Name: Inductie van verlamming en visuele systeem schade in muizen door T cellen specifiek voor Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Leer adoptieve overdracht van AQP4-specifieke T-cellen om CNS-auto-immuunziekte bij muizen te induceren en optische coherentietomografie toe te passen voor niet-invasieve monitoring van retinale schade.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Steun werd verleend aan S.S.Z. door het National Institute of Health (RO1 AI073737 en RO1 NS092835-01), National Multiple Sclerosis Society (RG 4768, RG 5179 en RG 5180), Maisin Foundation en Guthy Jackson Charitable Foundation.

<ol><li>Hardy, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+inflammatory+demyelinating+syndromes+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Atypical inflammatory demyelinating syndromes of the CNS.</a> Lancet Neurol. 15 (9), 967-981 (2016).</li>
<li>Lennon, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum+autoantibody+marker+of+neuromyelitis+optica%3A+distinction+from+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica: distinction from multiple sclerosis.</a> Lancet. 364 (9451), 2106-2112 (2004).</li>
<li>Lennon, V. A., Kryzer, T. J., Pittock, S. J., Verkman, A. S., Hinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+marker+of+optic-spinal+multiple+sclerosis+binds+to+the+aquaporin-4+water+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel.</a> J Exp Med. 202 (4), 473-477 (2005).</li>
<li>Zamvil, S. S., Slavin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+MOG+Ig-positive+AQP4-seronegative+opticospinal+inflammatory+disease+justify+a+diagnosis+of+NMO+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Neuroimmunol+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Does MOG Ig-positive AQP4-seronegative opticospinal inflammatory disease justify a diagnosis of NMO spectrum disorder.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (1), 62(2015).</li>
<li>Bennett, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+pathogenic+anti-aquaporin-4+antibodies+in+early+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intrathecal pathogenic anti-aquaporin-4 antibodies in early neuromyelitis optica.</a> Ann Neurol. 66 (5), 617-629 (2009).</li>
<li>Bradl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromyelitis+optica%3A+pathogenicity+of+patient+immunoglobulin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuromyelitis optica: pathogenicity of patient immunoglobulin in vivo.</a> Ann Neurol. 66 (5), 630-643 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., Chung, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+development+and+function+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Understanding the development and function of T follicular helper cells.</a> Cell Mol Immunol. 7 (3), 190-197 (2010).</li>
<li>Lucchinetti, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+an+autoimmune+astrocytopathy%3A+lessons+learned+from+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">The pathology of an autoimmune astrocytopathy: lessons learned from neuromyelitis optica.</a> Brain Pathol. 24 (1), 83-97 (2014).</li>
<li>Zekeridou, A., Lennon, V. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4442096/">Aquaporin-4 autoimmunity.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (4), 110(2015).</li>
<li>Brum, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-DRB+association+in+neuromyelitis+optica+is+different+from+that+observed+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler%22%5BJournal%5D)">HLA-DRB association in neuromyelitis optica is different from that observed in multiple sclerosis.</a> Mult Scler. 16 (1), 21-29 (2010).</li>
<li>Varrin-Doyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+4-specific+T+cells+in+neuromyelitis+optica+exhibit+a+Th17+bias+and+recognize+Clostridium+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 4-specific T cells in neuromyelitis optica exhibit a Th17 bias and recognize Clostridium ABC transporter.</a> Ann Neurol. 72 (1), 53-64 (2012).</li>
<li>Vaknin-Dembinsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+responses+to+distinct+AQP4+peptides+in+patients+with+neuromyelitis+optica+%28NMO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler+Relat+Disord%22%5BJournal%5D)">T-cell responses to distinct AQP4 peptides in patients with neuromyelitis optica (NMO).</a> Mult Scler Relat Disord. 6, 28-36 (2016).</li>
<li>Nelson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodominant+T+cell+determinants+of+aquaporin-4%2C+the+autoantigen+associated+with+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immunodominant T cell determinants of aquaporin-4, the autoantigen associated with neuromyelitis optica.</a> PLoS One. 5 (11), 15050(2010).</li>
<li>Kalluri, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+aquaporin-4+specific+T+cells%3A+towards+a+model+for+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of aquaporin-4 specific T cells: towards a model for neuromyelitis optica.</a> PLoS One. 6 (1), 16083(2011).</li>
<li>Pohl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+T+cell+responses+against+aquaporin+4%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenic T cell responses against aquaporin 4.</a> Acta Neuropathol. 122 (1), 21-34 (2011).</li>
<li>Zeka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+encephalitogenic+aquaporin+4-specific+T+cells+and+NMO-IgG+jointly+orchestrate+lesion+location+and+tissue+damage+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Highly encephalitogenic aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG jointly orchestrate lesion location and tissue damage in the CNS.</a> Acta Neuropathol. 130 (6), 783-798 (2015).</li>
