Name: Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Leer RNASeq-gebaseerde transcriptoomanalyse voor genexpressieprofielen in zebravisembryo's en larven. Deze methode ondersteunt kwantitatieve vergelijkingen en validatie door qRT-PCR in ontwikkelingsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) en T32DK098107 (T.L.H. en J.E.N.).

<ol><li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNusslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDetrich%2C+HW+%22The+Zebrafish%3A+Disease+Models+and+Chemical+Screens%22">The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens</a>. , 4th ed, Academic Press. (2017).</li>
<li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDetrich%2C+HW+%22The+Zebrafish%3A+Genetics%2C+Genomics%2C+and+Transcriptomics%22">The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics</a>. , 4th ed, Academic Press. (2016).</li>
<li>Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDetrich%2C+HW+%22The+Zebrafish%3A+Genetics%2C+Genomics+and+Informatics%22">The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics</a>. , 3rd ed, Academic Press. (2011).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+compensation+induced+by+deleterious+mutations+but+not+gene+knockdowns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns.</a> Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Single+Cells+from+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>MPIMG. ConsenusPathDB. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cpdb.molgen.mpg.de/">http://cpdb.molgen.mpg.de/</a> (2017).</li>
<li>Consortium, G. O. Enrichment analysis Tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.geneontology.org/">http://www.geneontology.org/</a> (2017).</li>
<li>IDT. IDT Primerquest Tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index">https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</a> (2017).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li>
<li>Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+body+proteins+regulate+Notch+signaling+through+endosomal+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).</li>
<li>Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+on+beta-cell+mass+by+disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+or+Alstrom+syndrome+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes.</a> Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).</li>
<li>Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+organism+transcriptome+analysis+of+zebrafish+models+of+Bardet-Biedl+Syndrome+and+Alstrom+Syndrome+provides+mechanistic+insight+into+shared+and+divergent+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes.</a> BMC Genomics. 17, 318(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De in dit protocol beschreven aanpak biedt een relatief snelle en kostenefficiënte strategie voor de analyse van de transcriptome-niveau van de hele dieren of bepaalde gesorteerde cel populaties. De zebravis biedt een voordelige model voor dit soort studie vanwege het gemak en de snelheid bij het genereren van grote hoeveelheden van het starten van materiaal, het gemak van uitvoering van genetische of milieu experimentele omstandigheden, en de beschikbaarheid van een groot spectrum van transgene verslaggever lijnen waard...

Vergelijkende analyse van de wereldwijde genexpressie is een waardevol instrument om nieuwe genen die bijdragen tot het waargenomen fenotypen te identificeren. Dergelijke analyses meestal rekenen op kwantitatieve beoordeling van transcript overvloed vergeleken tussen experimentele en controle van monsters. Gerichte aanpak, zoals qRT-PCR zijn relatief snel en nauwkeurig onderzoek van enkel gen expressie veranderingen. RNA sequencing (RNASeq) biedt een brede, hypothese-vrije benadering ter identificatie van belangrijke wijzigingen in genexpressie tussen monsters, waardoor het nu de standaard voor dergelijke onderzoeken over experimentele systemen.
Zebravis opgedoken als een prominente model op vele terreinen van de ziekte. Oorspronkelijk ontwikkeld voor hun nut in Ontwikkelingsbiologie studies, vanwege hun hoge vruchtbaarheid en relatief lage kosten van onderhoud, experimenteel gebruik van zebravis uitgegroeid tot een breed scala aan fenotypes van embryonale volwassen stadia zo goed als een breed scala van moleculaire testen1,2,3. Inderdaad, deze voordelen maken het moleculaire mechanistisch onderzoek snelle en kosteneffectieve omwille van het gemak van het verwerven van grote hoeveelheden materiaal gecombineerd met het gemak van zowel milieu als genetische manipulatie in alle stadia van het leven. Bovendien, het transparante karakter van de zebravis embryo's en larven maken het ideaal voor het genereren van cel - en weefsel-specifieke transgene verslaggever lijnen waardoor in vivo visualisatie van discrete cel populaties4. Exploitatie van dergelijke lijnen vergunningen global gen expressie analyse in specifieke geïsoleerde celtypes gebaseerd op verslaggever genexpressie.
Hier presenteren we een uitgebreide protocol voor globale gen expressie analyse met behulp van RNASeq na cultuur van zebravis embryo's. Genetische experimentele manipulaties, met inbegrip van morfolino (MO)-gebaseerde voorbijgaande gene knockdown of CRISPR-gemedieerde genoom bewerken, hebben ingediend elders5,6,7. We daarom concentreren op een gedetailleerd protocol voor isolatie van RNA uit hele embryo's of gesorteerd op transgene verslaggever-uiten cellen gevolgd door eenvoudige rekenkundige analyse van de resultaten van de RNASeq met traject gereedschappen en gene ontologie (GO) voorwaarden. Tot slot hebben wij een strategie voor de validatie van gen expressie wijzigingen opgenomen door kwantitatieve reverse-transcriptase PCR (qRT-PCR). Deze protocollen zijn van toepassing op de zebravis embryo's onderworpen aan een breed scala van experimentele omstandigheden, met inbegrip van de vergelijking van genetische mutanten of milieuomstandigheden.

