Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) Protocol voor lage-overvloed embryonale monsters
29 augustus 2017
Hier beschrijven we een chromatine immunoprecipitation (ChIP) en ChIP-seq de protocol van de voorbereiding van de bibliotheek voor het genereren van wereldwijde epigenomic profielen van lage-overvloed kip embryonale monsters.
Het algemene doel van deze procedure is om de bindingsprofielen van verschillende histonmodificaties te onderzoeken, met behulp van laag-abundantie embryonale monsters om de functionele annotatie van gewervelde genomen te verbeteren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de ontwikkelingsbiologie te beantwoorden, zoals welke de belangrijkste enhancers en genen zijn die de identiteit van een bepaald embryonaal weefsel bepalen. De belangrijkste voordelen van deze technieken zijn dat het een beperkte hoeveelheid specifiek materiaal vereist en het kan ook worden gebruikt voor zowel lokale specifieke als genoombrede analyse.
Hoewel deze methode inzichten kan bieden in transcriptieregulatie of cellulaire heterogeniteit met de embryonale weefsels, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals, octrooimonsters. Om de HH19-stadium, kippenembryo's voor dit experiment te verkrijgen, incubeer vruchtbare witte Leghorn-henneneieren in horizontale oriëntatie bij 37 graden Celsius en 80% luchtvochtigheid gedurende drie dagen. Om te beginnen met het isoleren van de HH19-embryo's, maak ze toegankelijk door drie milliliter albumine te extraheren met een 10 millimeter spuit om de blastoderm te verlagen.
Om extra embryonale membranen te verwijderen, gebruik fijne schaar om een kleine opening in het oog te maken. Voeg een milliliter slotoplossing toe. Met behulp van een gebogen naald, voeg 0,5 milliliter Indiase zwarte inkt toe.
Gebruik fijne chirurgische schaar en pincetten om het extra embryonale membraan dat het embryo omringt af te snijden. Breng vervolgens het embryo met een geperforeerde lepel over naar een 4,5 centimeter petrischaal bevattende 20 milliliter PBS-oplossing. Werkend op ijs onder een stereomicroscoop, gebruik fijne schaar en pincetten om het amnion en de resterende delen van het extra embryonale membraan te disseceren en weg te gooien.
Snijd vervolgens de transversale spinale neurobuis of SNT-segment op het brachiale niveau van het embryo. Verleng de dissectie caudaal in de thoracale regio om de SNT te isoleren. Om te eindigen, gebruik pincetten om de weefsels die lateraal en ventraal de SNT omringen te verwijderen.
Na het isoleren van SNT's, dompel elk segment in een 3,5 centimeter petrischaal bevattende 37 graden Celsius warme trypsine. Wanneer het losmaken van de niet-neuro weefsels rond de SNT zichtbaar is onder een stereomicroscoop, breng de monsters over in koud 1x PBS. Om de trypsinisatie te stoppen, breng de monsters over in een nieuwe schaal met koud DMEM bevattend 10%FBS.
Gebruik pincetten om de resterende mesenchymale en ectodermische weefsels handmatig van de SNT te verwijderen. Breng deze schone SNT-sectie over in een 1,5 milliliter buis en bevries deze snel in vloeibare stikstof. Homogeniseer vervolgens het weefsel volgens het tekstprotocol.
Voeg 13,5 microliter 37% formaldehyde toe en incubeer op kamertemperatuur op een rotator gedurende 15 minuten. Om het formaldehyde te doven, voeg 25 microliter 2,5 molair glycine toe aan de buis en incubeer op kamertemperatuur op een rotator gedurende 10 minuten. Centrifugeer de buis en was vervolgens het pellet volgens het tekstprotocol.
Na crosslinking, suspendeer het pellet opnieuw in 300 microliter ijskoud, volledige lysisbuffer door te pipetteren. Incubeer de monsters bij vier graden Celsius op een schuddende platform gedurende 10 minuten. Soniceer vervolgens de monsters bij vier graden Celsius.
Na sonicatie, centrifugeer de monsters bij 16.000 x G bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng het supernatant of lysate over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis en gooi de cellulaire debrispellet weg. Verdun het lysate volgens het tekstprotocol.
