Name: Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) Protocol voor lage-overvloed embryonale monsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Leer een ChIP-seq protocol voor epigenomische profielen uit kippenembryo's met beperkt materiaal. Deze methode onthult histonmodificaties en verbetert functionele annotatie van gewervelde genomen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Jan Appel voor zijn uitstekende technische hulp tijdens de totstandbrenging van dit protocol. Werk in het laboratorium van de Rada-Iglesias wordt ondersteund door CMMC intramurale financiering, DFG onderzoekssubsidies (RA 2547/1-1 RA 2547/2-1 en TE 1007/3-1), de UoC geavanceerde onderzoeker groep Grant, en de toekenning van CECAD.

<ol><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin.+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of human epigenomes.</a> Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Benayoun, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4me3+breadth+is+linked+to+cell+identity+and+transcriptional+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency.</a> Cell. 158 (3), 673-688 (2014).</li>
<li>Rehimi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics-Based+Identification+of+Major+Cell+Identity+Regulators+within+Heterogeneous+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations.</a> Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Valouev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+based+on+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data.</a> Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).</li>
<li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dynam%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).</li>
<li>Ho, J. W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+metazoan+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of metazoan chromatin organization.</a> Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).</li>
<li>Calo, E., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+enhancer+chromatin%3A+what%2C+how%2C+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?</a> Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).</li>
<li>Spitz, F., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors%3A+from+enhancer+binding+to+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcription factors: from enhancer binding to developmental control.</a> Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen geen concurrerende financiële belangen te worden vermeld.

Epigenomic profilering van Histon wijziging met behulp van de ChIP-seq kan worden gebruikt ter verbetering van de functionele aantekening van gewervelde genomen in verschillende contexten van de cellulaire4,5,18. Deze epigenomic-profielen kunnen worden gebruikt, onder andere om enhancer elementen, te definiëren van de regelgevende staat van versterkers (dat wil zeggen, actieve, primer, of klaar), en te bepalen van grote...