<table><tbody><tr><td>Commerciële Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TriZol</td><td>Thermo Scientific</td><td>15596026</td><td>lyse reagens</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>dissociatie buffer 1</td></tr><tr><td>FACSMax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>dissociatie buffer 2</td></tr><tr><td>DEPC-behandeld water</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>FirstStrand cDNA omzetting</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1621</td><td>cDNA omzettingskit</td></tr><tr><td>2X SYBR Green Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>qRT-PCR Master Mix</td></tr><tr><td>FACS buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-105-9042</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>natriumacetaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Zebravis Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuebingen</td><td>ZIRC</td><td>ZL57</td><td></td></tr><tr><td>ins2a:mCherry</td><td>ZIRC</td><td>ZL1483</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 micron celzeef</td><td>Sigma</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>FACS buis</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometers</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverteer Microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paringstanks 1,0L Crossing Tank Set</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>FACS buis 5 mL polypropyleen buis</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consensus Path DB</td><td>http://cpdb.molgen.mpg.de/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GO Verrijkingsanalyse</td><td>http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bereiding van de monsters en de analyse van de rnaseq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

De analyse van de wereldwijde gen expressie veranderingen is een waardevol instrument voor de identificatie van nieuwe trajecten die ten grondslag liggen aan de waargenomen fenotypen. De zebravis is een uitstekend model voor snelle beoordeling van hele transcriptome van hele dieren of individuele cel populaties te wijten aan het gemak van isolatie van RNA van grote aantallen dieren. Hier wordt een protocol voor globale gen expressie analyse in zebrafish embryo's met behulp van RNA sequencing (RNASeq) gepresenteerd. We beschrijven de voorbereiding van RNA van hele embryo's of van cel populaties verkregen met behulp van de cel sorteren in transgene dieren. Ook beschrijven we een aanpak voor de analyse van de RNASeq gegevens om verrijkt trajecten en Ontology van het gen (ga) bedingen in global gen expressie datasets te identificeren. Tot slot bieden we een protocol voor validatie van gen expressie veranderingen met behulp van kwantitatieve reverse-transcriptase PCR (qRT-PCR). Deze protocollen voor vergelijkende analyse van controle en experimentele sets van zebrafish kunnen worden gebruikt om nieuwe gen expressie veranderingen te identificeren, en moleculaire inzicht geven in de fenotypen van belang.

Sorteren van Differentially uitgedrukte genen:
Om te identificeren differentially uitgedrukte genen in het larvale stadium van zebravis modellen van Alström-syndroom en syndroom van Bardet-Biedl (BBS), we gericht ofwel alms1 of afschriften van de bbs1 door het injecteren van eerder gevalideerd splice-blokkerende Mnd in wild-type zebrafish embryo's16,17. 5 ...

Dit protocol biedt een aanpak voor de hele transcriptome analyse van zebravis embryo's, larven, of cellen gesorteerd. Wij omvatten isolatie van RNA, pad analyse van RNASeq gegevens en qRT-PCR-gebaseerde validatie van gen expressie veranderingen.

Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Het algemene doel van deze RNASeq-analyse in larvale monsters van zebravis is het identificeren van genexpressieprofielen voor zebravisembryo's en -larven, en het maken van kwantitatieve vergelijkende uitspraken over veranderingen in genexpressie tussen monsters. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in elk vakgebied waarvoor zebravisembryo's of -larven informatief zijn, zoals de vraag hoe de onderdrukking van één specifiek doelgen leidt tot veranderingen in genexpressie of een verstoring van bepaalde signaalpaden ten opzichte van andere condities. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zebravis zich lenen voor de productie van grote aantallen dieren, waardoor transcriptoomgegevens van het hele dier eenvoudig kunnen worden verkregen.Daarnaast kan de isolatie van specifieke celtypen eenvoudig worden gerealiseerd door middel van sortering van transgene dieren. De procedures worden gedemonstreerd door Lain Hostelley, een promovendus, en Jessica Nesmith, een postdoc uit mijn laboratorium. Begin met het kweken van embryo's tot een leeftijd van drie maanden, wat overeenkomt met de reproductieve rijpheid.Scheid op de avond vóór de embryocollectie twee vo

sample-preparation-analysis-rnaseq-based-gene-expression-data-from

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

De isolatie van hoge kwaliteit, intact RNA is een essentiële stap in veel laboratoria protocollen. Hier laten we zien RNA-extractie uit hele zebravis embryo's en cDNA synthese voor verdere toepassing in de verschillende experimentele procedures, zoals het gen expressie microarray analyse.

