Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis
October 27th, 2017
Dit protocol biedt een aanpak voor de hele transcriptome analyse van zebravis embryo's, larven, of cellen gesorteerd. Wij omvatten isolatie van RNA, pad analyse van RNASeq gegevens en qRT-PCR-gebaseerde validatie van gen expressie veranderingen.
Het algemene doel van deze RNASeq-analyse in zebravis-larvemonsters is om genexpressieprofielen voor zebravis-embryo's en -larven te identificeren en om kwantitatieve vergelijkende uitspraken te doen over veranderingen in genexpressie tussen monsters. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in elk veld waarvoor zebravis-embryo's of -larven informatief zijn, zoals hoe onderdrukking van een specifiek gen leidt tot veranderingen in genexpressie of een verstoring van bepaalde paden in vergelijking met andere omstandigheden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zebravissen geschikt zijn voor het produceren van grote aantallen dieren en transcriptoomgegevens van het hele dier kunnen gemakkelijk worden verkregen.
Bovendien kan het isoleren van specifieke celtypen gemakkelijk worden bereikt door transgene dieren te sorteren. De procedures zullen worden gedemonstreerd door Lain Hostelley, een afgestudeerde student, en Jessica Nesmith, een post-doc uit mijn laboratorium. Om te beginnen, kweek embryo's tot drie maanden oud, wat reproductieve volwassenheid is.
Scheid twee volwassen mannelijke en drie vrouwelijke vissen van de gewenste stam op de avond vóór de embryo-collectie in verdeelde kweektanks met vers systeemwater. De volgende ochtend, nadat de lichten aangaan, verwijder de scheiding en laat de vissen natuurlijk paren totdat embryo's in de bodem van de tank worden waargenomen. Verzamel embryo's in intervallen van 30 minuten in afzonderlijke petrischalen met embryomedium totdat het gewenste aantal is verzameld.
Om de embryo's te stijlen, kweek ze in groepen van 50 tot 75 per 10 centimeter petrischaal om een consistente ontwikkelingstiming van alle embryo's te bevorderen. Houd de platen vervolgens op 28,5 graden Celsius. Meet de leeftijd van het embryo met behulp van het aantal somieten na segmentatie tot ongeveer 24 uur na bevruchting, of HPF, en scheid de embryo's op basis van ontwikkelingsleeftijd.
Nadat de embryo's in het gewenste stadium zijn geëuthanaseerd volgens het tekstprotocol, breng een pool van 20 embryo's over naar een gelabelde 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Vervolgens, verwijder eventueel overtollig embryomedium uit de microcentrifugebuis. Voeg 200 microliters lyseregel toe aan de buis.
En gebruik een stamper om de embryo's mechanisch te homogeniseren. Voeg vervolgens nog eens 800 microliters lyseregel toe om het totale volume op één milliliter te brengen. Om het RNA te extraheren, voeg lyseregel toe aan het verzamelde monster en incubeer het 5 minuten op kamertemperatuur.
Voeg 0,2 milliliter chloroform toe voor elke 1 milliliter gebruikte lyseregel, en draai de buisjes met de hand 15 seconden om. Na incubatie van de monsters op kamertemperatuur gedurende twee tot drie minuten, centrifugeer de monsters gedurende 15 minuten bij 12.000 keer G en 4 graden Celsius. Breng de gescheiden waterige fase over naar een nieuwe buis en voeg 0,5 milliliter isopropanol toe voor elke 1 milliliter gebruikte lyseregel.
Na incubatie van de buisjes gedurende 10 minuten op kamertemperatuur, centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 75%ethanol toe aan het RNA en centrifugeer de buisjes gedurende 5 minuten bij 7.500 keer G en 4 graden Celsius. Verwijder volledig de supernatant en laat het monster op kamertemperatuur aan de lucht drogen.