<li>Sagan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+checkpoint+bypass+permits+emergence+of+pathogenic+T+cells+to+neuromyelitis+optica+autoantigen+aquaporin-4%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tolerance checkpoint bypass permits emergence of pathogenic T cells to neuromyelitis optica autoantigen aquaporin-4.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (51), 14781-14786 (2016).</li>
<li>Vita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+epitope+database+%28IEDB%29+3.0%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The immune epitope database (IEDB) 3.0.</a> Nucleic Acids Res. 43, Database issue 405-412 (2015).</li>
<li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022175907003651">Lymph node mapping in the mouse.</a> J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li>
<li>Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+retinal+wholemount+preparation+for+imaging+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for retinal wholemount preparation for imaging and immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (82), e51018(2013).</li>
<li>Cruz-Herranz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+APOSTEL+recommendations+for+reporting+quantitative+optical+coherence+tomography+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The APOSTEL recommendations for reporting quantitative optical coherence tomography studies.</a> Neurology. 86 (24), 2303-2309 (2016).</li>
<li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice%3A+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> Eur J Immunol. 25 (7), 1951-1959 (1995).</li>
<li>Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodominant+T-cell+epitopes+of+MOG+reside+in+its+transmembrane+and+cytoplasmic+domains+in+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Neuroimmunol+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22(2014).</li>
<li>Molnarfi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-dependent+B+cell+APC+function+is+required+for+induction+of+CNS+autoimmunity+independent+of+myelin-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">MHC class II-dependent B cell APC function is required for induction of CNS autoimmunity independent of myelin-specific antibodies.</a> J Exp Med. 210 (13), 2921-2937 (2013).</li>
<li>Jones, M. V., Huang, H., Calabresi, P. A., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+aquaporin-4+reactive+T+cells+are+sufficient+to+induce+mouse+model+of+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Pathogenic aquaporin-4 reactive T cells are sufficient to induce mouse model of neuromyelitis optica.</a> Acta Neuropathol Commun. 3, 28(2015).</li>
<li>Oertel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructural+visual+system+changes+in+AQP4-antiboby-seropositive+NMOSD%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol.+Neuroimmunol.+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Microstructural visual system changes in AQP4-antiboby-seropositive NMOSD.</a> Neurol. Neuroimmunol. Neuroinflamm. 4, 72(2017).</li>
<li>Vogel, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletional+tolerance+prevents+AQP4+directed+autoimmunity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Deletional tolerance prevents AQP4 directed autoimmunity in mice.</a> Eur J Immunol. , (2017).</li>
<li>Zhang, H., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinally+extensive+NMO+spinal+cord+pathology+produced+by+passive+transfer+of+NMO-IgG+in+mice+lacking+complement+inhibitor+CD59%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Longitudinally extensive NMO spinal cord pathology produced by passive transfer of NMO-IgG in mice lacking complement inhibitor CD59.</a> J Autoimmun. 53, 67-77 (2014).</li>
<li>Zeka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+4-specific+T+cells+and+NMO-IgG+cause+primary+retinal+damage+in+experimental+NMO%2FSD%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG cause primary retinal damage in experimental NMO/SD.</a> Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 82(2016).</li>
<li>Felix, C. M., Levin, M. H., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-independent+retinal+pathology+produced+by+intravitreal+injection+of+neuromyelitis+optica+immunoglobulin+G%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Complement-independent retinal pathology produced by intravitreal injection of neuromyelitis optica immunoglobulin G.</a> J Neuroinflammation. 13 (1), 275(2016).</li>
<li>Zamvil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+clones+specific+for+myelin+basic+protein+induce+chronic+relapsing+paralysis+and+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination.</a> Nature. 317 (6035), 355-358 (1985).</li>
<li>Zamvil, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalitogenic+T+cell+clones+specific+for+myelin+basic+protein.+An+unusual+bias+in+antigen+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Encephalitogenic T cell clones specific for myelin basic protein. An unusual bias in antigen recognition.</a> J Exp Med. 162 (6), 2107-2124 (1985).</li>
<li>Kuchroo, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-1+and+B7-2+costimulatory+molecules+activate+differentially+the+Th1%2FTh2+developmental+pathways%3A+application+to+autoimmune+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">B7-1 and B7-2 costimulatory molecules activate differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to autoimmune disease therapy.</a> Cell. 80 (5), 707-718 (1995).</li>
<li>Bettelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441 (7090), 235-238 (2006).</li>
</ol>