Histon posttranslationele modificaties zijn rechtstreeks betrokken bij diverse chromatine-afhankelijke processen, met inbegrip van transcriptie, replicatie en DNA repair1,2,3. Bovendien verschillende histone modificaties positieve Toon (b.v., H3K4me3 en H3K27ac) of negatief (bijvoorbeeld H3K9me3 en H3K27me3) correlaties met genexpressie en in grote lijnen gedefinieerd kunnen worden als activerende of repressieve Histon markeert, respectievelijk2,3. Bijgevolg, global Histon wijziging kaarten, ook wel aangeduid als epigenomic kaarten, opgedoken als krachtige en universele instrumenten functioneel aantekeningen gewervelde genoom4,5. Bijvoorbeeld, distale regulerende sequenties, zoals versterkers kunnen worden geïdentificeerd op basis van de aanwezigheid van specifieke chromatine handtekeningen (bijvoorbeeld actieve smaakversterkers: H3K4me1 en H3K27ac), die hen onderscheiden van proximale promotor regio's (b.v., actieve promotoren: H3K4me3)6,7,8. Aan de andere kant, worden genen met grote cel identiteit regelgevende taken meestal gevonden met brede chromatine domeinen gemarkeerd met H3K4me3 of H3K27me3, afhankelijk van de transcriptionally actieve of inactieve status van de onderliggende genen, respectievelijk9 ,10. Ook lijkt de expressie van genen die grote cel identiteit te worden regelmatig gecontroleerd door meerdere en ruimtelijk geclusterd versterkers (dat wil zeggen, de Super-versterkers), die kunnen worden geïdentificeerd als brede H3K27ac-gemarkeerd domeinen11.
Momenteel, worden histone wijziging kaarten gegenereerd met behulp van de ChIP-seq-technologie, die in vergelijking met de vorige benaderingen zoals ChIP-chip (ChIP gekoppeld aan microarrays) hogere resolutie, minder artefacten, minder lawaai, meer dekking en lagere biedt kost12. Niettemin, de generatie van epigenomic kaarten met behulp van de ChIP-seq technologie heeft haar inherente beperkingen, meestal gekoppeld aan het vermogen om met succes uitvoeren ChIP in de monsters van belang. Traditionele ChIP protocollen vereist meestal miljoenen cellen, welk grensbedrag de toepasselijkheid van deze methode naar de cel in vitro lijnen of cellen die gemakkelijk geïsoleerd in vivo (bijvoorbeeld bloedcellen worden kan). In de afgelopen jaren zijn een aantal gemodificeerde ChIP protocollen compatibel met lage cel nummers beschreven13,14,15,16. Echter, deze protocollen zijn speciaal ontworpen om te worden gekoppeld met de volgende-generatie sequencing (dat wil zeggen, ChIP-seq), en zij gebruiken meestal ad hoc bibliotheek voorbereiding methoden13,14, 15 , 16.
Hier, we een ChIP protocol dat kan worden gebruikt voor het onderzoeken van Histon wijziging profielen met behulp van lage tot tussentijdse cel nummers (5 x 104 - 5 x 10,5 cellen) beschreven op beide geselecteerde loci (dat wil zeggen, ChIP-qPCR) of wereldwijd (dat wil zeggen, ChIP-seq) (Figuur 1). Wanneer gekoppeld aan ChIP-seq technologie, kan onze ChIP-protocol worden gebruikt samen met de standaard bibliotheek bereidingswijzen, waardoor het voor veel laboratoria10breed toegankelijk. Dit protocol is gebruikt voor het onderzoeken van verschillende Histon merken (bijvoorbeeld, H3K4me3, H3K27me3 en H3K27ac) in verschillende kip embryonale weefsels (bijvoorbeeld spinale neuraalbuis (SNT) uitsteeksels van de frontonasal en epiblast). Wij verwachten echter dat het breed toepasbare naar andere organismen in die biologisch en/of klinisch relevante monsters kunnen slechts worden verkregen in lage bedragen moet zijn.

<table><tbody><tr><td>Reagens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA poeder</td><td>Carl Roth</td><td>3737.3</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat Saline buffer (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL pH 8.0</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-Deoxycholate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750-24</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroylsarcosine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>61743-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Applichem</td><td>A3724,0250</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Carl Roth</td><td>3739.2</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>1833</td><td></td></tr><tr><td>Protein G/magnetische kralen</td><td>Invitrogen</td><td>1004D</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Peqlab</td><td>12-RA-03</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46.35 E</td><td></td></tr><tr><td>Na-butyrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLB2659V</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase remmer</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>SYBRgreen Mix</td><td>biozym</td><td>617004</td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb ladder</td><td>Thermofisher</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma Alrich</td><td>03756-25</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Octylfenol Ethoxylaat (Triton X 100)</td><td>Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&acute;s Gemodificeerd Eagle Medium)</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>Gel loading tips Multiflex</td><td>A.Hartenstein</td><td>GS21</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Plates</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>384 well</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL buisjes</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,000 &micro;L Filter tips</td><td>Sarstedt</td><td>70,762,211</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 &micro;L Filter tips</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>2 - 200 &micro;L Filter tips</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,211</td><td></td></tr><tr><td>0.5 - 10 &micro;L Filter tips</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3 antilichaam</td><td>Active Motif</td><td>39155</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac antilichaam</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3 antilichaam</td><td>Active Motif</td><td>39159</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me2 antilichaam</td><td>Active Motif</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>End Repair Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Paramagnetische kralen</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Resuspendeer buffer</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>A-Tailing Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Ligation Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>RNA Adapter Indexes</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2101</td><td></td></tr><tr><td>Stop Ligation Buffer</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>PCR Primer Cocktail</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Enhanced PCR Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Genoom DNA ladder</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Elutie Buffer</td><td>Agilent</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Sample Buffer</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Library Quantification Kit</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4835 &ndash; 07960204001</td><td></td></tr><tr><td>Fertiel kippenei (wit)</td><td>LSL Rhein Main</td><td>KN: 15968</td><td></td></tr><tr><td>Naald (Neoject)</td><td>A.Hartenstein</td><td>10001</td><td></td></tr><tr><td>Spuit (Ecoject 10 mL)</td><td>Dispomed witt oHG</td><td>21010</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Hermle</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker</td><td>ITABIS</td><td>MKR13</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Active Motive</td><td>EpiShear sonicatie sonde</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>Bioruptor Plus</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>Variabel volume (5 &ndash;1,000 &mu;L) pipetten</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Sigma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische houder</td><td>Thermo Fisher</td><td>DynaMag-2 12321D</td><td></td></tr><tr><td>Tabel spinner</td><td>Heathrow Scientific</td><td>Sprout</td><td></td></tr><tr><td>Mixer</td><td>LMS</td><td>VTX 3000L</td><td></td></tr><tr><td>Real-Time PCR Cycler</td><td>Roche</td><td>Light Cycler; Serienummer 5662</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Gene Amp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>DNA en RNA kwaliteitscontrolesysteem</td><td>Agilent</td><td>Agilent 4200 TapeStation System</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Dumont</td><td>5-Inox-H</td><td></td></tr><tr><td>Geperforeerde lepel</td><td>World precision instruments</td><td>501997</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatine immunoprecipitation (chip) protocol voor lage-overvloed embryonale monsters

