Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis

Het algemene doel van deze RNASeq-analyse in larvale monsters van zebravis is het identificeren van genexpressieprofielen voor zebravisembryo's en -larven, en het maken van kwantitatieve vergelijkende uitspraken over veranderingen in genexpressie tussen monsters. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in elk vakgebied waarvoor zebravisembryo's of -larven informatief zijn, zoals de vraag hoe de onderdrukking van één specifiek doelgen leidt tot veranderingen in genexpressie of een verstoring van bepaalde signaalpaden ten opzichte van andere condities. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zebravis zich lenen voor de productie van grote aantallen dieren, waardoor transcriptoomgegevens van het hele dier eenvoudig kunnen worden verkregen.

Daarnaast kan de isolatie van specifieke celtypen eenvoudig worden gerealiseerd door middel van sortering van transgene dieren. De procedures worden gedemonstreerd door Lain Hostelley, een promovendus, en Jessica Nesmith, een postdoc uit mijn laboratorium. Begin met het kweken van embryo's tot een leeftijd van drie maanden, wat overeenkomt met de reproductieve rijpheid.

Scheid op de avond vóór de embryocollectie twee volwassen mannetjes en drie vrouwtjes van de gewenste stam in gedeelde paatanks met vers systeemwater. De volgende ochtend, nadat het licht is aangegaan, verwijdert u de scheidingswand en laat u de vissen natuurlijk paren totdat er embryo's op de bodem van de tank worden waargenomen. Collecteer de embryo's in intervallen van 30 minuten in aparte Petrischalen met embryo-medium totdat het gewenste aantal is verzameld.

Om de embryo's te stadieren, cultureert u ze in groepen van 50 tot 75 per Petri-schaal van 10 centimeter om een consistente ontwikkelingstijd van alle embryo's te bevorderen. Bewaar de schalen vervolgens bij 28,5 °C. Bepaal de leeftijd van de embryo's aan de hand van het aantal somiten na de segmentatie tot ongeveer 24 uur na bevruchting, of HPF, en scheid de embryo's op basis van de ontwikkelingsleeftijd.

Nadat de embryo's in het gewenste stadium volgens het tekstprotocol zijn geëuthanaseerd, brengt u een pool van 20 embryo's over naar een gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Verwijder vervolgens alle overtollige embryo-medium uit de microcentrifugebuis. Voeg 200 microliters lysisreagens toe aan de buis.

Gebruik vervolgens een stamper om de embryo's mechanisch te homogeniseren. Voeg daarna nog 800 µL lysisreagens toe om het totale volume op 1 mL te brengen. Om het RNA te extraheren, voegt u lysisreagens toe aan het verzamelde monster en incubeert u dit gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.

Voeg 0,2 milliliters chloroform toe voor elke 1 milliliter gebruikte lysisreagens en keer de buizen 15 seconden lang handmatig om. Na incubatie van de monsters bij kamertemperatuur gedurende twee tot drie minuten, worden de monsters gecentrifugeerd bij 12 000 ×g en 4 °C gedurende 15 minuten. Overbreng de gescheiden waterige fase naar een nieuwe buis en voeg 0,5 milliliters isopropanol toe voor elke 1 milliliter gebruikte lysisreagens.

Na het incuberen van de buisjes gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, worden de monsters 10 minuten gecentrifugeerd. Voeg vervolgens 75% ethanol toe aan het RNA en centrifugeer de buisjes 5 minuten bij 7.500 ×g en 4 °C. Verwijder het supernatant volledig en laat het monster aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.

Resuspendeer het RNA vervolgens in 15 tot 30 µL DEPC-behandeld water. Om na het extraheren van het pellet en het wassen van het monster volgens het tekstprotocol hoogwaardig RNA te zuiveren, gebruikt u een absorptiespectrofotometer om de concentratie en zuiverheid van het geëxtraheerde RNA te bepalen. Zorg ervoor dat de 260/230-waarde ongeveer 2,0 is voordat de RNA-monsters naar een leverancier of instantie worden gestuurd voor RNASeq en analyse van genexpressieveranderingen op basis van kwantificatie van sequencing reads.

Om een enkele experimentele conditie te vergelijken met een controle, opent u de gegevens van differentieel tot expressie gebrachte genen in een spreadsheetprogramma. Klik op het dropdown-pijltje naast de sorteerknop en selecteer 'aangepast sorteren' binnen de spreadsheet. Selecteer in het venster dat verschijnt het vak onder kolom en kies ervoor om te sorteren op de LFC-kolom.

Zorg ervoor dat in de kolom 'Sorteer op' de optie 'Waarden' is geselecteerd. Selecteer in de kolom 'Volgorde' de optie om van groot naar klein te sorteren en klik op OK. Om differentieel tot expressie gebrachte genen te bepalen die in twee experimentele condities zijn gevonden, selecteert u in het spreadsheet 'experimenteel versus controle' de eerste cel in een lege kolom.

Typ vervolgens de volgende vergelijking in de cel. Druk op enter of return om de vergelijking uit te voeren. Selecteer de cel die de vergelijking bevat en klik op het vakje in de rechterbenedenhoek van de cel.

