Inductie van verlamming en visuele systeem schade in muizen door T cellen specifiek voor Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

De algemene doelstellingen van dit protocol zijn het induceren van een auto-immuunziekte van het centraal zenuwstelsel (CZS) door adoptieve transfer van aquaporine 4-specifieke T-cellen, en het monitoren van de resulterende effecten op het CZS en het dynamische visuele systeem. Deze methode zal helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de rol van T-cellen die specifiek zijn voor aquaporine 4, algemeen bekend als AQP4, bij neuromyelitis optica en andere inflammatoire visuele aandoeningen. Het belangrijkste voordeel van optische coherentietomografie is de mogelijkheid om retinaal letsel op een niet-invasieve manier longitudinaal te monitoren.

De procedure wordt gedemonstreerd door Sharon Sagan, een onderzoeksmedewerker in mijn laboratorium, samen met Andreas Cruz Harans, een fellow in het laboratorium van RE Green. Begin met het bevestigen van een nylon driewegkraan met twee mannelijke Luer-lockverbindingen aan een glazen Luer-lockspuit zonder zuiger. Zet de hendel van de kraan richting de spuit om de kraan te sluiten en positioneer de spuit met de open zijde naar boven.

Voeg na het vortexen een gelijk volume peptide en Complete Freund's Adjuvant-oplossing toe aan de spuit en plaats de glazen zuiger opnieuw in de spuit. Houd de zuiger op zijn plaats, keer de spuit om zodat de stopkraan naar boven wijst en schakel de hendel naar de ongebruikte female-verbinding. Druk de zuiger voorzichtig in om de overtollige lucht uit de spuit te verwijderen.

De oplossing zal de tweede mannelijke Luer-lockaansluiting van de stopkraan vullen. Bevestig vervolgens een tweede glazen spuit met de zuiger volledig ingevoerd aan de tweede mannelijke Luer-lockaansluiting. Om een emulsie te creëren, worden de zuigers afwisselend ingedrukt om de oplossing gedurende ongeveer twee minuten tussen de twee spuiten heen en weer te bewegen, waarna de oplossing ongeveer 10 minuten wordt gekoeld tot er een zichtbare verandering in de viscositeit van de oplossing optreedt.

Wanneer er een zeer stijve witte emulsie wordt gevormd, brengt u de gehele oplossing over in een van de spuiten en vervangt u de lege spuit door een nieuwe Luer-lockspuit van één millimeter. Vul de nieuwe spuit met de emulsie. Verwijder de spuit uit de stopkraan en bevestig een naald van 25 gauge.

Om de emulsie op consistentie te testen met water, wordt een druppel van de emulsie in een klein schaaltje water gespoten. Als de emulsie niet disperseert, is deze geschikt voor injectie. Injecteer vervolgens elke donor AQP4-knockoutmuis één keer subcutaan aan weerszijden van de onderbuik en aan weerszijden van de borstwand, mediaal van de oksel.

Maak 10 tot 12 dagen na de immunisatie een mediane incisie in de huid van de lies tot de nek, en langs elk achterpootje van de eerste muis. Trek de huid weg van het peritoneum en bevestig deze stevig aan de plank. Oogst vervolgens de inguinale en axillaire lymfeklieren en plaats de weefsels in een cellenzeef in een petrischaal met compleet medium.

Wanneer alle lymfeklieren zijn verzameld, plaatst u de celzeef op een conische buis van 50 milliliter met vers compleet medium op ijs en gebruikt u het platte uiteinde van een steriele zuiger van een spuit van vijf milliliter om de lymfekliercellen door het filtergaas te drukken. Spoel het gaas met 20 tot 30 milliliter compleet medium om het herstel van de cellen te vergemakkelijken, gevolgd door twee centrifugatie-wasbeurten. Resuspendeer na de tweede centrifugatie de pellet in T-celmedium voor het tellen.

Voeg de juiste concentraties antigeen, recombinant muis interleukine 23 en recombinant muis IL-6 toe aan de cellen, en voeg per put twee milliliter van deze Th17-polarisatiemenging met cellen toe aan elke put van een 12-well plaat. Plaats de plaat vervolgens gedurende 72 uur in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2. Tritureer op de derde dag van de polarisatie de culturen in elke put enkele keren om de gepolariseerde cellen los te maken, en verzamel deze op ijs in een conische koker van 50 milliliter voor het tellen.