S.A. Sagan, A. Cruz-Herranz C.M. Spencer, P.P. Ho, L. Steinman, A.J. Green en R.A. Sobel verslag geen informatieverschaffing. S.S. Zamvil is adjunct hoofdredacteur van neurologie, Neuroimmunology en Neuroinflammation en is een lid van de adviesraad voor de internationale maatschappij van Neuroimmunology. Hij is heeft betekend aan de Editorial Board van de Journal of Clinical Investigation, The Journal of Immunology and The Journal van neurologische Sciences, en een Handvest lid van het Comité van het overzicht subsidie voor de nationale instituten Tumoren van de hersenen (CNBT) of Health (NIH) klinische Neuroimmunology door sectie en de National Multiple Sclerosis Society (NMSS) te bestuderen. Hij heeft gediend als consultant en honoraria van Biogen Idec, EMD-Serono Genzyme, Novartis, Roche/Genentech en Teva Pharmaceuticals, Inc., ontvangen en heeft gediend of zetelt in gegevens veiligheid Monitoring raden voor Lilly, BioMS, Teva en Opexa Therapeutics. Op dit moment ontvangt Dr. Zamvil onderzoek financiële steun uit de NIH, NMSS, The Maisin Foundation, Biogen en Celgene.

AQP4 werd aangeduid als de primaire doelgroep in de NMO-IgG in 20053. Vervolgens werd erkend dat het belangrijk is om een AQP4-gerichte diermodel van CNS autoimmuniteit zou zijn. Een dergelijk model zou nuttig zijn te onderzoeken hoe AQP4-specifieke T en B cellen deelnemen aan de ontwikkeling van CNS autoimmuniteit en kandidaat-therapeutics testen op NMO. Hoewel identificatie van AQP4-specifieke T cel epitopen in wild-type muizen werd voor het eerst gemeld in 201013, T-cellen die reageren op deze epitopen niet door ziekte klinische en histologische14,17 veroorzaakt. Het onvermogen om het genereren van een model van CNS autoimmuniteit gebaseerd op Immuunreactiviteit te AQP4 een raadsel bleef tot 2015 wanneer Jones, et al.. 25 ontdekt dat de donor AQP4 p135-153-primer T cellen van AQP4- / - muizen waren waardoor klinische en histologische tekenen van CNS autoimmunity in WT muizen. Van belang, is AQP4 p135-153 voorspeld MHC II (ik-A-b) bindt met hoge affiniteit17. Slechts één andere AQP4 aminozuur opeenvolging, 201-220, is voorspeld dat ik-A-b met vergelijkbare hoge affiniteit binden. Inderdaad, we hebben vastgesteld dat AQP4 p135-153 en p201-220 beide ontlokken robuuste proliferatie in AQP4- / -, maar niet WT, muizen. Hier hebben wij aangetoond hoe een kunt isoleren en encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 - en p201-220-reactieve T cellen van AQP4- / - muizen uit te breiden. Wanneer overgebracht in WT ontvangende muizen, geïnduceerde donor AQP4-reactieve Th17 cellen verlamming, die werd vergezeld door mononucleaire cellen infiltreert in het ruggemerg en de oogzenuw. Afferent visuele systeem schade is bekend bij patiënten met AQP4-seropositieve NMOSD26. Hier, vastgesteld we hebben dat ontsteking van de oogzenuw geïnduceerd door AQP4-reactieve en MOG-reactieve Th17 cellen werd onderscheiden. Overwegende dat de AQP4-specifieke Th17 cellen geïnduceerde optische perineuritis, veroorzaakte MOG-specifieke Th17 cellen ernstige neuritis optica. Wij hebben ook de technieken gebruikt voor het bewaken van de oogzenuw ontsteking geïnduceerd door AQP4-specifieke en MOG-specifieke T-cellen door seriële LGO beschreven. Andere onderzoekers moeten nu zitten kundig voor toepassing van de protocollen die hier beschreven om verder te gaan van hun eigen studies gericht op pathogene mechanismen van ATCA.
Men kan gemakkelijk vermijden drie potentiële valkuilen in ons protocol. Eerste, adoptief overdracht van ATCA vereist gebruik van AQP4-specifieke T-cellen van AQP4- / - muizen van de donor. Specifiek, veroorzaakt donor WT AQP4 p135-153-specifieke T-cellen niet door ATCA in ontvangende WT muizen. Ten tweede, is het belangrijk om uit te voeren van een 'water-test' met een daling van de peptide/CFA-emulsie voor immunisatie van AQP4- / - muizen (Protocol stap 1.5). De emulsie moet niet verspreiden in water, wanneer het is geschikt voor s.c. injectie. Als de emulsie verspreidt, moet een mix van de emulsie nogmaals, chill opnieuw en herhaal de water-test. Tot slot, geactiveerde donor CNS antigeen-specifieke T-cellen veroorzaken CNS autoimmuniteit efficiënter dan rusten T-cellen. Men moet visueel inspecteren die culturen onder de lichte Microscoop vóór de oogst van de donor T cellen voor adoptief overdracht. Snel delen cellen kan vormen clusters, die gemakkelijk worden geïdentificeerd. Ook, wanneer culturen veel geactiveerde T-cellen bevatten, de media kan de overgang van roze tot oranje of zelfs tot geel, als gevolg van de afname van de pH. Een kan ook activering van donor AQP4-primer lymfeklier T cellen voor proliferatie beoordelen door 3H-thymidine opneming, zoals beschreven in stap 3 van Protocol.
Onze ontdekking dat de twee pathogene AQP4 T-cel epitopen zijn (1) voorspeld MHC II met hoge affiniteit binden en (2) ontlokken potente proliferatieve reacties in AQP4- / -, maar niet WT, muizen suggereren dat T-cellen gericht op die determinanten normaal zijn gecontroleerd door serie negatieve selectie17. De TCR-repertoires gebruikt voor erkenning van AQP4 p135-153 en p201-220 in AQP4- / - muizen zijn unieke (figuur 2), die is ook in overeenstemming met klonen schrapping gemedieerd door serie Wallenberg epitheliale cellen. Andere tolerogenic mechanismen kunnen normaal immuun reacties op AQP4 beperken. Na onze eerste verslag17, een andere groep ook aangetoond dat AQP4 p201-220 een encephalitogenic T-cel determinant27 bevat. Wanneer α/β (TCRα- / -) T-cel-deficiënte muizen werden gereconstitueerd met AQP4- / - CD4+ T cellen, was het mogelijk om het uitlokken van een reactie van encephalitogenic AQP4-specifieke T cel, maar niet een AQP4-specifieke Humorale respons, wat inhoudt dat in WT muizen AQP4-specifieke B-cel reacties, vergelijkbaar met AQP4-specifieke T cel reacties, zijn onderworpen aan negatieve selectie. Inderdaad, kan verlies van ruggenmerg axonen en RGCs, die niet was waargenomen in WT muizen met ATCA geïnduceerd door AQP4-specifieke T-cellen alleen, deelname van pathogene AQP4-specifieke antilichamen vereisen. Het is duidelijk dat Muismodellen voor AQP4-gerichte CNS autoimmuniteit evolueren blijven zal als we meer informatie met betrekking tot de mechanismen van de tolerogenic normaal gesproken controle AQP4-specifieke T cel- en B-cel-immuniteit.
Andere modellen van AQP4-gerichte CNS autoimmuniteit worden ook ontwikkelde6,16,28,29,30. Ieder kan bieden voordelen voor de studie van bepaalde aspecten die relevant voor NMO pathogenese zijn. AQP4-specifieke T-cellen zijn geïdentificeerd in WT ratten6,16,29. Die AQP4-specifieke T-cellen veroorzaakt histologische wijzigingen van CNS autoimmuniteit, maar vergelijkbaar met opmerkingen in muizen, WT rat AQP4-specifieke T-cellen niet leiden tot significante tekenen van klinische ziekte. Daarom zijn de mechanismen van tolerantie beperken van T-cel- en B-cel AQP4-specifieke immuunresponsen bij WT muizen ook operationele bij ratten. Hoe dan ook, een niet te onderschatten de kracht bij het gebruik van Muismodellen voor de studie van de mechanismen die betrokken zijn bij de pathogenese van de ziekte. De rijkdom van de knock-out, transgene en verslaggever muizen kan nuttig zijn. Het moet ook worden erkend dat verscheidene fundamentele ontdekkingen in autoimmuniteit werden gemaakt met behulp van de muis EAE modellen. Bijvoorbeeld, demonstratie dat T-cell klonen specifiek voor een zelf-antigeen kan bemiddelen auto-immuunziekte31,32, identificatie van de rol van T-cel costimulatie in autoimmuniteit33 en de ontdekking van de ontwikkelings traject voor Th17 differentiatie34 werden eerst beschreven met behulp van de muis EAE modellen. Met behulp van de muismodel van ATCA die we hebben ontwikkeld, heeft een nu de middelen om ontwikkeling en regulering van de pathogene AQP4-specifieke immuunresponsen in vivo studie die belangrijke inzichten aan NMO pathogenese gerelateerde moet zorgen.