Houd vervolgens een kleine aliquot van elk monster als inputcontrole en bevries deze bij 20 graden Celsius. Incubeer de resterende monsters die zullen worden onderworpen aan chromatineprecipitatie of chip met geschikte antilichamen volgens het tekstprotocol. Voeg vervolgens 300 microliter antilichaamgebonden chromatine toe aan eerder gewassen magnetische kralen.
Keer de buizen om de monsters te mengen. Om de antilichamen aan de kralen te binden, plaats de buizen op een buisrotator en draai verticaal bij vier graden Celsius gedurende minimaal vier uur. Om de chromatine gebonden kralen te wassen, voeg een milliliter ijskoud RIPA-wasbuffer toe aan de buis gehouden op ijs en meng door de buis te keren of te schudden.
Nadat de buis in de magnetische houder bij kamertemperatuur is geplaatst, wacht tot de kralen zich aan de zijkant hebben gesetteld. Giet het heldere vocht weg en herhaal deze wassing nog drie keer. Na het toevoegen van een milliliter TE 50 millimolar natriumchloride aan de buis, breng de chromatine gebonden kralen in deze oplossing over naar een nieuwe 1,5 millimeter microcentrifugebuis.
Plaats de buis in de magnetische houder en wanneer de kralen zich hebben gesetteld, giet het vocht weg. Centrifugeer vervolgens de kralen bij 900 x G bij vier graden Celsius gedurende drie minuten in een voorgekoelde centrifuge. Nadat de kralen in de magnetische houder zijn gesetteld, verwijder al het resterende TE met een gellaadtip.
Werkend op kamertemperatuur, voeg 210 microliter elutiebuffer toe aan de kralen en suspendeer door te klappen. Incubeer de buis in een voorverwarmde hitteblok bij 65 graden Celsius gedurende 15 minuten, terwijl geroerd. Na incubatie, centrifugeer de buizen met de kralen bij 16.000 x G bij kamertemperatuur gedurende één minuut.
Zodra de kralen zich in de magnetische houder hebben gesetteld, breng het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Ontdooi het eerder bevroren inputcontrolemonster van 20 graden Celsius tot kamertemperatuur. Voeg 90 microliter elutiebuffer toe aan het monster en meng door kortdurend te vortexen.
Om de crosslinks te reverseren, incubeer de chip- en controlemonsters bij 65 graden Celsius overnacht. Werkend op kamertemperatuur, voeg een volume TE-buffer per buis toe en draai om te mengen. Om het RNA te verteren, voeg RNAse A toe aan de controle- en chipmonsters tot een uiteindelijke concentratie van 0,2
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) en de bereiding van een ChIP-seq-bibliotheek, ontworpen voor het genereren van globale epigenomische profielen uit kiembelastende monsters van kiemembryo's met een lage abundantie. De methode is erop gericht de bindingsprofielen van histonmodificaties te verduidelijken om de functionele annotatie van gewervelde genomen te verbeteren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Epigenomica
- Genomische profilering
Achtergrond
- Onderzoekt bindingsprofielen van histonmodificaties.
- Maakt gebruik van embryonale monsters met een lage abundantie.
- Heeft als doel de functionele annotatie van vertebratengenomen te verbeteren.
- Kan worden toegepast op diverse biologische systemen.
Doel van de studie
- Identificeer belangrijke enhancers en genen in embryonale weefsels.
- Bied inzicht in transcriptieregulatie.
- Verken cellulaire heterogeniteit in embryonale weefsels.
Gebruikte methoden
- Protocol voor de bereiding van ChIP- en ChIP-seq-bibliotheken.
- Isolatie van HH19 kippenembryo's uit vruchtbare eieren.
- Incubatie van eieren bij een specifieke temperatuur en vochtigheid.
- Extractie van albumine om toegang te krijgen tot de blastoderm.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van epigenomische profielen uit monsters met een lage abundantie.
- Verbeterd begrip van de binding van histonmodificaties.
- Inzichten in de identiteit van embryonale weefsels.
- Potentiële toepassingen in andere biologische systemen.
Conclusies
- De methode is effectief voor het analyseren van embryonale weefsels.
- Er is slechts een beperkte hoeveelheid materiaal nodig, waardoor de methode toegankelijk is voor diverse studies.
