa. Deze techniek wordt toegepast op indirecte vluchtspieren in modellen voor Myotone Dystrofie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank leden van de translationeel genomica en Kathryn J Hanson voor de feed-back en de verbeteringen op dit protocol. Dit project werd uitgevoerd met onderzoeksbeurs SAF2015-64500-R, waarin de Europese regionale ontwikkelingsfondsen, toegekend aan R.A door het Ministerio de Economia y Competitividad.

1. fixatie en hars inbedding
<ol><li>Anesthetize de vliegen met kooldioxide (CO2) of via hypothermie met behulp van een ijsblok. Gebruik een ontleden Microscoop (met lage vergroting te zien de hele vlieg) en schaar de poten, vleugels, hoofd en de terminal deel van buik om de penetratie van de fixeerspray te verwijderen. Voorzichtige behandeling van de karkassen is vereist bij deze stap om te voorkomen dat de vervorming van de thorax. Opmerking: Starten met ten minste 12 vliegen per genotype om een voldoende aantal goed verwerkte personen aan het einde van de procedure.</li>
	<li>De karkassen overbrengen in een 1,5 mL-buis op ijs (het plaatsen van een maximum van 6 personen per buis) met 200 µL van oplossing 1. Opmerking: De karkassen niet blijven in de oplossing 1 voor meer dan 20 min.<ol>
<li>Oplossing 1, het mengen van de componenten in deze volume verhoudingen: ¼ 4% paraformaldehyde, ¼ 8% Glutaaraldehyde, ¼ 0,2 M Na2HPO4 en ¼ 0,2 M NaH-2PO4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 200 µL van oplossing 2 en incubeer op ijs gedurende 30 minuten.<ol>
<li>Oplossing 2: Meng oplossing 1 en OsO4 in een verhouding van 1:1 (v/v). Let op: OsO4 is uiterst giftig. Manipuleren in een zuurkast met passende maatregelen voor veiligheid en verwijdering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alle de vloeistof afzuigen. Voeg 200 µL van oplossing 2 en incubeer op ijs gedurende 1-2 uur.</li>
	<li>Verwijderen van de oplossing en uitdrogen van de monsters door een reeks graded ethanol als volgt: eens in de 30%, 50%, 70%, 90% en tweemaal in absolute ethanol; elke 5 min. Voeg 1 mL ethanol ter dekking van de monsters. Opmerking: Zodra het weefsel in ethanol 90% wordt geplaatst, de volgende stappen kunnen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Incubeer de monsters tweemaal in propyleenoxide gedurende 10 minuten elk incubatie. Let op: Propyleenoxide is giftig, gebruiken in een zuurkast.</li>
	<li>De propyleenoxide vervangen door een 1:1 (v/v) mengsel van epoxy hars en propyleen oxide en na een nacht bebroeden bij kamertemperatuur. Let op: De hars is uiterst giftig in een vloeibare staat. De hars is beschikbaar als een set van vier componenten (A, B, C en D).<ol>
<li>Voor epoxyhars, Voeg in een wegwerp bekerglas 54 g van hars (A), 44,5 g verharder (B), 2,5 g van accelerator (C) en 10 g weekmaker (D). Alle onderdelen van de hars in een zuurkast te combineren. Bewaar de hars in aliquots bij-20 ° C (voor maximaal 6 maanden) of bij-80 ° C (voor meerdere jaren).</li>
		<li>Als u wilt negeren de hars, bak het bij 70 ° C gedurende 24 uur omdat solide hars niet giftig is. Negeren van alle eerdere oplossingen in de groep van de zware metalen volgens passende internationale procedures, omdat oplossingen sporen van OsO bevatten kunnen4.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het voorgaande mengsel vervangen door 100% hars, en de monsters gedurende 4 uur uit te broeden.</li>
	<li>De karkassen overbrengen in plastic mallen met nieuwe hars (een karkas in elk putje van de schimmel). Gebruik een scherp houten stok of naald om te dragen en oriënteren van de karkassen in de putjes en laat de hars te polymeriseren 's nachts in een oven van Pasteur bij 70 ° C. Opmerking: Om ervoor te zorgen de juiste oriëntatie van de karkassen voor posterieure trimmen en segmenteren, de karkassen moeten liegen op hun lange kant, met het voorste deel van het karkas zeer dicht bij de rand van de put.</li>
</ol>2. trimmen en segmenteren van blokken
<ol><li>De gepolymeriseerde hars blokken uit de mallen te verwijderen. Scheermesjes trim weg het hars, een trapeziumvormige vorm rondom het karkas en passende afdrukrichting geven in de microtoom gebruiken Start alle de karkassen afdelen na de dwarse hechtdraad om vergelijkbare resultaten te verkrijgen. Opmerking: De sectie moet loodrecht op de as van de anteroposterior van het DLMs trim het monster correct ( Figuur 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig3.jpg"> Figuur 3 . Dorsoventral delen van hars-embedded volwassen thoraces van de myotone dystrofie model vliegen. In (A) was het wegsnijden van de steekproef niet correct als de sectie in het dorsale-recht gedeelte van de afbeelding niet volledig transversale naar de spieren was. Dientengevolge, lijken de drie spier-bundels op de hogere rechterkant groter dan die van de linkerzijde. Deze fout zou resulteren in een overschatting van het spier gebied. (B) gedeelte van een blok van de correct bijgesneden hars. Schaal bar: 200 µm.
<ol><li>Snijden 1.5-µm dik secties met een ultramicrotome en breng de secties in waterdruppels gelatinized dia's.<ol>
<li>Het verkrijgen van de secties uit het mesothorax segment voor alle monsters om vergelijkbare resultaten te verkrijgen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats de dia's met de secties op een blok van de verwarming bij 70-80 ° C, totdat de H2O is verdampt. Op dit punt, kunnen de monsters worden waargenomen met het OsO4 contrast (figuur 4A).</li>
</ol>3. kleuring IFM secties
<ol><li>Dekking van de secties met genoeg toluïdine blauw voor ongeveer 30 s op het blok van de verwarming.<ol>