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatine immunoprecipitation (ChIP) is een veel gebruikte techniek voor het toewijzen van de lokalisatie van post-translationally gemodificeerde histonen, histone varianten, transcriptiefactoren of enzymen chromatine-aanpassen aan een bepaald locus of op een genoom-brede schaal. De combinatie van ChIP tests met volgende-generatie sequencing (dat wil zeggen, ChIP-Seq) is een krachtige aanpak van gene regulerende netwerken wereldwijd te ontdekken en ter verbetering van de functionele annotatie van genomen, met name van niet-coderende regulerende sequenties. ChIP protocollen kunnen doorgaans alleen grote hoeveelheden van celmateriaal, dus de uitschakeling van de toepasselijkheid van deze methode op het onderzoek naar zeldzame celtypes of kleine weefsel biopsieën. Om de ChIP bepaling verenigbaar is met de hoeveelheid biologisch materiaal dat doorgaans worden in vivo tijdens de vroege gewervelde embryogenese verkregen kan, beschrijven wij hier een vereenvoudigde ChIP protocol waarin het aantal stappen wilt uitvoeren, moet de assay werden gereduceerd monster verlies te minimaliseren. Dit protocol ChIP is met succes gebruikt om het onderzoeken van verschillende histone modificaties in verschillende embryonale kip en volwassen muis weefsels met behulp van lage aan middelgrote cel nummers (5 x 104 - 5 x 105 cellen). Nog belangrijker is, dit protocol is compatibel met ChIP-seq-technologie met behulp van de standaard bibliotheek bereidingswijzen, waardoor wereldwijde epigenomic kaarten in zeer relevant embryonale weefsels.

Ter illustratie van de prestaties van onze ChIP protocol, we uitgevoerd ChIP-seq experimenten met behulp van de gepaarde SNT secties van HH19 kip embryo's, maxillaire uitsteeksels van HH22 kip embryo's, en fase-HH3 kip embryo's te onderzoeken van de bindende profielen van verschillende histone modificaties (dat wil zeggen, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 en H3K27me3). Zodra de ANI van de ChIP werden verkregen, werd de ultrasoonapparaat efficiëntie beoordeeld door agarose de Elektrofore...

Hier beschrijven we een chromatine immunoprecipitation (ChIP) en ChIP-seq de protocol van de voorbereiding van de bibliotheek voor het genereren van wereldwijde epigenomic profielen van lage-overvloed kip embryonale monsters.