Neuromyelitis optica (NMO) is een centraal zenuwstelsel (CNS) auto-immune inflammatoire demyeliniserende ziekte die veroorzaakt terugkerende episoden van verlamming en visuele verlies leidt tot blijvende neurologische invaliditeit1. NMO wordt momenteel beschouwd als voornamelijk een humorale auto-immune ziekte2 als het wordt geassocieerd met antilichamen (Igs) gericht op aquaporin-4 (AQP4), een water-kanaal uitgedrukt overvloedig op astrocyten3,4. CNS ontsteking is echter een voorwaarde voor CNS vermelding van AQP4 Ig5,6. Het is dus niet mogelijk om een model van de NMO door overdracht van anti-AQP4 Igs alleen geweest. De bevindingen zijn (1) pathogene AQP4-specifieke Igs bij NMO patiënten IgG11,2, een T-cel-afhankelijke Ig subklasse7 (2) T-cellen worden geïdentificeerd in NMO laesies8,9 (3) NMO is gekoppeld met bepaalde genen MHC II (bijvoorbeeld HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10, en (4) proinflammatoire AQP4-reactieve DR-beperkte Th17 cellen worden uitgevouwen in NMO patiënten11,12 alle geven dat AQP4-specifieke T-cellen hebben een sleutelrol in NMO pathogenese. Het is dus belangrijk om dierlijke modellen om te bepalen hoe AQP4-specifieke T-cellen kunnen bijdragen tot de NMO pathogenese te ontwikkelen.
Enkele jaren geleden, werden meerdere AQP4 T-cel epitopen geïdentificeerd in wild-type (WT) de muizen13,de14 en ratten15. Terwijl het werd waargenomen dat AQP4-reactieve T cellen opticospinal ontsteking in naïef ontvangende ratten15,16 induceren kunnen, belangrijke klinische symptomen van ziekte van de CNS niet zijn nageleefd. Ook directe immunisatie van WT muizen met peptiden met AQP4 T-cel epitopen14,17, of overdracht van proinflammatoire T cellen die determinanten17targeting, veroorzaakten geen klinische symptomen of histologische bewijs van CNS autoimmuniteit.
Onlangs, het werd waargenomen dat immunisatie van C57BL/6 AQP4-deficiënte (AQP4- / -) muizen met AQP4 peptide (p) 135-153 of p201-220, twee determinanten voorspeld te binden van MHC II (ik-A-b) met hoge affiniteit18, ontlokte sterke CD4 + T cel reacties17. Deze twee peptiden ontlokte daarentegen slechts bescheiden proliferatieve reacties in WT muizen. Verder was de T cel receptor (TCR) repertoire gebruikt voor erkenning van deze determinanten door T cellen van AQP4- / - muizen uniek. Gezamenlijk deze bevindingen wijzen erop dat T cel erkenning van AQP4 wordt gereguleerd door serie negatieve selectie. AQP4 p135-153 - of p201-220-specifieke Th17 cellen van AQP4- / - donor muizen geïnduceerde verlamming in bijna 100% van de naïeve ontvangende WT muizen; Dit ging gepaard met opticospinal van T cellen, B-cellen en monocyten infiltreert. Seriële opticospinal coherentie tomografie (OCT) aangetoond dynamische visuele systeem betrokkenheid. Muizen met AQP4-gerichte CNS T cellen gemedieerde autoimmuniteit (ATCA) worden verlamming en visuele systeem schade verhaald. In tegenstelling tot de EAE geïnduceerd door myeline Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) p35-55-specifieke T-cellen, die hebben geleid tot aanhoudende klinische ziekte, was ATCA geïnduceerd door T cellen alleen niet geassocieerd met axonale verlies of vermindering in netvlies peesknoopcellen (RGCs). Onze resultaten hebben duidelijk aangetoond dat er meerdere pathogene AQP4 T cel determinanten zijn. Dit nieuwe model van ATCA is nuttig voor het bestuderen van mechanismen beheersen van de ontwikkeling van pathogene AQP4-specifieke T-cellen, leren hoe die cellen veroorzaken CNS ontsteking en hoe kunnen zij samenwerken met AQP4-specifieke B-cellen en antilichamen ter bevordering van de NMO pathogenese .
In het onderhavige verslag beschrijven we de protocollen gebruikt om te induceren en evalueren van T-cel-geïnduceerde ATCA. We beginnen met de technieken die worden gebruikt voor immunisatie, T celkweek en Th17 polarisatie voor het genereren van pathogene AQP4-specifieke T-cellen, stroom cytometry analyse te bevestigen van polarisatie en adoptief overdracht van deze T-cellen. Vervolgens beschrijven we methodes voor de evaluatie van de klinische en histologische ziekte en het gebruik van seriële LGO te controleren visuele systeem schade in ontvangende muizen.

<table><tbody><tr><td>M. tuberculosis H37Ra</td><td>BD Difco</td><td>231141</td><td>Gedroogde, gedode M. tuberculosis</td></tr><tr><td>Incomplete Freund's Adjuvant</td><td>BD Difco</td><td>263910</td><td></td></tr><tr><td>AQP4 peptide p135-153</td><td>Genemed</td><td>Custom Synthesis</td><td>Peptidesequentie: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN</td></tr><tr><td>AQP4 peptide p201-220</td><td>Genemed</td><td>Custom Synthesis</td><td>Peptidesequentie: HLFAINYTGASMNPARSFGP</td></tr><tr><td>MOG peptide p35-55</td><td>Genemed / Auspep</td><td>Custom Synthesis</td><td>Peptidesequentie: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td></tr><tr><td>3-way Stopcock</td><td>Kimble</td><td>420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fetal Bovine Serum (Gekarakteriseerd)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Muis IL-23</td><td>R&amp;D Systems (BioTechne)</td><td>1887-ML</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Muis IL-6</td><td>R&amp;D Systems (BioTechne)</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Muis IL-12</td><td>R&amp;D Systems (BioTechne)</td><td>419-ML</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine [Methyl-3H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET027</td><td></td></tr><tr><td>Glass Fiber Filtermats</td><td>PerkinElmer</td><td>1450-421</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis antilichamen</td><td>eBioscience (Affymetrix)</td><td>[various]</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis TCR V&beta; Screening Panel</td><td>BD Biosciences</td><td>557004</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>[various]</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16%)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Fixatie/Permeabilisatie Oplossing Kit met GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Iomomycin (calciumzout)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Pertussis Toxine van B. pertussis</td><td>List Biological Laboratories</td><td>181</td><td></td></tr><tr><td>10% Formaline</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td></td></tr><tr><td>Variabele-Flow Peristaltische Pomp</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td></td></tr><tr><td>Foam Biopsy Pads, Rechthoekig</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-221</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia (isofluraan, USP)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>050033</td><td>NDC : 11695-0500-2</td></tr><tr><td>Tropicamide Ophthalmisch Oplossing, USP (1%)</td><td>Akorn</td><td></td><td>NDC: 17478-102-12</td></tr><tr><td>Spectralis Diagnostisch Beeldvorming Platform</td><td>Heidelberg Engineering</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inductie van verlamming en visuele systeem schade in muizen door t cellen specifiek voor neuromyelitis optica autoantigen aquaporin-4