Vervolgens, suspendeer het RNA in 15 tot 30 microliters DEPC-behandeld water. Gebruik een absorptiespectrofotometer om de geëxtraheerde RNA te testen op concentratie en zuiverheid na extractie van de pellet en wassing van het monster volgens het tekstprotocol. Zorg ervoor dat de 260 over 230 waarde ongeveer 2,0 is voordat de RNA-monsters naar een leverancier of corps worden gestuurd voor RNASeq en genexpressieveranderingsanalyse op basis van kwantificering van sequencing-reads.
Om een enkele experimentele conditie te vergelijken met een controle, open de gegevens van differentieel tot expressie gebrachte genen in een spreadsheetbeheersoftware. Selecteer de vervolgkeuzelijst naast de sorteerknop en selecteer aangepaste sortering binnen de spreadsheet. In het pop-upvenster, selecteer het vak onder kolom en kies om te sorteren op de LFC-kolom.
In de kolom sorteren, zorg ervoor dat waarden is geselecteerd. In de kolom volgorde, selecteer sorteren van groot naar klein en klik op oké. Om differentieel tot expressie gebrachte genen te bepalen die in twee experimentele omstandigheden worden gevonden, selecteer op de experimentele versus controle spreadsheet de eerste cel in een lege kolom.
Typ vervolgens de volgende vergelijking in de cel. Druk op enter of return om de vergelijking uit te voeren. Selecteer de cel met de vergelijking en klik op het vakje in de rechter benedenhoek van de cel.
Houd de muisknop ingedrukt en sleep het geselecteerde gebied helemaal naar beneden in de kolom totdat de laatste functie-ID is geselecteerd om de vergelijking in elke cel in de kolom te kopiëren. Selecteer opnieuw aangepaste sortering en voeg een tweede niveau van sortering toe door op het pluspictogram in de linker benedenhoek te klikken. Selecteer in het eerste niveau, sorteren op, onder kolom, dubbele selectie.
Onder sorteren op, selecteer waarden, en onder volgorde, selecteer Z naar A. In het tweede niveau, vervolgens door, onder kolom, selecteer LFC. Onder sorteren op, selecteer waarden, en onder volgorde, selecteer groot naar klein, en selecteer oké. Om eventuele haakjes uit de kolom met gensymbolen te verwijderen voordat u doorgaat, selecteert u de hele kolom met gensymbolen.
Selecteer bewerken, vervolgens vervangen in het vervolgkeuzemenu van het bestand. Typ open haakje, ster, gesloten haakje, in de zoekbalk van het vervangvenster en laat de vervang met-balk leeg. Selecteer vervang alles om alle voorkomens van haakjes te verwijderen.
Om verrijkte paden te bepalen, kopieer de gewenste gensymbolen naar het klembord. Ga naar ConsensusPathDB, selecteer vervolgens gensetanalyse in de linker zijbalk van de webpagina, gevolgd door overrepresentatieanalyse. Plak in het vak een lijst met gen- en eiwitidentificatoren, de lijst met genen.
Selecteer het gensymbool in het vak gen/eiwitident
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol presenteert een benadering voor de analyse van het volledige transcriptoom van zebravis embryo's, larven of gesorteerd cellen. De methode maakt de identificatie van genexpressieprofielen en kwantitatieve vergelijkingen tussen monsters mogelijk.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Ontwikkelingsbiologie
- Genomiek
Achtergrond
- Zebravissen zijn nuttige modellen voor het bestuderen van genexpressie veranderingen.
- Isolatie van specifieke celtypen kan worden bereikt met behulp van transgene dieren.
- De techniek ondersteunt grootschalige productie van zebravissen voor analyse.
- RNASeq-gegevens kunnen verstoringen in paden onthullen als gevolg van gerichte gensuppressie.
Doel van de studie
- Om genexpressieprofielen in zebravis embryo's en larven te identificeren.
- Om genexpressieveranderingen te vergelijken onder verschillende omstandigheden.
- Om bevindingen te valideren door qRT-PCR.
Gebruikte methoden
- Isolatie van RNA uit zebravis monsters.