- Het kan bijdragen aan vorderingen in het onderzoek naar ontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Dit ChIP-protocol maakt epigenetische profilering van embryonale weefsels met een lage abundantie mogelijk, wat doelwitvalidatie in vroege discovery ondersteunt door histonmodificaties te koppelen aan genregulerende netwerken. Het vermindert de vereisten voor de hoeveelheid monsterinput, waardoor mechanistisch relevante ziektemodellen toegankelijk worden voor preklinische risicoreductie. De methode vergroot het voorspellend vertrouwen bij het identificeren van therapeutische doelwitten via kwantitatieve epigenomische mapping.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door histonmodificatiepatronen in kaart te brengen bij enhancers en promotoren die de identiteit van embryonaal weefsel bepalen.
- Operationele waarde: Maakt functionele doelwitvalidatie mogelijk met behulp van beperkte primaire weefselmonsters uit ontwikkelingsmodellen die relevant zijn voor ziekten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door epigenetische toestanden te correleren met genexpressieprogramma's in vroege ontwikkelingspaden.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gestandaardiseerde chromatine-inputs voor voor reproduceerbare antilichaam-gebaseerde pulldown-assays voor histonmodificaties.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve ChIP-qPCR-resultaten voor het beoordelen van verrijkingsniveaus op specifieke loci, wat assay-optimalisatie mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Compatibel met de preparatie van ChIP-seq-bibliotheken, wat opschaling naar genoombrede epigenomische screening in low-input-systemen mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Levert ziekterelevante epigenetische kaarten van embryonale weefsels die vroege pathogene toestanden bij ontwikkelingsstoornissen weerspiegelen.
- Operationele waarde: Waarborgt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door vergelijkbare epigenomische profielen te genereren over verschillende modelsystemen heen.
- Risicobeheersing: Maakt mechanisme-gebaseerde go/no-go-beslissingen mogelijk door target-engagement te evalueren via veranderingen in histonmodificaties in toegankelijke weefsels.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing in de vroege biologie tot lead-identificatie via epigenetische biomarker-uitlijning, ter ondersteuning van datagestuurde beslissingen over verdere ontwikkeling.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door histonmodificaties te koppelen aan enhanceractiviteit bij weefselspecifieke genregulatie.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk door optimalisatie van sonicatie en validatie van de inputcontrole voor reproduceerbare immunoprecipitatie.
- Analytiek: Levert kwantitatieve DNA-terugwinning en verrijkingsmetingen waarmee de dynamiek van histonmarkeringen tussen verschillende condities kan worden vergeleken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door epigenomische profielen te genereren die toepasbaar zijn op humane modellen voor ontwikkelingsziekten.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbare low-input ChIP-workflow voor epigenetische screening in meerdere embryonale en volwassen weefsels.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in genreguleringsnetwerken te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde stappen voor crosslinking, sonicatie en immunoprecipitatie.
- Strategische waarde: Verhoogt de kapitaalefficiëntie door epigenomische analyse vanuit beperkte, kostbare monsters mogelijk te maken, waardoor de noodzaak voor uitgebreide materiaalexpansie afneemt.
- Impact op portfolio: Informeert risicogecorrigeerde prioritering door epigenetisch gedisreguleerde loci te identificeren die gekoppeld zijn aan pathogene routes.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in weefseldissectie, optimalisatie van crosslinking en het afstemmen van sonicatieparameters voor monsters met een lage input.
- Toegang tot magnetische separatieapparatuur, rotators en warmteblokken is noodzakelijk voor efficiënte immunoprecipitatie- en reversiestappen.
- Standaardprotocollen voor antilichaamvalidatie en titratie zijn vereist om specifieke chromatin pulldown over histonmerktekens te garanderen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij uitbreiding naar volwassen weefsels of primaire menselijke monsters met variërende chromatin-toegankelijkheid.
- Bevat praktische beperkingen met betrekking tot achtergrondsignalen afkomstig van heterogene celpopulaties in gedissecteerde embryonale weefsels.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Preparation of Eggs and Microdissection of Chicken Spinal Neural Tube (SNT)
11:48
Conclusion
10:06
Results: Evaluation of the ChIP Protocol by ChIP-seq Experiments
4:12
Crosslinking Proteins to DNA
5:01
Lysis, Sonication, and Immunoprecipitation
6:33
Washing, Elution, and Reversal of Crosslinking
8:57
Cellular Protein and RNA Digestion