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Hoewel wordt erkend dat aquaporin-4 (AQP4)-specifieke T-cellen en antilichamen deelnemen in de pathogenese van neuromyelitis optica (NMO), een menselijke centrale zenuwstelsel (CNS) demyeliniserende auto-immuunziekte, de oprichting van een AQP4-gerichte model met beide klinische en histologische uitingen van CNS autoimmuniteit uitdagende heeft bewezen. Immunisatie van wild-type (WT) muizen met AQP4 peptiden ontlokte T-celproliferatie, hoewel die T-cellen niet ziekte naar naïef ontvangende muizen kunnen worden overgebracht. Onlangs, twee roman AQP4 T-cel epitopen, peptide (p) 135-153 en p201-220, werden geïdentificeerd als immuun reacties op AQP4 in AQP4-deficiënte (AQP4- / -) muizen, suggereren T cel reactiviteit aan deze epitopen studeren wordt normaal bestuurd door serie negatieve selectie. AQP4- / - Th17 gepolariseerde T cellen gevuld tot p135-153 of p201-220 geïnduceerde verlamming in ontvangende WT muizen, die werd geassocieerd met overwegend leptomeningeale ontsteking van het ruggenmerg en de optische zenuwen. Ontsteking omliggende optische zenuwen en betrokkenheid van de binnenste retinale lagen (IRL) waren gemanifesteerd door veranderingen in seriële optische coherentie tomografie (OCT). Hier, illustreren we de benaderingen die zijn gebruikt voor het maken van dit nieuwe in vivo model van AQP4-gerichte CNS autoimmuniteit (ATCA), die nu kan worden gebruikt om te bestuderen van de mechanismen waarmee de ontwikkeling van pathogene AQP4-specifieke T-cellen en hoe kunnen zij samenwerken met B cellen in NMO pathogenese.