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) Protocol voor lage-overvloed embryonale monsters

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Het algemene doel van deze procedure is om de bindingsprofielen van verschillende histonmodificaties te onderzoeken, met behulp van laag-abundantie embryonale monsters om de functionele annotatie van gewervelde genomen te verbeteren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de ontwikkelingsbiologie te beantwoorden, zoals welke de belangrijkste enhancers en genen zijn die de identiteit van een bepaald embryonaal weefsel bepalen. De belangrijkste voordelen van deze technieken zijn dat het een beperkte hoeveelheid specifiek materiaal vereist en het kan ook worden gebruikt voor zowel lokale specifieke als genoombrede analyse.Hoewel deze methode inzichten kan bieden in transcriptieregulatie of cellulaire heterogeniteit met de embryonale weefsels, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals, octrooimonsters. Om de HH19-stadium, kippenembryo's voor dit experiment te verkrijgen, incubeer vruchtbare witte Leghorn-henneneieren in horizontale oriëntatie bij 37 graden Celsius en 80% luchtvochtigheid gedurende drie dagen. Om te beginnen met het isoleren van de HH19-embryo's, maak ze toegankelijk door drie milliliter albumine te extraheren met een 10 millimeter spuit om de blastoderm te verlagen.Om extra embryonale membranen te verwijderen, gebruik fijne schaar om een kleine opening in het oog te maken. Voeg een milliliter slotoplossing toe. Met behulp van een gebogen naald, voeg 0,5 milliliter Indiase zwarte inkt toe.Gebruik fijne chirurgische schaar en pincetten om het extra embryonale membraan dat het embryo omringt af te snijden. Breng vervolgens het embryo met een geperforeerde lepel over naar een 4,5 centimeter petrischaal bevattende 20 milliliter PBS-oplossing. Werkend op ijs onder een stereomicroscoop, gebruik fijne schaar en pincetten om het amnion en de resterende delen van het extra embryonale membraan te disseceren en weg te gooien.Snijd vervolgens de transversale spinale neurobuis of SNT-segment op het brachiale niveau van het embryo. Verleng de dissectie caudaal in de thoracale regio om de SNT te isoleren. Om te eindigen, gebruik pincetten om de weefsels die lateraal en ventraal de SNT omringen te verwijderen.Na het isoleren van SNT's, dompel elk segment in een 3,5 centimeter petrischaal bevattende 37 graden Celsius warme trypsine. Wanneer het losmaken van de niet-neuro weefsels rond de SNT zichtbaar is onder een stereomicroscoop, breng de monsters over in koud 1x PBS. Om de trypsinisatie te stoppen, breng de monsters over in een nieuwe schaal met koud DMEM bevattend 10%FBS.Gebruik pincetten om de resterende mesenchymale en ectodermische weefsels handmatig van de SNT te verwijderen. Breng deze schone SNT-sectie over in een 1,5 milliliter buis en bevries deze snel in vloeibare stikstof. Homogeniseer vervolgens het weefsel volgens het tekstprotocol.Voeg 13,5 microliter 37% formaldehyde toe en incubeer op kamertemperatuur op een rotator gedurende 15 minuten. Om het formaldehyde te doven, voeg 25 microliter 2,5 molair glycine toe aan de buis en incubeer op kamertemperatuur op een rotator gedurende 10 minuten. Centrifugeer de buis en was vervolgens het pellet volgens het tekstprotocol.Na crosslinking, suspendeer het pellet opnieuw in 300 microliter ijskoud, volledige lysisbuffer door te pipetteren. Incubeer de monsters bij vier graden Celsius op een schuddende platform gedurende 10 minuten. Soniceer vervolgens de monsters bij vier graden Celsius.Na sonicatie, centrifugeer de monsters bij 16.000 x G bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng het supernatant of lysate over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis en gooi de cellulaire debrispellet weg. Verdun het lysate volgens het tekstprotocol.Houd vervolgens een kleine aliquot van elk monster als inputcontrole en bevries deze bij 20 graden Celsius. Incubeer de resterende monsters die zullen worden onderworpen aan chromatineprecipitatie of chip met geschikte antilichamen volgens het tekstprotocol. Voeg vervolgens 300 microliter antilichaamgebonden chromatine toe aan eerder gewassen magnetische kralen.Keer de buizen om de monsters te mengen. Om de antilichamen aan de kralen te binden, plaats de buizen op een buisrotator en draai verticaal bij vier graden Celsius gedurende minimaal vier uur. Om de chromatine gebonden kralen te wassen, voeg een milliliter ijskoud RIPA-wasbuffer toe aan de buis gehouden op ijs en meng door de buis te keren of te schudden.Nadat de buis in de magnetische houder bij kamertemperatuur is geplaatst, wacht tot de kralen zich aan de zijkant hebben gesetteld. Giet het heldere vocht weg en herhaal deze wassing nog drie keer. Na het toevoegen van een milliliter TE 50 millimolar natriumchloride aan de buis, breng de chromatine gebonden kralen in deze oplossing over naar een nieuwe 1,5 millimeter microcentrifugebuis.Plaats de buis in de magnetische houder en wanneer de kralen zich hebben gesetteld, giet het vocht weg. Centrifugeer vervolgens de kralen bij 900 x G bij vier graden Celsius gedurende drie minuten in een voorgekoelde centrifuge. Nadat de kralen in de magnetische houder zijn gesetteld, verwijder al het resterende TE met een gellaadtip.Werkend op kamertemperatuur, voeg 210 microliter elutiebuffer toe aan de kralen en suspendeer door te klappen. Incubeer de buis in een voorverwarmde hitteblok bij 65 graden Celsius gedurende 15 minuten, terwijl geroerd. Na incubatie, centrifugeer de buizen met de kralen bij 16.000 x G bij kamertemperatuur gedurende één minuut.Zodra de kralen zich in de magnetische houder hebben gesetteld, breng het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Ontdooi het eerder bevroren inputcontrolemonster van 20 graden Celsius tot kamertemperatuur. Voeg 90 microliter elutiebuffer toe aan het monster en meng door kortdurend te vortexen.Om de crosslinks te reverseren, incubeer de chip- en controlemonsters bij 65 graden Celsius overnacht. Werkend op kamertemperatuur, voeg een volume TE-buffer per buis toe en draai om te mengen. Om het RNA te verteren, voeg RNAse A toe aan de controle- en chipmonsters tot een uiteindelijke concentratie van 0,2