Houd de muisknop ingedrukt en sleep het geselecteerde gebied helemaal naar beneden in de kolom tot het laatste feature ID is geselecteerd, om de formule in elke cel van de kolom te kopiëren. Selecteer opnieuw aangepast sorteren en voeg een tweede sorteringsniveau toe door op het plusteken in de linkerbenedenhoek te klikken. Selecteer bij het eerste niveau, sorteren op, onder kolom, de optie duplicate.

Select onder 'Sorteer op' de optie 'waarden' en selecteer onder 'volgorde' de optie 'Z tot A'. Selecteer vervolgens in het tweede niveau, bij 'dan op', onder 'kolom' de optie 'LFC'. Selecteer onder 'Sorteer op' de optie 'waarden', selecteer onder 'volgorde' de optie 'grootste naar kleinste' en klik op 'ok'. Om eventuele haakjes uit de kolom met gensymbolen te verwijderen voordat u verdergaat, selecteert u de volledige kolom die de gensymbolen bevat.

Selecteer bewerken en vervolgens vervangen in het uitklapmenu van het bestand. Typ een openend haakje, een asterisk en een sluitend haakje in het veld 'Zoeken naar' van het vervangvenster, en laat het veld 'Vervangen door' leeg. Selecteer Alles vervangen om alle instanties van haakjes te verwijderen.

Om verrijkte pathways te bepalen, kopieert u de gewenste gensymbolen naar het klembord. Ga naar ConsensusPathDB en selecteer gene set analysis in de linkerzijbalk van de webpagina, gevolgd door over-representation analysis. Plak de lijst met genen in het vak paste a list of gene and protein identifiers.

Selecteer het gensymbool in het vak voor het type gen/proteïne-identificator en klik op proceed. Selecteer in de sectie pathway-based sets het vakje naast pathways as defined by pathway databases. Selecteer find enriched sets om de lijst met pathways te verkrijgen die genen uit de invoerlijst bevatten.

Selecteer alle verrijkte pathways die u in een pathway-netwerk wilt visualiseren door elk vakje naast de pathway-namen aan te vinken of door op 'all' te klikken onder 'select' in de kolomkop boven de selectievakjes. Selecteer vervolgens 'visualize selected sets'. Pas de filters voor relatieve overlap en gedeelde kandidaten aan door op een van de vakjes bovenaan in het midden van de pagina te klikken en het gewenste percentage, de relatieve overlap of het aantal gedeelde kandidaten in te voeren, en selecteer daarna 'apply'.

Om de verrijkte gen-ontologieën te bepalen, kopieert u de gensymbolen van de betreffende groep naar het klembord. Ga naar de GO Enrichment analysis tool van het Gene Ontology Consortium. Plak de lijst met gensymbolen in het vak aan de linkerkant van de pagina, onder 'your gene IDs here'.

Select onder het vak voor gen-ID's de GO-term "biological process". Selecteer vervolgens danio rerio onder het vak voor GO-terms en klik op submit. Voer QRT-PCR uit en vergelijk dit met RNASeq, volgens het tekstprotocol.

Sequencing van geëxtraheerd RNA uit larven die waren geïnjecteerd met Morpholinos tegen respectievelijk alms1 of bbs1 onthulde de genen die uniek op- en neergereguleerd waren in de Alstrom- en BBS-modellen, evenals de genen die in beide modellen significant waren veranderd. Om het moleculaire profiel van het Alstrom-model duidelijker te herleiden, werden de pathways en gen-ontologieën geïdentificeerd die verrijkt waren in de differentieel tot expressie gebrachte genen. Zoals hier getoond, waren in totaal 31 pathways opgereguleerd.

Naast de brede groepering van het metabolisme waren de meest getroffen pathways het aangeboren en adaptieve immuunsysteem, met respectievelijk 32 en 20 genen. Downstream B-celreceptor-signaleringsgebeurtenissen waren eveneens verrijkt. Verschillende signaalpaden waren ook verrijkt onder de opgereguleerde genen, wat consistent is met de associatie van het Alström-syndroom met dysfunctie van het primaire cilium.

Daarnaast waren drie routes geassocieerd met insulinesecretie upgereguleerd: vetzuren gebonden aan GPR40, vrije vetzuren en acetylcholine. Ten slotte waren zes GO-termen verrijkt onder de upgereguleerde genen in het Alström-model, waaronder erytrocytendifferentiatie, erytrocytenhomeostase, myelocytehomeostase en homeostatische processen. Zodra de methode onder de knie is, kan de analyse van routes en GO-termen in minder dan een uur worden voltooid.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de selectie van pathway-parameters en afkapwaarden de belangrijkste overwegingen zijn bij het interpreteren van de resultaten van RNASeq-expressievergelijkingen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals toepassing met mutantlijnen en transcriptoomanalyse van enkelvoudige celtypen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals transcriptoomprofilering van celtypen en veranderingen in genexpressie onder controle van specifieke genen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe zebrafish-transcriptomische data gegenereerd door RNASeq gebruikt kunnen worden voor de identificatie van significante veranderingen in genexpressie tussen experimentele monsters.