Name: Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Leer RNASeq-gebaseerde transcriptoomanalyse voor genexpressieprofielen in zebravisembryo's en larven. Deze methode ondersteunt kwantitatieve vergelijkingen en validatie door qRT-PCR in ontwikkelingsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) en T32DK098107 (T.L.H. en J.E.N.).

<ol><li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNusslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDetrich%2C+HW+%22The+Zebrafish%3A+Disease+Models+and+Chemical+Screens%22">The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens</a>. , 4th ed, Academic Press. (2017).</li>
<li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDetrich%2C+HW+%22The+Zebrafish%3A+Genetics%2C+Genomics%2C+and+Transcriptomics%22">The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics</a>. , 4th ed, Academic Press. (2016).</li>
<li>Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDetrich%2C+HW+%22The+Zebrafish%3A+Genetics%2C+Genomics+and+Informatics%22">The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics</a>. , 3rd ed, Academic Press. (2011).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+compensation+induced+by+deleterious+mutations+but+not+gene+knockdowns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns.</a> Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Single+Cells+from+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>MPIMG. ConsenusPathDB. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cpdb.molgen.mpg.de/">http://cpdb.molgen.mpg.de/</a> (2017).</li>
<li>Consortium, G. O. Enrichment analysis Tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.geneontology.org/">http://www.geneontology.org/</a> (2017).</li>
<li>IDT. IDT Primerquest Tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index">https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</a> (2017).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li>
<li>Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+body+proteins+regulate+Notch+signaling+through+endosomal+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).</li>
<li>Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+on+beta-cell+mass+by+disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+or+Alstrom+syndrome+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes.</a> Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).</li>
<li>Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+organism+transcriptome+analysis+of+zebrafish+models+of+Bardet-Biedl+Syndrome+and+Alstrom+Syndrome+provides+mechanistic+insight+into+shared+and+divergent+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes.</a> BMC Genomics. 17, 318(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De in dit protocol beschreven aanpak biedt een relatief snelle en kostenefficiënte strategie voor de analyse van de transcriptome-niveau van de hele dieren of bepaalde gesorteerde cel populaties. De zebravis biedt een voordelige model voor dit soort studie vanwege het gemak en de snelheid bij het genereren van grote hoeveelheden van het starten van materiaal, het gemak van uitvoering van genetische of milieu experimentele omstandigheden, en de beschikbaarheid van een groot spectrum van transgene verslaggever lijnen waard...

Vergelijkende analyse van de wereldwijde genexpressie is een waardevol instrument om nieuwe genen die bijdragen tot het waargenomen fenotypen te identificeren. Dergelijke analyses meestal rekenen op kwantitatieve beoordeling van transcript overvloed vergeleken tussen experimentele en controle van monsters. Gerichte aanpak, zoals qRT-PCR zijn relatief snel en nauwkeurig onderzoek van enkel gen expressie veranderingen. RNA sequencing (RNASeq) biedt een brede, hypothese-vrije benadering ter identificatie van belangrijke wijzigingen in genexpressie tussen monsters, waardoor het nu de standaard voor dergelijke onderzoeken over experimentele systemen.
Zebravis opgedoken als een prominente model op vele terreinen van de ziekte. Oorspronkelijk ontwikkeld voor hun nut in Ontwikkelingsbiologie studies, vanwege hun hoge vruchtbaarheid en relatief lage kosten van onderhoud, experimenteel gebruik van zebravis uitgegroeid tot een breed scala aan fenotypes van embryonale volwassen stadia zo goed als een breed scala van moleculaire testen1,2,3. Inderdaad, deze voordelen maken het moleculaire mechanistisch onderzoek snelle en kosteneffectieve omwille van het gemak van het verwerven van grote hoeveelheden materiaal gecombineerd met het gemak van zowel milieu als genetische manipulatie in alle stadia van het leven. Bovendien, het transparante karakter van de zebravis embryo's en larven maken het ideaal voor het genereren van cel - en weefsel-specifieke transgene verslaggever lijnen waardoor in vivo visualisatie van discrete cel populaties4. Exploitatie van dergelijke lijnen vergunningen global gen expressie analyse in specifieke geïsoleerde celtypes gebaseerd op verslaggever genexpressie.
Hier presenteren we een uitgebreide protocol voor globale gen expressie analyse met behulp van RNASeq na cultuur van zebravis embryo's. Genetische experimentele manipulaties, met inbegrip van morfolino (MO)-gebaseerde voorbijgaande gene knockdown of CRISPR-gemedieerde genoom bewerken, hebben ingediend elders5,6,7. We daarom concentreren op een gedetailleerd protocol voor isolatie van RNA uit hele embryo's of gesorteerd op transgene verslaggever-uiten cellen gevolgd door eenvoudige rekenkundige analyse van de resultaten van de RNASeq met traject gereedschappen en gene ontologie (GO) voorwaarden. Tot slot hebben wij een strategie voor de validatie van gen expressie wijzigingen opgenomen door kwantitatieve reverse-transcriptase PCR (qRT-PCR). Deze protocollen zijn van toepassing op de zebravis embryo's onderworpen aan een breed scala van experimentele omstandigheden, met inbegrip van de vergelijking van genetische mutanten of milieuomstandigheden.