chromatin-immunoprecipitation-chip-protocol-for-low-abundance

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

De differentiatie van ESC samenvalt met cel-type specifieke veranderingen in de structuur en samenstelling van het chromatine. De detectie van deze veranderingen geeft waardevolle inzichten in de mechanismen die stemcellness en celdifferentiatie te definiëren. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) vormt een waardevolle methode om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen stamcellen differentiatie ontleden.

Chromatine immunoprecipitatie van menselijke embryonale stamcellen

Demonstreren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) methode om factor interacties op weefsel-specifieke genen te identificeren tijdens of na het begin van weefsel-specifieke genexpressie in muis embryonale weefsel. Dit protocol moet worden breed toepasbaar voor de studie van weefsel-specifieke gen activatie als het zich voordoet tijdens de normale embryonale ontwikkeling.

Chromatine immunoprecipitatie assay for Tissue-specifieke genen met behulp van een vroeg stadium muizenembryo&#39;s

We beschrijven een robuuste methode voor het chromatine immunoprecipitatie met primaire T-cellen. De methode is gebaseerd op standaard methoden, maar gebruikt een specifieke set van omstandigheden en reagentia die de efficiëntie van een beperkte hoeveelheid cellen verbeteren. Belangrijk is een gedetailleerde beschrijving van de data analysefase gepresenteerd.