In dit protocol gebruikten we donor T cellen uit C57BL/6 AQP4- / - muizen. Subcutane immunisatie van deze muizen met AQP4 p135-153 of p201-220, die pathogene T-cel epitopen bevatten, ontlokte sterke proliferatieve T cel reacties in zuig lymfklieren (Figuur 1), overwegende dat deze twee peptiden veel zwakkere T-cel veroorzaakte proliferatie in WT muizen. In vergelijking, immunisatie met AQP4 p91-110, met een niet-pathogene AQP4 T cel determinant13, of MOG p35-55, een myeline-peptide dat activeert T-cellen waardoor experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE)22,23 ,24, geïnduceerde vergelijkbare omvang van T-celproliferatie in AQP4- /- en WT muizen. Analyse van TCR-gebruik door stroom cytometry kleuring voor individuele Vβ van of Vβ gezinnen, aangetoond dat p135-153 - en p201-220-specifieke T-cellen van AQP4- / - muizen gebruikt unieke TCR-repertoires. Selectieve hyper-proliferatie van AQP4 p135-153 en p201-220 in AQP4- / - muizen, evenals het unieke TCR gebruik (Figuur 2), aangegeven dat pathogene T cel reacties op deze determinanten gewoonlijk wordt gereguleerd door serie negatief selectie, onderstrepen het belang voor het gebruik van AQP4- / - donor T cellen in dit protocol.
Vóór adoptief overdracht voor inductie van ATCA, werden lymfeklier cellen van AQP4 peptide-primer muizen gekweekt in vitro in Th17 - of Th1-polariserende voorwaarden voor drie dagen. De mate van polarisatie van donor CD4+ T cellen werd bevestigd door intracellulaire cytokine kleuring (ICS) en gemeten door stroom cytometry (Figuur 3). Naïef ontvangende muizen werden intraveneus ingespoten met 2 x 107 donor AQP4 peptide-specifieke T-cellen. Na ongeveer zes dagen ontwikkelde bijna 100% van de ontvangende muizen klinische symptomen van CNS auto-immune ziekte, met inbegrip van slappe staart en hind-limb verlamming (Figuur 4). AQP4-specifieke T-cellen Th17-gepolariseerde geïnduceerde meer ernstige klinische ziekte dan Th1-gepolariseerde AQP4-specifieke T-cellen. Een representatieve muis die ontvangen Th17 AQP4-peptide-specifieke en volledige hind-limb verlamming (dwarslaesie) ontwikkeld wordt weergegeven in de Video 1. In tegenstelling tot de muizen die ontwikkeld EAE na toediening van de MOG-specifieke Th17 cellen, ontvangende muizen van klinische ziekte geïnduceerd door AQP4-specifieke Th17 cellen hersteld. Wat betreft de EAE geïnduceerd door MOG p35-55-specifieke Th17 cellen, klinische ziekte veroorzaakt door AQP4 p135-153-specifieke of p201-220-specifieke Th17 cellen werd geassocieerd met de infiltratie van mononucleaire cellen in het CNS parenchym en hersenvliezen (Figuur 5). Laesies waren meer overvloedig in de hersenvliezen dan in het parenchym voor CNS autoimmuniteit geïnduceerd door AQP4-specifieke Th17 cellen.
Optic nerve betrokkenheid werd aangetoond door histologische evaluatie en door seriële OCT. AQP4-specifieke en MOG-specifieke Th17 cellen beide geïnduceerde oogzenuw ontsteking, die werd gekenmerkt door de aanwezigheid van mononucleaire cellen. Overwegende dat de AQP4-specifieke Th17 cellen veroorzaakt optische perineuritis, veroorzaakte MOG-specifieke Th17 cellen ernstige neuritis optica (Figuur 5). Met behulp van seriële OCT, oogzenuw ontsteking bleek door zwelling en verhoogde innerlijke netvlies (IRL) laagdikte voor klinische ziekte veroorzaakt door AQP4-specifieke of MOG-specifieke Th17 cellen (Figuur 6). Voor CNS AQP4 Th17-geïnduceerde auto-immuniteit, IRL dikte keerde terug naar basislijn als muizen van klinische ziekte hersteld. In tegenstelling, persistentie van EAE geïnduceerd door MOG-specifieke Th17 correspondeerde met IRL dunner en, zoals we eerder17 blijkt, werd geassocieerd met verlies van retinale peesknoopcellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig1.jpg"> 
Figuur 1 : AQP4 p135-153 en p201-220 ontlokken robuuste T-celproliferatie in AQP4- / - muizen, maar niet WT muizen. Muizen werden geïmmuniseerd s.c. met de aangegeven peptiden in CFA. Elf dagen later, waren lymfklieren verwijderd, en vervolgens gekweekt met ofwel geen antigeen of met de peptide gebruikt voor immunisatie. Proliferatie werd gemeten door 3H-thymidine opneming (gemiddelde ± SEM, vertegenwoordiger van 5 experimenten). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig2.jpg"> 
Figuur 2 : AQP4-specifieke T-cellen van AQP4- / - muizen gebruiken unieke TCR-repertoires. AQP4- /- en WT muizen werden geïmmuniseerd met de aangegeven peptiden. Elf dagen later, waren de lymfklieren verwijderd en gekweekt met peptide gebruikt voor immunisatie. Cellen zijn geoogst. TCR Vβ gebruik werd geanalyseerd door stroom cytometry (bedoel ± SEM, n = 5). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig3.jpg"> 
Figuur 3 : Proinflammatoire polarisatie van donor AQP4-specifieke T-cellen. Elf dagen na immunisatie met AQP4 p135-153 of p201-220, werden lymfeklier cellen geoogst en gekweekt met de peptide gebruikt voor immunisatie in niet-polariserende voorwaarden, Th1 - of Th17-polariserende. Th17 of Th1 polarisatie werd onderzocht door ICS en stroom cytometry voor IL-17 of IFN-γ, respectievelijk. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig4.jpg"> 
Figuur 4 : Th17-gepolariseerde AQP4-specifieke T-cellen veroorzaken verlamming in WT ontvangende muizen. WT ontvangende muizen ontvangen 2 x 107 donor Th17-gepolariseerde AQP4 p135-153 of p201-220-specifieke T-cellen AQP4- / - muizen. MOG-specifieke T-cellen Th17-gepolariseerde diende als positieve controle. Resultaten representatief zijn voor 8 experimenten (n = 5/groep). * p &#60; 0,05, ** p &#60; 0,01, *** p &#60; 0,001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig5.jpg"> 
Figuur 5 : AQP4-specifieke Th17 cellen induceren opticospinal ontsteking in WT muizen. Ontvangende muizen ontvangen 2 x 107 Th17 AQP4 donor p135-153 - of p201-220-primer Th17 cellen van AQP4- / - muizen of Th17 MOG p35-55-specifieke cellen en 10 dagen later werden geofferd. Ruggenmerg en oogzenuw weefsels waren voorbereid en gekleurd met H &#38; E/LFB te evalueren voor bewijs van ontsteking en demyelinisatie, respectievelijk. Resultaten zijn representatief voor 5 muizen/groep. Schaal bar = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig6.jpg"> 
Figuur 6 : Ontsteking van de oogzenuw geïnduceerd door AQP4-specifieke Th17 cellen kan worden gecontroleerd door de longitudinale retinale oktober WT ontvangende muizen ontvangen 2 x 107 donor Th17-gepolariseerde AQP4 p201-220-specifieke of MOG p35-55-specifieke T-cellen op dag 0. Ze werden onderzocht door LGO op dag 0 (vóór administratie van T-cellen) en klik vervolgens op dagen 4, 7, 8, 9-10, 11 14 en 21. IRL dikte was gemeten (gemiddelde ± SEM). Statistieken tonen aan dat een vergelijking met naïef controle. Resultaten zijn representatief voor 3 experimenten (5 muizen/group). * p &#60; 0,05, ** p &#60; 0,01, *** p &#60; 0,001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Hier presenteren we een protocol om te veroorzaken verlamming en opticospinal ontsteking door overdracht van aquaporin-4 (AQP4)-specifieke T-cellen van de AQP4- / - muizen in WT muizen. Daarnaast tonen we hoe met seriële optische coherentie tomografie controleren visuele systeem dysfunctie.

Inductie van verlamming en visuele systeem schade in muizen door T cellen specifiek voor Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