<li>Ontbinden voor toluïdine blauwe oplossing, 1% van toluïdine blauwe en 1% van borax in H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spoel met H2O en laat de dia's op een warme plaat te verdampen van het water. Herhaal de kleuring met toluïdine blauw als het contrast moet worden verbeterd (figuur 4B).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig4.jpg"> Figuur 4 . Dorsoventral delen van hars-embedded volwassen thoraces met verschillende contrast technieken. Beide panelen tonen beelden van DM1 model vliegen gevoed met Abp1 zoals in figuur 2D. (A) afbeelding van een sectie met de OsO4 contrast. (B) gedeelte gekleurd met toluïdine blauwe kunt betere visualisatie van de spier-bundels. Schaal bar: 200 µm.
4. montage IFM secties
<ol><li>Droog de dia's met de verwarming blokkeren totdat de H2O is verdampt.</li>
	<li>Zet 1 of 2 druppels van montage medium op de secties en zet op een dekglaasje aan. Let op: Uit deze stap in een zuurkast te voeren omdat het medium montage giftig is.</li>
</ol>5. verwerving van beelden en kwantificering van spier gebied
<ol><li>Neem de beelden bij lage vergroting zodat de hele reeks van DLM spieren in focus is. Wij gebruiken normaal 10 X.<ol>
<li>Voor statistische analyse ten minste 5 seriële beelden per fly nemen en analyseren van ten minste 5 vliegen per experimentele groep.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecteer de afbeelding met de hele spieren (figuur 5A). Controleren van de as of de richting van de sectie en het negeren van de monsters met ongepaste oriëntatie, die de resultaten zou verstoren (vergelijk cijfers 3A / 3B onderscheid maken tussen slecht en goed georiënteerd secties, respectievelijk).</li>
	<li>ImageJ software gebruiken voor het selecteren van een gebied (in pixels) met alleen de DLM (figuur 5A/5B). Het referentie-gebied moet worden gebruikt voor de vergelijking tussen verschillende experimentele groepen, zou altijd de vlieg met de grootste spieren zijn. In alle afbeeldingen van de verschillende genotypen wilt vergelijken, selecteert u een gebied met DLMs van gelijke afmetingen aan de reference ruimte (figuur 5B).</li>
	<li>De beelden met de opdracht afbeelding-J binarize: Proces/Binary/Make binaire en schrap de gebieden of pixels die niet overeenkomen met de spieren van belang (figuur 5C).<ol>
<li>In het geval dat artefactual zwarte vlekken op andere gebieden dan spier weergegeven, verwijderen met de opdracht hulpmiddelen voor tekenen en selecteert u het symbool van de gum.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig5.jpg"> Figuur 5 . Afbeelding van de analyseprocedure voor spier gebied bepaling. (A) transversale gedeelte van myotone dystrofie type 1 model vliegen thorax met een rechthoek bevattende de DLM. (B) het geselecteerde gebied met alleen de indirecte vlucht spieren en de darm (*). (C) Binarized de afbeelding. De zwarte gebieden komen overeen met de spieren van belang. De darm is voor een nauwkeurige kwantificering van spier gebied gewist. Schaal bar: 200 µm.
<ol start="5"><li>Kwantificeren van percentage van pixels overeenkomt met spierweefsel (zwarte pixels) uit totaal met het commando: Analyze/meting en selecteer de optie gebied breuk. Dit percentage van ruimte is een schatting van de DLM spiermassa van elke vliegen.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li>
<li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+%28DLM%29+of+Drosophila%3A+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li>
<li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/00atlas.htm">Atlas of Drosophila Development.</a> Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+in+the+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fate in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).</li>
<li>Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+Tetroxide+And+Its+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Platin+Met+Rev%22%5BJournal%5D)">Osmium Tetroxide And Its Applications.</a> Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).</li>
<li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1165/">Myotonic Dystrophy Type 1.</a> GeneReviews. 1, 1-23 (1993).</li>
<li>Bargiela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+autophagy+and+apoptosis+contribute+to+muscle+atrophy+in+a+myotonic+dystrophy+type+1+Drosophila+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model.</a> Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).</li>
<li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscleblind%2C+BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).</li>
<li>García-López, A., Llamusí, B., Orzáez, M., Pérez-Payá, E., Artero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+discovery+of+a+peptide+that+prevents+CUG-RNA+hairpin+formation+and+reverses+RNA+toxicity+in+myotonic+dystrophy+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).</li>
<li>van der Plas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Dystrophin+is+required+for+integrity+of+the+musculature%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature.</a> Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).</li>
<li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann New York Acad Sci. , 1184(2010).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e51223(2014).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Het is aangetoond dat Drosophila melanogaster een nuttig model is te bestuderen van neuromusculaire ziekten bij de mens7,10,11, met inbegrip van myotone dystrophie, die worden gekenmerkt door het verschijnen van musculaire atrofie. Het protocol hier gepresenteerd is een nuttig instrument voor het kwantificeren van de degeneratie van de spieren veroorzaakt door het ontstaan of de progressie van een bepaalde ziekte in een...