<table><tbody><tr><td>Commerciële Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TriZol</td><td>Thermo Scientific</td><td>15596026</td><td>lyse reagens</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>dissociatie buffer 1</td></tr><tr><td>FACSMax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>dissociatie buffer 2</td></tr><tr><td>DEPC-behandeld water</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>FirstStrand cDNA omzetting</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1621</td><td>cDNA omzettingskit</td></tr><tr><td>2X SYBR Green Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>qRT-PCR Master Mix</td></tr><tr><td>FACS buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-105-9042</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>natriumacetaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Zebravis Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuebingen</td><td>ZIRC</td><td>ZL57</td><td></td></tr><tr><td>ins2a:mCherry</td><td>ZIRC</td><td>ZL1483</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 micron celzeef</td><td>Sigma</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>FACS buis</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometers</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverteer Microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paringstanks 1,0L Crossing Tank Set</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>FACS buis 5 mL polypropyleen buis</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consensus Path DB</td><td>http://cpdb.molgen.mpg.de/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GO Verrijkingsanalyse</td><td>http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bereiding van de monsters en de analyse van de rnaseq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

De analyse van de wereldwijde gen expressie veranderingen is een waardevol instrument voor de identificatie van nieuwe trajecten die ten grondslag liggen aan de waargenomen fenotypen. De zebravis is een uitstekend model voor snelle beoordeling van hele transcriptome van hele dieren of individuele cel populaties te wijten aan het gemak van isolatie van RNA van grote aantallen dieren. Hier wordt een protocol voor globale gen expressie analyse in zebrafish embryo's met behulp van RNA sequencing (RNASeq) gepresenteerd. We beschrijven de voorbereiding van RNA van hele embryo's of van cel populaties verkregen met behulp van de cel sorteren in transgene dieren. Ook beschrijven we een aanpak voor de analyse van de RNASeq gegevens om verrijkt trajecten en Ontology van het gen (ga) bedingen in global gen expressie datasets te identificeren. Tot slot bieden we een protocol voor validatie van gen expressie veranderingen met behulp van kwantitatieve reverse-transcriptase PCR (qRT-PCR). Deze protocollen voor vergelijkende analyse van controle en experimentele sets van zebrafish kunnen worden gebruikt om nieuwe gen expressie veranderingen te identificeren, en moleculaire inzicht geven in de fenotypen van belang.

Sorteren van Differentially uitgedrukte genen:
Om te identificeren differentially uitgedrukte genen in het larvale stadium van zebravis modellen van Alström-syndroom en syndroom van Bardet-Biedl (BBS), we gericht ofwel alms1 of afschriften van de bbs1 door het injecteren van eerder gevalideerd splice-blokkerende Mnd in wild-type zebrafish embryo's16,17. 5 ...

Dit protocol biedt een aanpak voor de hele transcriptome analyse van zebravis embryo's, larven, of cellen gesorteerd. Wij omvatten isolatie van RNA, pad analyse van RNASeq gegevens en qRT-PCR-gebaseerde validatie van gen expressie veranderingen.

Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Het algemene doel van deze RNASeq-analyse in larvale monsters van zebravis is het identificeren van genexpressieprofielen voor zebravisembryo's en -larven, en het maken van kwantitatieve vergelijkende uitspraken over veranderingen in genexpressie tussen monsters. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in elk vakgebied waarvoor zebravisembryo's of -larven informatief zijn, zoals de vraag hoe de onderdrukking van één specifiek doelgen leidt tot veranderingen in genexpressie of een verstoring van bepaalde signaalpaden ten opzichte van andere condities. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zebravis zich lenen voor de productie van grote aantallen dieren, waardoor transcriptoomgegevens van het hele dier eenvoudig kunnen worden verkregen.Daarnaast kan de isolatie van specifieke celtypen eenvoudig worden gerealiseerd door middel van sortering van transgene dieren. De procedures worden gedemonstreerd door Lain Hostelley, een promovendus, en Jessica Nesmith, een postdoc uit mijn laboratorium. Begin met het kweken van embryo's tot een leeftijd van drie maanden, wat overeenkomt met de reproductieve rijpheid.Scheid op de avond vóór de embryocollectie twee volwassen mannetjes en drie vrouwtjes van de gewenste stam in gedeelde paatanks met vers systeemwater. De volgende ochtend, nadat het licht is aangegaan, verwijdert u de scheidingswand en laat u de vissen natuurlijk paren totdat er embryo's op de bodem van de tank worden waargenomen. Collecteer de embryo's in intervallen van 30 minuten in aparte Petrischalen met embryo-medium totdat het gewenste aantal is verzameld.Om de embryo's te stadieren, cultureert u ze in groepen van 50 tot 75 per Petri-schaal van 10 centimeter om een consistente ontwikkelingstijd van alle embryo's te bevorderen. Bewaar de schalen vervolgens bij 28,5 °C. Bepaal de leeftijd van de embryo's aan de hand van het aantal somiten na de segmentatie tot ongeveer 24 uur na bevruchting, of HPF, en scheid de embryo's op basis van de ontwikkelingsleeftijd.Nadat de embryo's in het gewenste stadium volgens het tekstprotocol zijn geëuthanaseerd, brengt u een pool van 20 embryo's over naar een gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Verwijder vervolgens alle overtollige embryo-medium uit de microcentrifugebuis. Voeg 200 microliters lysisreagens toe aan de buis.Gebruik vervolgens een stamper om de embryo's mechanisch te homogeniseren. Voeg daarna nog 800 µL lysisreagens toe om het totale volume op 1 mL te brengen. Om het RNA te extraheren, voegt u lysisreagens toe aan het verzamelde monster en incubeert u dit gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.Voeg 0,2 milliliters chloroform toe voor elke 1 milliliter gebruikte lysisreagens en keer de buizen 15 seconden lang handmatig om. Na incubatie van de monsters bij kamertemperatuur gedurende twee tot drie minuten, worden de monsters gecentrifugeerd bij 12 000 ×g en 4 °C gedurende 15 minuten. Overbreng de gescheiden waterige fase naar een nieuwe buis en voeg 0,5 milliliters isopropanol toe voor elke 1 milliliter gebruikte lysisreagens.Na het incuberen van de buisjes gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, worden de monsters 10 minuten gecentrifugeerd. Voeg vervolgens 75% ethanol toe aan het RNA en centrifugeer de buisjes 5 minuten bij 7.500 ×g en 4 °C. Verwijder het supernatant volledig en laat het monster aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.Resuspendeer het RNA vervolgens in 15 tot 30 µL DEPC-behandeld water. Om na het extraheren van het pellet en het wassen van het monster volgens het tekstprotocol hoogwaardig RNA te zuiveren, gebruikt u een absorptiespectrofotometer om de concentratie en zuiverheid van het geëxtraheerde RNA te bepalen. Zorg ervoor dat de 260/230-waarde ongeveer 2,0 is voordat de RNA-monsters naar een leverancier of instantie worden gestuurd voor RNASeq en analyse van genexpressieveranderingen op basis van kwantificatie van sequencing reads.Om een enkele experimentele conditie te vergelijken met een controle, opent u de gegevens van differentieel tot expressie gebrachte genen in een spreadsheetprogramma. Klik op het dropdown-pijltje naast de sorteerknop en selecteer 'aangepast sorteren' binnen de spreadsheet. Selecteer in het venster dat verschijnt het vak onder kolom en kies ervoor om te sorteren op de LFC-kolom.Zorg ervoor dat in de kolom 'Sorteer op' de optie 'Waarden' is geselecteerd. Selecteer in de kolom 'Volgorde' de optie om van groot naar klein te sorteren en klik op OK. Om differentieel tot expressie gebrachte genen te bepalen die