Na twee wasbeurten in PBS worden de cellen verdund tot een concentratie van 1 x 10⁸ cellen per milliliter in PBS, waarna de celsuspensie voorzichtig wordt gemengd door te wervelen. Binnen één uur na collectie worden de cellen overgebracht naar een spuit van één milliliter, waarna 200 µL cellen intraveneus via de staartvin aan elk ontvangend dier wordt toegediend. Injecteer vervolgens elke muis intraperitoneaal, onmiddellijk en twee dagen later, met 200 ng B-pertussistoxine verdund in 200 µL PBS.

Voor in vivo retinale beeldvorming van de ontvangende dieren via optische coherentietomografie, moeten vijf minuten vóór de beeldvorming de pupillen worden geweid met één druppel 1% tropicamide per oog, en moet de warmtemat worden ingeschakeld. Plaats de muis op de beeldvormingscilinder en stuur de anesthesiestroom dienovereenkomstig om. Bescherm de ogen met 0,3% hydroxypropylmethylcellulose om ze vochtig te houden en om de continuïteit van de refractie te waarborgen, en plaats een op maat gemaakte contactlens op het te onderzoeken oog.

Richt de laser, geleid door het infraroodfundusbeeld, op het oog met de contactlens en zorg dat de straal gecentreerd is op de papilschijf. Voer 25 B-scans uit in resolutiemodus 'high resolution' en rasteriseer de beelden op basis van 30 gemiddelde A-scans. Vervang na het beeldvormen van beide ogen de contactlens door ooghealgel en plaats de muis in een warme herstelkooi.

Om de verkregen beelden te analyseren met de modulaire imaging-software voor geautomatiseerde segmentatie, moeten eerst handmatig de segmenten die overeenkomen met de inner limiting membrane en de inner plexiform layer worden gecorrigeerd om de grenzen van de binnenste retinale lagen weer te geven. Verifieer vervolgens of de retinal nerve fiber- en ganglioncellagen zich binnen de grenzen van de binnenste retinale laag bevinden en of ze elkaar niet overlappen. Subcutane immunisatie met AQP4-peptiden die pathogene T-cel-epitopen bevatten, roept sterke proliferatieve T-celresponsen op in de drainerende lymfeklieren van AQP4-knockout-muizen vergeleken met T-celresponsen bij wild-type muizen.

Flowcytometrische analyses van individuele V-beta-expressie tonen aan dat T-cellen specifiek voor AQP4-peptiden die pathogene T-cel-epitopen bevatten, unieke TCR-repertoires gebruiken en een selectieve hyperproliferatie vertonen, wat aangeeft dat pathogene T-celresponsen op deze determinanten normaal gesproken worden gereguleerd door thymische negatieve selectie. Ongeveer zes tot negen dagen na injectie van gepolariseerde T-cellen ontwikkelden bijna alle ontvanger-muizen klinische tekenen van autoimmune ziekte van het CZS, waaronder een slap staartje en verlamming van de achterpoten. Hierbij induceerden Th17-gepolariseerde AQP4-specifieke T-cellen een ernstiger klinisch ziektebeeld dan Th1-gepolariseerde AQP4-specifieke T-cellen.

Bijvoorbeeld, deze muis ontwikkelde volledige verlamming van de achterpoten na toediening van Th17-gepolariseerde AQP4-peptide-specifieke T-cellen. Klinische ziekte geïnduceerd door AQP4-peptide-specifieke Th17-cellen is ook geassocieerd met een infiltratie van mononucleaire cellen in het CNS-parenchym en de meninges, evenals ontsteking van de oogzenuw, wat verder wordt aangetoond door een zwelling en toegenomen dikte van de binnenste retinale laag die terugkeert naar de basislijn naarmate de muizen herstellen van de ziekte. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u AQP4-gerichte auto-immuniteit kunt induceren en monitoren, wat verdere studie mogelijk maakt om te begrijpen hoe T-cellen deelnemen aan neuromyelitis optica.