De thorax van de fruitvlieg bevat twee verschillende klassen van de vlucht spieren, die functioneel, fysiologisch en anatomisch onderscheiden zijn. Deze spieren zijn: de indirecte vlucht spieren (IFM), die zijn samengesteld uit dorso-longitudinaal (DLM) en dorso-ventrale (DVM) spieren (Figuur 1), en de synchrone vlucht controle spieren1,2. Deze spieren genereren samen de verhoogde mechanische kracht nodig is voor de vlucht. De grootte, de distributie en de rostro-caudal vervreemding van de IFMs toestaan een gemakkelijke oriëntatie voor transversale vectorafbeeldingsbestanden3 (figuur 2A). Om deze reden hebben wij deze spieren te bestuderen spieratrofie bij Drosophila melanogastergeselecteerd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig1.jpg"> Figuur 1. Diagram van de thorax van de fruitvlieg tonen de indirecte vlucht spieren (IFMs) regeling. (Links) geeft een laterale weergave en (rechts) geeft een dwarsdoorsnede van de thorax. De IFMs zijn samengesteld uit de Dorso-longitudinaal (DLM) spieren (in rood) en de (DVM) Dorso-ventrale spieren (in groen).
Behoud van weefsel structuur en de controle over dorso-ventrale as oriëntatie van histologische secties zijn cruciaal voor het garanderen van adequate beoordeling van de oppervlakte van de dwarsdoorsnede van de spier. Voor het behoud van de bespiering die we een mengeling van de fixatie van Tomlinson et al. gewijzigd gebruikt 4 . Bovendien, omdat de spieren zijn interne weefsels, de ondoordringbaarheid van Drosophilaexoskelet is een probleem als fixatie mengsels niet kunnen tot de doel-weefsels doordringen. Om te omzeilen van dit probleem, verwijderd we het vliegen hoofd, benen, vleugels en de laatste twee segmenten van de buik maken van gaten waardoor de fixatie mengsel in te voeren. Als onderdeel van het protocol van de fixatie dat we behandeling met osmium tetroxide (OsO4)5, waarin uitvoerig wordt gebruikt vanwege de mogelijkheid om op te lossen van vetten opgenomen, met inbegrip van triglyceriden. OsO4 behoudt de meeste structuren zeer goed, met name op de cytologische niveau en tegelijkertijd geeft contrast aan de afbeelding. Na fixatie, werden Drosophila thoraces ingesloten in hars voor transversale semi-dun vectorafbeeldingsbestanden (1,5 µm). Voor verbeterd contrast, kan weefsel worden bovendien gekleurd met toluïdine blauw. Beelden van de volledige thoraces werden genomen op 10 X en spier gebied werd gekwantificeerd door de binarizing van beelden (van gelijke afmetingen) en kwantificeren van percentage van pixels overeenkomt met spierweefsel (zwarte pixels) uit totaal, met ImageJ software.
Wijzigingen op het weefsel voorbereiding en fixatie mengsels, als de stijging van de concentratie van OsO4 en Glutaaraldehyde oplossing, geïntroduceerd in dit protocol toegestaan unieke behoud van spierweefsel. Dit is omdat het protocol vermijdt de afbraak en vervorming van het weefsel, waardoor de achterste analyseresultaten van de monsters betrouwbaarder zelfs in hoogst atrofische voorwaarden in verband met neuromusculaire degeneratieve ziekten zoals myotone dystrofie (DM). In zijn meest voorkomende vorm, DM type 1, wordt deze zeldzame genetische aandoening veroorzaakt door uitgebreide CUG herhalingen in Transcripten myotone dystrofie proteïne kinase (DMPK). Mutant DMPK RNA aggregaten formulier ribonuclear foci die sekwestreren van de Muscleblind-achtige nucleaire RNA-bindende proteÃ¯nen (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) in Drosophila)6. We genereerden een Drosophila model van myotone dystrofie met het uitspreken van 250 CTG herhalingen onder de gespierde myosin zware ketting promotor (Mhc-Gal4). Model vliegen werden loopvogel met een typische 'up-gehouden wings' fenotype en had ernstige spier atrofie in hun IFMs (figuur 2B). Eerdere studies uitgevoerd in ons laboratorium hebben aangetoond dat de bepaling van het oppervlak van de spier van IFMs is een betrouwbare methode om te kwantificeren van de effecten van verschillende chemische of genetische parameters van de spieratrofie in deze model vliegen7. Als voorbeeld bereikt overexpressie van Mbl isovorm C in vliegen uitdrukken van de 250 CTG in de spier herhaalt, een redding van spier gebied, zoals Mbl uitputting door sekwester is de activerende factor in DM1 pathogenese8 (figuur 2C). Spier gebied werd ook gered na het voeden van de DM-model vliegt met Abp1, een hexapeptide met bewezen anti-DM1 activiteit9 (figuur 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig2.jpg"> Figuur 2. Kwantificering van dorsoventral secties van volwassen thoraces hars ingesloten. (A-D) indirecte vlucht spieren van Drosophila melanogaster met de aangegeven relevante genotypen. (A) controle vliegt (yw). (B) uitdrukking van 250 niet-coderende CTG herhaalt in de spier (UAS-CTG(250)x) veroorzaakt een vermindering van de spier gebied in DLMs in vergelijking met controle vliegen. (C) deze spier atrofie fenotype werd gered door overexpressie van Muscleblind (MblC) (UAS-CTG (250) x UAS-MblC) en (D) voeden de model vliegen met de hexapeptide Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). In alle afbeeldingen is de dorsale zijde op bovenkant. Transgenen werden verdreven naar de spier met behulp van een Myosin zware-keten promotor (Mhc)-Gal4. (E) de kwantificering van percentage van de spier ten opzichte van de controle vliegen bevestigd dat de verschillen significant waren. Het histogram geeft middelen ± S.E.M. **p< 0.01 en * p < 0.05 (Student´s t-test). Schaal bar: 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56179/56179fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
De methode die hier gemeld zullen van belang aan onderzoekers zich te concentreren op de spierontwikkeling, onderhoud en veroudering, ziekte pathologie en drug testen want het biedt betrouwbare informatie over hoe spierweefsel op zowel de externe als de endogene factoren reageert.