Efficiënte Chromatine immunoprecipitatie behulp Beperking hoeveelheden biomassa

De combinatie van chromatine immunoprecipitatie en ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) kan identificeren en in kaart eiwit-DNA-interacties in een bepaald weefsel of cellijn. Geschetst is hoe je een hoge kwaliteit ChIP sjabloon voor de daaropvolgende sequencing, met ervaring met de transcriptiefactor TCF7L2 als een voorbeeld te genereren.

Generatie van hoge kwaliteit Chromatine immunoprecipitatie DNA Template voor High-throughput sequencing (ChIP-seq)

De vraag hoe chromatine toezichthouders en chromatine staten van invloed op het genoom in vivo is de sleutel tot ons begrip van hoe vroeg lot van de cel beslissingen worden genomen in het zich ontwikkelende embryo. ChIP-Seq-de meest populaire benadering van chromatine functies onderzoeken op mondiaal niveau wordt hier geschetst voor Xenopus embryo.

Genoom-brede Snapshot van chromatine regelgevers en staten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryo&#39;s van Chip-Seq

Een fijnafstemming regulatie van gentranscriptie ten grondslag ligt aan embryonale cel lot beslissing. Hierin beschrijven we chromatine immunoprecipitatie assays gebruikt om epigenetische regulatie van zowel cardiale differentiatie van stamcellen en cardiale ontwikkeling van muizenembryo's te onderzoeken.

Epigenetische regulatie van Cardiac Differentiatie van embryonale stamcellen en weefsels

Hier beschrijven we methoden voor het uitvoeren van ChIP-Seq en CARIP-Seq, met inbegrip van de voorbereiding van de bibliotheek van next-generation sequencing, voor het genereren van wereldwijde epigenomic en chromatine-geassocieerde RNA kaarten in ES-cellen.

CARIP-Seq en ChIP-Seq: methoden voor het identificeren van de chromatine-geassocieerde RNAs en eiwit-DNA interacties in embryonale stamcellen

Hier beschrijven we een protocol voor efficiënte chromatine immunoprecipitation (ChIP), gevolgd door high-throughput DNA sequentiebepaling (ChIP-seq) van bruin vetweefsel (BAT) geïsoleerd van een muis. Dit protocol is geschikt voor zowel mapping histone modificaties en genoom-brede lokalisatie van niet-Histon proteïnen van belang in vivoonderzoeken.

Chromatine Immunoprecipitation van lymfkliertest bruin vetweefsel

Chromatin immunoprecipitatie (chip) is een krachtig hulpmiddel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van genregulatie. De methode omvat echter moeilijkheden bij het verkrijgen van reproduceerbare chromatine fragmentatie door mechanische afschuiving. Hier bieden we een verbeterd protocol voor een ChIP assay met enzymatische spijsvertering.

Chromatische immunoprecipitatie test met behulp van Micrococcal nucleasen in zoogdiercellen

Dit artikel beschrijft een semiautomatiseerd, microschaal ChIP-Seq-protocol van DNA-regio's geassocieerd met een specifieke histonmodificatie (H3K27ac) met behulp van een ChIP-vloeistofhandlerplatform, gevolgd door bibliotheekvoorbereiding met behulp van tagmentatie. De procedure omvat controlebeoordeling voor kwaliteits- en kwantiteitsdoeleinden en kan worden toegepast op andere histonmodificaties of transcriptiefactoren.

Een semiautomatiseerde ChIP-Seq-procedure voor grootschalige epigenetische studies

Dit protocol richt zich op chromatinepreparatie uit snap bevroren weefsels en is geschikt voor Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) gevolgd door kwantitatieve PCR-analyse (X-ChIP-qPCR) of next generation sequencing-benaderingen (X-ChIP-seq).

Chromatine-extractie uit bevroren chimere leverweefsel voor chromatine-immunoprecipitatieanalyse

Leer een ChIP-seq protocol voor epigenomische profielen uit kippenembryo's met beperkt materiaal. Deze methode onthult histonmodificaties en verbetert functionele annotatie van gewervelde genomen.

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) Protocol voor lage-overvloed embryonale monsters

Meer video's verkennen