RNA isolatie van embryonale zebravis en cDNA synthese voor de analyse van genexpressie

Gen microarrays zijn krachtige tools in gen expressie profilering bij een genoom-brede niveau. Deze technologie heeft toepassing in een verscheidenheid van biologische disciplines, waaronder ontwikkelingsbiologie en toxicologie. In deze video, we detail een protocol voor de wereldwijde genexpressie analyse met behulp van een uitgebreid oligonucleotide microarray platform voor de zebravis.

Global analyse van genexpressie met behulp van een zebravis oligonucleotide microarray platform

Het artikel beschrijft een protocol om zebravisembryo's te genereren door natuurlijke paring en het sorteren van hun ontwikkelingsstadia. Het protocol wordt verder gebruikt voor de analyse van pancreas β-cellen met behulp van transgene vissen.

Paring en ei-enscenering: een methode om embryo's te genereren en ze te sorteren op ontwikkelingsfase

Cardiale genexpressie profielen te analyseren tijdens zebravis ontwikkeling van het hart, heeft totaal RNA worden geëxtraheerd uit geïsoleerde harten. Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van functionele / kloppende harten door snelle handmatige dissectie van de zebravis embryo's tot cardiale-specifieke mRNA te verkrijgen.

Grootschalige de zebravis embryonale Hart Dissection voor Transcriptionele Analyse

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

Zebravis onlangs gewend waren als een modelsysteem in vivo DNA replicatie timing tijdens ontwikkeling bestuderen. Hier is gedetailleerde de protocollen voor het gebruik van embryo's de zebravis profiel replicatie timing. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van replicatie timing mutanten, individuele celtypes, ziekte modellen en andere soorten.

Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo

We presenteren een protocol om te isoleren van neuronen, macrofagen en microglia van larvale zebrafish hersenen onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Op isolatie, wordt RNA gewonnen uit deze cellen te analyseren hun genexpressie profiel. Dit protocol voorziet voor de verzameling van kwalitatief hoogwaardige RNA downstream analyse zoals qPCR en transcriptomics uitvoeren.

Isolatie en RNA extractie van neuronen, macrofagen en Microglia van larvale Zebrafish hersenen

Hier presenteren we een protocol voor model menselijke tuberculose in een volwassen zebrafish met behulp van de natuurlijke ziekteverwekker Mycobacterium marinum. Geëxtraheerde DNA en RNA van de inwendige organen van besmette zebrafish kan worden gebruikt om te onthullen dat het totaal mycobacteriële ladingen in de vis en de immuunrespons van de gastheer met qPCR.

Modelleren van tuberculose in Mycobacterium marinum besmet volwassen zebravis

Skeletspierregeneratie wordt aangedreven door weefsel ingezeten spierstamcellen, die bij veel spierziekten zoals spierdystrofie worden aangetast, en dit resulteert in het onvermogen van spieren om te regenereren. Hier beschrijven we een protocol dat het mogelijk maakt om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekte.

Het onderzoeken van Spierregeneratie in Zebrafish Modellen van Spierziekte

Zebravis gericht op reactieve elektrofielen en oxidanten (Z-REX) is een op chemische biologie gebaseerde methode voor het onderzoek van reactieve signalering van kleine moleculen. Deze techniek kan worden toegepast op levende vissen van verschillende ontwikkelingsstadia. Hier koppelen we standaardtests in zebravissen aan Z-REX voor signaalrouteanalyse.

Monitoring van on-target signaalreacties bij larvale zebravissen - Z-REX ontmaskert precieze mechanismen van elektrofiele geneesmiddelen en metabolieten

Hier presenteren we een protocol om eiwitten te labelen met een fluorescentie-eiwitlabel in zebravislarven, een nieuw ontwikkeld en aangepast in vivo systeem dat vooral nuttig is voor het visualiseren van eiwitten met een lage abundantie in zebravissen.

Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren

Leer RNASeq-gebaseerde transcriptoomanalyse voor genexpressieprofielen in zebravisembryo's en larven. Deze methode ondersteunt kwantitatieve vergelijkingen en validatie door qRT-PCR in ontwikkelingsbiologie.

Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis

Meer video's verkennen