De algemene doelstellingen van dit protocol zijn het induceren van een auto-immuunziekte van het centraal zenuwstelsel (CZS) door adoptieve transfer van aquaporine 4-specifieke T-cellen, en het monitoren van de resulterende effecten op het CZS en het dynamische visuele systeem. Deze methode zal helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de rol van T-cellen die specifiek zijn voor aquaporine 4, algemeen bekend als AQP4, bij neuromyelitis optica en andere inflammatoire visuele aandoeningen. Het belangrijkste voordeel van optische coherentietomografie is de mogelijkheid om retinaal letsel op een niet-invasieve manier longitudinaal te monitoren.De procedure wordt gedemonstreerd door Sharon Sagan, een onderzoeksmedewerker in mijn laboratorium, samen met Andreas Cruz Harans, een fellow in het laboratorium van RE Green. Begin met het bevestigen van een nylon driewegkraan met twee mannelijke Luer-lockverbindingen aan een glazen Luer-lockspuit zonder zuiger. Zet de hendel van de kraan richting de spuit om de kraan te sluiten en positioneer de spuit met de open zijde naar boven.Voeg na het vortexen een gelijk volume peptide en Complete Freund's Adjuvant-oplossing toe aan de spuit en plaats de glazen zuiger opnieuw in de spuit. Houd de zuiger op zijn plaats, keer de spuit om zodat de stopkraan naar boven wijst en schakel de hendel naar de ongebruikte female-verbinding. Druk de zuiger voorzichtig in om de overtollige lucht uit de spuit te verwijderen.De oplossing zal de tweede mannelijke Luer-lockaansluiting van de stopkraan vullen. Bevestig vervolgens een tweede glazen spuit met de zuiger volledig ingevoerd aan de tweede mannelijke Luer-lockaansluiting. Om een emulsie te creëren, worden de zuigers afwisselend ingedrukt om de oplossing gedurende ongeveer twee minuten tussen de twee spuiten heen en weer te bewegen, waarna de oplossing ongeveer 10 minuten wordt gekoeld tot er een zichtbare verandering in de viscositeit van de oplossing optreedt.Wanneer er een zeer stijve witte emulsie wordt gevormd, brengt u de gehele oplossing over in een van de spuiten en vervangt u de lege spuit door een nieuwe Luer-lockspuit van één millimeter. Vul de nieuwe spuit met de emulsie. Verwijder de spuit uit de stopkraan en bevestig een naald van 25 gauge.Om de emulsie op consistentie te testen met water, wordt een druppel van de emulsie in een klein schaaltje water gespoten. Als de emulsie niet disperseert, is deze geschikt voor injectie. Injecteer vervolgens elke donor AQP4-knockoutmuis één keer subcutaan aan weerszijden van de onderbuik en aan weerszijden van de borstwand, mediaal van de oksel.Maak 10 tot 12 dagen na de immunisatie een mediane incisie in de huid van de lies tot de nek, en langs elk achterpootje van de eerste muis. Trek de huid weg van het peritoneum en bevestig deze stevig aan de plank. Oogst vervolgens de inguinale en axillaire lymfeklieren en plaats de weefsels in een cellenzeef in een petrischaal met compleet medium.Wanneer alle lymfeklieren zijn verzameld, plaatst u de celzeef op een conische buis van 50 milliliter met vers compleet medium op ijs en gebruikt u het platte uiteinde van een steriele zuiger van een spuit van vijf milliliter om de lymfekliercellen door het filtergaas te drukken. Spoel het gaas met 20 tot 30 milliliter compleet medium om het herstel van de cellen te vergemakkelijken, gevolgd door twee centrifugatie-wasbeurten. Resuspendeer na de tweede centrifugatie de pellet in T-celmedium voor het tellen.Voeg de juiste concentraties antigeen, recombinant muis interleukine 23 en recombinant muis IL-6 toe aan de cellen, en voeg per put twee milliliter van deze Th17-polarisatiemenging met cellen toe aan elke put van een 12-well plaat. Plaats de plaat vervolgens gedurende 72 uur in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2. Tritureer op de derde dag van de polarisatie de culturen in elke put enkele keren om de gepolariseerde cellen los te maken, en verzamel deze op ijs in een conische koker van 50 milliliter voor het tellen.Na twee wasbeurten in PBS worden de cellen verdund tot een concentratie van 1 x 10⁸ cellen per milliliter in PBS, waarna de celsuspensie voorzichtig wordt gemengd door te wervelen. Binnen één uur na collectie worden de cellen overgebracht naar een spuit van één milliliter, waarna 200 µL cellen intraveneus via de staartvin aan elk ontvangend dier wordt toegediend. Injecteer vervolgens elke muis intraperitoneaal, onmiddellijk en twee dagen later, met 200 ng B-pertussistoxine verdund in 200 µL PBS.Voor in vivo retinale beeldvorming van de ontvangende dieren via optische coherentietomografie, moeten vijf minuten vóór de beeldvorming de pupillen worden geweid met één druppel 1% tropicamide per oog, en moet de warmtemat worden ingeschakeld. Plaats de muis op de beeldvormingscilinder en stuur de anesthesiestroom dienovereenkomstig om. Bescherm de ogen met 0,3% hydroxypropylmethylcellulose om ze vochtig te houden en om de continuïteit van de refractie te waarborgen, en plaats een op maat gemaakte contactlens op het te onderzoeken oog.Richt de laser, geleid door het infraroodfundusbeeld, op het oog met de contactlens en zorg dat de straal gecentreerd is op de papilschijf. Voer 25 B-scans uit in resolutiemodus 'high resolution' en rasteriseer de beelden op basis van 30 gemiddelde A-scans. Vervang na het beeldvormen van beide ogen de contactlens door ooghealgel en plaats de muis in een warme herstelkooi.Om de verkregen beelden te analyseren met de modulaire imaging-software voor geautomatiseerde segmentatie, moeten eerst handmatig de segmenten die overeenkomen met de inner limiting membrane en de inner plexiform layer worden gecorrigeerd om de grenzen van de binnenste retinale lagen weer te geven. Verifieer vervolgens of de retinal nerve fiber- en ganglioncellagen zich binnen de grenzen van de binnenste retinale laag bevinden en of ze elkaar niet overlappen. Subcutane immunisatie met AQP4-peptiden die pathogene T-cel-epitopen bevatten, roept sterke proliferatieve T-celresponsen op in de drainerende lymfeklieren van AQP4-knockout-muizen vergeleken met T-celresponsen bij wild-type muizen.Flowcytometrische analyses van individuele V-beta-expressie tonen aan dat T-cellen specifiek voor AQP4-peptiden die pathogene T-cel-epitopen bevatten, unieke TCR-repertoires gebruiken en een selectieve hyperproliferatie vertonen, wat aangeeft dat pathogene T-celresponsen op deze determinanten normaal gesproken worden gereguleerd door thymische negatieve selectie. Ongeveer zes tot negen dagen na injectie van gepolariseerde T-cellen ontwikkelden bijna alle ontvanger-muizen klinische tekenen van autoimmune ziekte van het CZS, waaronder een slap staartje en verlamming van de achterpoten. Hierbij induceerden Th17-gepolariseerde AQP4-specifieke T-cellen een ernstiger klinisch ziektebeeld dan Th1-gepolariseerde AQP4-specifieke T-cellen.Bijvoorbeeld, deze muis ontwikkelde volledige verlamming van de achterpoten na toediening van Th17-gepolariseerde AQP4-peptide-specifieke T-cellen. Klinische ziekte geïnduceerd door AQP4-peptide-specifieke Th17-cellen is ook geassocieerd met een infiltratie van mononucleaire cellen in het CNS-parenchym en de meninges, evenals ontsteking van de oogzenuw, wat verder wordt aangetoond door een zwelling en toegenomen dikte van de binnenste retinale laag die terugkeert naar de basislijn naarmate de muizen herstellen van de ziekte. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u AQP4-gerichte auto-immuniteit kunt induceren en monitoren, wat verdere studie mogelijk maakt om te begrijpen hoe T-cellen deelnemen aan neuromyelitis optica.