<table><tbody><tr><td>Image-J software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>Leica UC6</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>Leica MZ6</td><td>Helder veld techniek.</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71970</td><td>Er bestaan verschillende alternatieve leveranciers.</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>World Precision World</td><td>14003</td><td>Er bestaan verschillende alternatieve leveranciers.</td></tr><tr><td>Embedding molds</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70900</td><td>Er bestaan verschillende alternatieve leveranciers.</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Fluka (Sigma)</td><td>49624</td><td>Toxisch.</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>Polyscience</td><td>0972A</td><td>Uiterst toxisch.</td></tr><tr><td>Propylene oxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82320-250ML</td><td>Uiterst toxisch.</td></tr><tr><td>hars (Durcupan)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44611-44614</td><td>Carcinogeen wanneer het niet gepolymeriseerd is.</td></tr><tr><td>Toluidine blauw</td><td>Panreac</td><td>251176</td><td>Toxisch.</td></tr><tr><td>Montagemedium (DPX)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44581</td><td>Gevaarlijk.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Schadelijk.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Panreac</td><td>122507</td><td>0,2 M verdunning.</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Panreac</td><td>121677</td><td>0,2 M verdunning.</td></tr><tr><td>Borax</td><td>Panreac</td><td>3052</td><td>Toxisch.</td></tr></tbody></table>