- Padenanalyse van RNASeq-gegevens.
- qRT-PCR-gebaseerde validatie van genexpressieveranderingen.
- Sortering van transgene dieren voor isolatie van specifieke celtypen.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van verschillende genexpressieprofielen.
- Kwantitatieve vergelijkingen van genexpressieveranderingen.
- Inzichten in de effecten van gensuppressie op paden.
- Validatie van RNASeq-bevindingen door qRT-PCR.
Conclusies
- Deze methode verbetert het begrip van genexpressie in zebravissen.
- Het biedt een raamwerk voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen.
- De aanpak is toepasbaar op verschillende onderzoeksvragen in de biologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
RNASeq-based gene expression analysis in zebrafish enables rapid, scalable identification of pathway-level disruptions following genetic perturbation, supporting early target validation and mechanistic de-risking in discovery programs. The method provides quantitative, reproducible transcriptome data that informs go/no-go decisions by linking phenotypic observations to molecular signatures, reducing ambiguity in target hypothesis testing. Its compatibility with high-throughput embryo production and cell sorting facilitates integration into phenotypic screening cascades for lead identification and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking gene suppression to pathway enrichment, clarifying mechanism of action and off-target effects.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative comparison of gene expression profiles between control and perturbed conditions.
- Predictive Value: Identifies enriched pathways and GO terms that provide mechanistic context for phenotypic observations, improving confidence in target-disease relationships.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative gene expression readouts suitable for compound screening and dose-response profiling in zebrafish models.
- Scalability: Leverages ease of large-scale embryo production and RNA isolation to support high-throughput screening campaigns.
- Reproducibility: Includes qRT-PCR validation step to confirm RNASeq findings, ensuring data reliability across experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Identifies conserved pathways (e.g., immune signaling, insulin secretion, cilia function) linked to human disease models, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables progression from whole-embryo transcriptome analysis to sorted cell populations, facilitating mechanistic follow-up in relevant tissue contexts.
- Risk-Adjusted Decisions: Pathway and GO enrichment outputs help prioritize targets based on biological coherence and phenotypic concordance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification, providing molecular phenotyping that bridges genetic perturbation to pathway-level insights.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying gene expression changes and identifying enriched pathways following targeted gene suppression.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative transcriptome profiles that enable reliable comparison of experimental conditions in multi-well formats.
- Analytics: Generates pathway enrichment and GO term outputs that allow teams to compare mechanistic impact across compounds or genetic models.
- Translational Research: Connects zebrafish phenotypes to human-relevant biological processes (e.g., immune response, metabolic signaling) through conserved pathway analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized RNASeq workflow applicable across projects, reducing redundant method development and enabling cross-study data integration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through pathway-level interpretation of gene expression data.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized RNA extraction, library preparation, and qRT-PCR validation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing objective, quantitative molecular phenotypes linked to target modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on pathway enrichment strength and disease relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, developmental staging, and RNA handling to ensure sample integrity.
- Depends on access to RNASeq library preparation and sequencing infrastructure, either in-house or via vendor.
- Necessitates bioinformatics support for differential expression analysis, pathway enrichment (e.g., ConsensusPathDB), and GO term annotation.
- Requires standardization of embryo collection timing, lysis conditions, and sequencing depth to maintain cross-experiment comparability.
- Limited by the need for careful parameter selection in enrichment analysis (e.g., cutoff values, background sets) to avoid false positives, as noted in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:04
Generating Embryos Through Natural Mating and Staging Embryos
2:22
Whole Embryo Dissociation, RNA Extraction and Purify High-quality RNA
4:55
Sorting Differentially Expressed Genes
7:00
Determine Enriched Pathways
7:57
Generation of Pathway Networks and Determination of Enriched GO Terms
9:12
Results: RNAseq-based Zebrafish Genome Expression Data for Alstrom and Bardet Biedl Syndromes
10:47
Conclusion