induction-paralysis-visual-system-injury-mice-t-cells-specific-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

The video demonstrates the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in a mouse model by injecting a combination of myelin oligodendrocyte glycoproteins and inactivated Mycobacterium tuberculosis. The model enables researchers to study disease mechanisms and test therapeutic interventions.

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in a Mouse Model

This video demonstrates the method of inducing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) by injecting myelin-derived peptides with an adjuvant to activate autoreactive T cells, which migrate to the brain. Pertussis toxin is administered to increase blood-brain barrier permeability, allowing these T cells and other immune cells to enter the brain. These immune cells cause demyelination, leading to impaired nerve transmission and development of EAE.

Generation of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in a Mouse Model

In this video, a mouse model of multiple sclerosis is established using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The mouse is injected with an emulsion containing a neuronal peptide and an adjuvant, triggering an immune response that activates autoreactive T cells. This is followed by an injection of pertussis toxin (PTX) to increase blood-brain barrier permeability, allowing the autoreactive T-cells to infiltrate the brain. This infiltration initiates a signaling cascade that...

This video demonstrates the procedure of inducing paralysis by transferring activated Th17 cells targeting aquaporin-4 into a mouse model. In the central nervous system, the activated Th17 cells interact with aquaporin-4-expressing astrocytes, triggering an immune response that leads to tail and limb paralysis in the mouse.

Inducing Paralysis in a Mouse Model via Transfer of Aquaporin-4-Specific Th17 Cells

This video demonstrates the process of assessing motor dysfunction in a mouse model through the administration of Pertussis toxin and an inoculum containing myelin-mimicking peptides and adjuvants, followed by treadmill tests to assess motor function and evaluate the resulting nerve damage due to immune activation and demyelination.

Assessing Motor Function in an Experimental Autoimmune Neuritis Mouse Model

We beschrijven een methode voor het implanteren en onderhouden van glazen ramen over de blootgestelde ruggenmerg van volwassen muizen voor het bestuderen van experimentele auto-immuun encefalomyelitis. Deze ramen bieden chronische optische toegang tot het ruggenmerg voor het monitoren van celdynamica op subcellulair niveau in levende dieren met behulp van twee-foton microscopie.

Implantatie van glazen ruggenmergvensters bij volwassen muizen met experimentele auto-immuun encefalomyelitis

Dit manuscript beschrijft de methoden voor inductie en scoren van het experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE) model, samen met de beoordeling van immuunceldistributie en mRNA-cytokineniveaus in lymfeklieren, milt, bloed en ruggenmerg met behulp van flowcytometrie en kwantitatieve PCR, respectievelijk, in verschillende fasen van de ziekte.

Inductie van experimentele auto-immune Encefalomyelitis in Muizen en evaluatie van de ziekte-afhankelijke Verdeling van immuuncellen in verschillende weefsels

Dit verslag schetst een eenvoudige benadering om succesvol experimentele autoimmune neuritis (EAN) met behulp van de myeline proteïne nul peptide180-199 (P0) in combinatie met de Freund compleet adjuvans en kinkhoest toxine. We presenteren een verfijnde paradigma staat nauwkeurig de beoordeling van de omvang van functionele tekorten en Neuropathologie die zich voordoen in deze EAN.

Een eenvoudige benadering voor het opwekken van experimentele Autoimmune Neuritis in C57BL/6 muizen voor functionele en neuropathologische evaluaties

Cel-gebaseerde bepaling is een veel gebruikte methode om te detecteren serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. Deze methode kan worden toegepast op de klinische diagnose en wetenschappelijk onderzoek van neuromyelitis optisch spectrum stoornissen.

Menselijk Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G detectie van cel-gebaseerde Assay

Het huidige protocol beschrijft de inductie van experimentele auto-immune encefalomyelitis in een muismodel met behulp van myeline oligodendrocytenglycoproteïne en het monitoren van het ziekteproces met behulp van een klinisch scoresysteem. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis-gerelateerde symptomen worden geanalyseerd met behulp van muis femur micro-computertomografie analyse en open veld test om het ziekteproces uitgebreid te beoordelen.

Inductie- en diverse beoordelingsindicatoren van experimentele auto-immuun encefalomyelitis

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een diermodel van multiple sclerose (MS), dat met de menselijke ziekte een robuuste humorale auto-immuunrespons deelt. Hier rapporteren we een eenvoudig en flexibel ELISA-protocol om auto-antilichamen in het serum van EAE-geïmmuniseerde muizen te kwantificeren.

Kwantificering van autoreactieve antilichamen bij muizen bij experimentele auto-immuunencefalomyelitis

Leer adoptieve overdracht van AQP4-specifieke T-cellen om CNS-auto-immuunziekte bij muizen te induceren en optische coherentietomografie toe te passen voor niet-invasieve monitoring van retinale schade.

Inductie van verlamming en visuele systeem schade in muizen door T cellen specifiek voor Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4 (Video) | JoVE Journal

Inductie van verlamming en visuele systeem schade in muizen door T cellen specifiek voor Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Meer video's verkennen