optische cross-sectionele spier gebied bepaling van drosophila melanogaster volwassen indirecte vlucht spieren

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Spiermassa verspillen, is bekend als spieratrofie, een gemeenschappelijk fenotype in Drosophila modellen van neuromusculaire ziekten. We hebben gebruik gemaakt van de indirecte vlucht spieren (IFMs) van vliegen, specifiek de dorso-longitudinale spieren (DLM), als de experimentele onderworpen aan maatregel het atrofische fenotype door verschillende genetische oorzaken teweeggebracht. In dit protocol, beschrijven we hoe te verankeren vliegen thorax spieren voor halve dunne segmenteren, het verkrijgen van een goed contrast tussen spieren en het omringende weefsel en hoe optische Microscoop afbeeldingen voor halfautomatische verwerving van meetbare gegevens wilt verwerken en analyse. We beschrijven drie specifieke toepassingen van de methodologische pijpleiding. Ten eerste, laten we zien hoe de methode kan worden toegepast om te kwantificeren spier degeneratie in een vlieg model van myotone dystrofie; Ten tweede, meting van de oppervlakte van de dwarsdoorsnede van de spier kan helpen bij het identificeren van genen die bevorderen of voorkomen spieratrofie en/of degeneratie van de spier; Ten derde, dit protocol kan worden toegepast om te bepalen of een kandidaat-verbinding kunnen aanzienlijk wijzigen een bepaald atrofische fenotype geïnduceerd door een ziekte-veroorzakende mutatieof door een milieu-trigger.

Te kwantificeren of de overexpressie van MblC of het beheer van Abp1 had geen effect in het atrofische fenotype van het myotone dystrofie vliegen model dat richtten we ons op de DLM, die deel van de IFMs (Figuur 1 uitmaken). Wij vastbesloten dat het model vliegt, die express 250 niet-coderende CTG herhaald gedurende de daaraan gehechte spiermassa, gedreven door de promotor Myosin zware-keten (Mhc)-Gal4, hadden een 50% vermindering van de spier gebied...

Wij rapporteren een methode om te kwantificeren spier gebied, dat een indirecte methode is om spiermassa in Drosophila volwassenen. We laten zien dat de toepassing van onze methodologie door het analyseren van de indirecte vlucht spieren in een Drosophila model van myotone dystrofie ziekte.

Optische cross-sectionele spier gebied bepaling van Drosophila Melanogaster volwassen indirecte vlucht spieren

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van het spieroppervlak in de spieren van de volwassen Drosophila als middel om indirect de spiermassa te kwantificeren en de omvang van spiergroei of spieratrofie correct te bepalen. Hiervoor hebben we ons gericht op de dorsale longitudinale spieren vanwege hun grootte, distributie en ook vanwege de lage en eenvoudige oriëntatie voor transversale doorsneden op deze positie. Stap één: fixatie en inbedding in hars.De eerste stap van de procedure is het anesthetiseren van de vliegen met CO2, waarna met behulp van een schaar en een pincet de poten, de vleugels en het uiteinde van het abdomen worden verwijderd. Vervolgens worden de karkassen voorzichtig overgebracht naar een 1,5 ml buisje op ijs om deformatie van de thorax te voorkomen, waarbij maximaal zes individuen per buisje worden geplaatst dat 200 µL van oplossing één bevat. De karkassen mogen niet langer dan 20 minuten in deze oplossing blijven.Voeg ten slotte 200 µL van oplossing twee toe en incubeer 30 minuten op ijs. Verwijder na incubatie al het vloeistof, voeg 200 µL van oplossing twee toe en incubeer de karkassen één tot twee uur op ijs. De volgende stap is het verwijderen van de oplossing en het dehydrateren van de monsters via een graduele ethanolreeks.Incubeer de monsters twee keer in propyleenoxide, telkens tien minuten per incubatie. Vervang vervolgens het propyleenoxide door een mengsel van 500 µL hars en 500 µL propyleenoxide en incubeer de monsters gedurende de nacht bij kamertemperatuur. Vervang de volgende dag het mengsel door 100% hars en incubeer de monsters gedurende vier uur.Breng daarna de karkassen over naar plastic mallen met nieuwe hars, waarbij u ervoor zorgt dat er één karkas in elk putje van de mal wordt geplaatst. Positioneer de karkassen in de putjes met een houten stokje en laat de hars een nacht polymeriseren in een pasteuroven bij 70 °C. Om de hars af te voeren, moet deze 24 uur lang bij 70 °C worden gebakken, aangezien vaste, gebakken hars niet toxisch is.Ten tweede, het trimmen en doorsnijden van de blokken. Trim met behulp van scheermesjes het hars weg en vorm een trapezoïde vorm rondom het karkas om de juiste oriëntatie in de microtoom te verkrijgen. Controleer onder de microscoop of de spieren perfect georiënteerd zijn.Snijd daarna coupes van 1,5 µm dik met een ultramicrotoom en breng de coupes over naar waterdruppels op gegelatiniseerde objectglazen. Plaats ten slotte de objectglazen met de coupes op een warmteblok bij 70 tot 80 °C totdat al het water is verdampt. Drie, het kleuren van IFM-coupes.Bedek de coupes gedurende ongeveer 30 seconden met toluidineblauw op het warmteblok. Spoel ze vervolgens meerdere keren af met water en laat de objectglazen op een warmteplaat liggen tot het water is verdampt. Vier tenslotte, het monteren van de IFM-coupes.Neem de objectglazen, breng één of twee druppels monteermiddel aan op de coupes en plaats er een lang dekglas op. Vijf, acquisitie van beelden en kwantificering van het spieroppervlak. Gebruik ImageJ-software om een gebied te selecteren dat uitsluitend de DLM's bevat.Gebruik de afmetingen van de afbeelding van de vlieg met het grootste spieroppervlak als controle, verfijn de afbeeldingen en verwijder de gebieden, of pixels, die niet overeenkomen met de spieren van belang. Kwantificeer het percentage pixels dat overeenkomt met spierweefsel ten opzichte van het totaal met het commando analyze, measurement, en selecteer de optie area fraction. Dit percentage van het oppervlak is een schatting van de musculaire massa van de DLM van elke vlieg.Representatieve resultaten. We stelden vast dat de modelvliegen, die 250 niet-coderende CTG-herhalingen in de gehele musculatuur tot expressie brachten, aangestuurd door de myosin heavy chain-promotor, MhC Gal four, een reductie van 50 procent in het spieroppervlak vertoonden vergeleken met controlevliegen. In tegenstelling hiermee onderdrukte de co-expressie van muscle blind C en uitgebreide CTG-herhalingen met dezelfde driver dit fenotype sterk, waarbij het dwarsdoorsnede-oppervlak van de spieren 70 procent was van dat van de controlevliegen.Toediening van het Abp1-hexapeptide in het voedingsmedium onderdrukte op soortgelijke wijze het atrofische fenotype, en modelvliegen die de verbinding hadden ingenomen, vertoonden ongeveer 60 procent van het normale spieroppervlak, in plaats van de 50 procent die typisch is voor DF1-vliegen. Conclusies. Het hier gepresenteerde protocol is een nuttig instrument voor het kwantificeren van de spierdegeneratie veroorzaakt door het ontstaan of het verloop van een specifieke ziekte in een vliegenmodel. Ten slotte is deze methode ook geoptimaliseerd om kleine verschillen in spieroppervlak te detecteren, of zelfs om het oppervlak van verschillende structuren, zoals nefrocyten, te kwantificeren.Bedankt voor het kijken.

optical-cross-sectional-muscle-area-determination-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Identificatie van mechanismen die ten grondslag liggen aan spierschade is cruciaal. Hier presenteren we de histologische techniek voor het bereiden van in paraffine ingebedde en bevroren delen van Drosophila thoracale spieren. Dit maakt analyse van de spier-morfologie en lokalisatie van eiwitten en andere spiercel componenten.

Paraffine ingebedde en vriescoupes van Drosophila Adult Spieren

De Drosophila vluchtspieren worden gebruikt als een modelsysteem voor spierontwikkeling en fysiologie. Deze video beschrijft het vluchtspierstelsel van volwassenen en belicht een protocol om het ontwikkelen van indirecte vluchtspieren te ontleden die geschikt zijn voor RNA-sequencing van poppen.

Drosophila Late Pupa Indirect Flight Muscle (IFM) Dissectie: een methode voor high-throughput weefselverzameling

C. elegans hebben twee soorten spieren, enkele sarcomere en meerdere sarcomere, of geriste spieren.  Deze video beschrijft de opstelling van de geriste lichaamswandspieren, die verantwoordelijk zijn voor de voortbewegingvaneen worm en bevat een monsterprotocol om spiermorfologie te meten met behulp van beeldanalysesoftware.

C. elegans Muscle Area Measurements: een gestandaardiseerde methode om gerigeerde spiermorfologie te kwantificeren

In dit protocol tonen we de toepassing van seriële-sectie Elektronentomografie ophelderen van mitochondriale structuur in Drosophila indirecte vlucht spier.

3D mitochondriale ultrastructuur van Drosophila indirecte vlucht spier geopenbaard door seriële-sectie Elektronentomografie

Hier presenteren we een easy-to-use en veelzijdige methode om uit te voeren levende beeldvorming van ontwikkelings processen in algemene en spier-pees genuitdrukking met name in levende Drosophila poppen.

In Vivo Beeldvorming van de spier-pees morfogenese in Drosophila poppen

Drosophila Flight Muscle is een krachtig model om transcriptionele regulering, alternatieve splicing, metabolisme en mechanobiologie te bestuderen. We presenteren een protocol voor dissectie van TL-gelabelde Flight muscle van Live poppen voor het genereren van zeer verrijkte monsters ideaal voor proteomica en Deep-sequencing. Deze monsters kunnen belangrijke mechanistische inzichten bieden in diverse aspecten van spierontwikkeling.

Dissectie van vlucht spieren van Drosophila melanogaster voor omics-benaderingen

Er wordt een protocol gepresenteerd dat de visualisatie van intacte Drosophila melanogaster in elk stadium van ontwikkeling mogelijk maakt met behulp van microcomputed tomografie.

Whole Animal Imaging van Drosophila melanogaster met behulp van Microcomputed Tomography

We beschrijven een dissectietechniek die de architectuur van de neuromusculaire overgang behoudt en een gedetailleerde immunocytochemische studie van motorneuronen in het volwassen Drosophila-been mogelijk maakt.

Dissectie en immunohistochemie van het Drosophila adult been om veranderingen op de neuromusculaire overgang voor een geïdentificeerd motorneuron te detecteren

Drosophila is een gerenommeerd model voor het bestuderen van sleutelmoleculen die myogenese reguleren. De huidige methoden zijn echter onvoldoende om de mRNA-transcriptiedynamiek en ruimtelijke verdeling binnen syncytie te bepalen. Om deze beperking aan te pakken, optimaliseerden we een RNA-fluorescentie in situ hybridisatiemethode die de detectie en kwantificering van mRNA's op een schaal van één molecuul mogelijk maakt.

Studie van spiertranscriptionele dynamica op enkelvoudige molecuulschalen in Drosophila

Hier presenteren we een snelle, goedkope workflow voor beeldvorming met hoge resolutie van volwassen Drosophila-ogen om patronen en groeidefecten te kwantificeren. We beschrijven ons protocol voor monstervoorbereiding door middel van puntmontage, beeldacquisitie met hoge resolutie en beeldanalyse.

Een snelle, eenvoudige workflow voor het kwantificeren van externe volwassen Drosophila-structuren

Drosophila is een krachtig model om fundamentele mechanismen van myogenese te begrijpen. Dit protocol voor de dissectie en voorbereiding van thorax hemi-secties maakt microscopie-analyse mogelijk van indirecte vliegspier van zowel pop- als volwassen stadia. Dit protocol maakt confocale beeldvorming mogelijk van cellulaire morfologie, eiwitlokalisatie, spierstructuur en meerdere andere aspecten van myogenese.

Dissectie van Drosophila melanogaster indirecte vluchtspieren voor microscopiebenaderingen

Leer een methode om spieroppervlak te kwantificeren bij volwassen Drosophila als indirecte maat voor spiermassa. Deze techniek wordt toegepast op indirecte vluchtspieren in modellen voor Myotone Dystrofie.

Optische cross-sectionele spier gebied bepaling van Drosophila Melanogaster volwassen indirecte vlucht spieren

Meer video's verkennen