in twee experimentele condities zijn gevonden, selecteert u in het spreadsheet 'experimenteel versus controle' de eerste cel in een lege kolom.Typ vervolgens de volgende vergelijking in de cel. Druk op enter of return om de vergelijking uit te voeren. Selecteer de cel die de vergelijking bevat en klik op het vakje in de rechterbenedenhoek van de cel.Houd de muisknop ingedrukt en sleep het geselecteerde gebied helemaal naar beneden in de kolom tot het laatste feature ID is geselecteerd, om de formule in elke cel van de kolom te kopiëren. Selecteer opnieuw aangepast sorteren en voeg een tweede sorteringsniveau toe door op het plusteken in de linkerbenedenhoek te klikken. Selecteer bij het eerste niveau, sorteren op, onder kolom, de optie duplicate.Select onder 'Sorteer op' de optie 'waarden' en selecteer onder 'volgorde' de optie 'Z tot A'. Selecteer vervolgens in het tweede niveau, bij 'dan op', onder 'kolom' de optie 'LFC'. Selecteer onder 'Sorteer op' de optie 'waarden', selecteer onder 'volgorde' de optie 'grootste naar kleinste' en klik op 'ok'. Om eventuele haakjes uit de kolom met gensymbolen te verwijderen voordat u verdergaat, selecteert u de volledige kolom die de gensymbolen bevat.Selecteer bewerken en vervolgens vervangen in het uitklapmenu van het bestand. Typ een openend haakje, een asterisk en een sluitend haakje in het veld 'Zoeken naar' van het vervangvenster, en laat het veld 'Vervangen door' leeg. Selecteer Alles vervangen om alle instanties van haakjes te verwijderen.Om verrijkte pathways te bepalen, kopieert u de gewenste gensymbolen naar het klembord. Ga naar ConsensusPathDB en selecteer gene set analysis in de linkerzijbalk van de webpagina, gevolgd door over-representation analysis. Plak de lijst met genen in het vak paste a list of gene and protein identifiers.Selecteer het gensymbool in het vak voor het type gen/proteïne-identificator en klik op proceed. Selecteer in de sectie pathway-based sets het vakje naast pathways as defined by pathway databases. Selecteer find enriched sets om de lijst met pathways te verkrijgen die genen uit de invoerlijst bevatten.Selecteer alle verrijkte pathways die u in een pathway-netwerk wilt visualiseren door elk vakje naast de pathway-namen aan te vinken of door op 'all' te klikken onder 'select' in de kolomkop boven de selectievakjes. Selecteer vervolgens 'visualize selected sets'. Pas de filters voor relatieve overlap en gedeelde kandidaten aan door op een van de vakjes bovenaan in het midden van de pagina te klikken en het gewenste percentage, de relatieve overlap of het aantal gedeelde kandidaten in te voeren, en selecteer daarna 'apply'.Om de verrijkte gen-ontologieën te bepalen, kopieert u de gensymbolen van de betreffende groep naar het klembord. Ga naar de GO Enrichment analysis tool van het Gene Ontology Consortium. Plak de lijst met gensymbolen in het vak aan de linkerkant van de pagina, onder 'your gene IDs here'.Select onder het vak voor gen-ID's de GO-term "biological process". Selecteer vervolgens danio rerio onder het vak voor GO-terms en klik op submit. Voer QRT-PCR uit en vergelijk dit met RNASeq, volgens het tekstprotocol.Sequencing van geëxtraheerd RNA uit larven die waren geïnjecteerd met Morpholinos tegen respectievelijk alms1 of bbs1 onthulde de genen die uniek op- en neergereguleerd waren in de Alstrom- en BBS-modellen, evenals de genen die in beide modellen significant waren veranderd. Om het moleculaire profiel van het Alstrom-model duidelijker te herleiden, werden de pathways en gen-ontologieën geïdentificeerd die verrijkt waren in de differentieel tot expressie gebrachte genen. Zoals hier getoond, waren in totaal 31 pathways opgereguleerd.Naast de brede groepering van het metabolisme waren de meest getroffen pathways het aangeboren en adaptieve immuunsysteem, met respectievelijk 32 en 20 genen. Downstream B-celreceptor-signaleringsgebeurtenissen waren eveneens verrijkt. Verschillende signaalpaden waren ook verrijkt onder de opgereguleerde genen, wat consistent is met de associatie van het Alström-syndroom met dysfunctie van het primaire cilium.Daarnaast waren drie routes geassocieerd met insulinesecretie upgereguleerd: vetzuren gebonden aan GPR40, vrije vetzuren en acetylcholine. Ten slotte waren zes GO-termen verrijkt onder de upgereguleerde genen in het Alström-model, waaronder erytrocytendifferentiatie, erytrocytenhomeostase, myelocytehomeostase en homeostatische processen. Zodra de methode onder de knie is, kan de analyse van routes en GO-termen in minder dan een uur worden voltooid.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de selectie van pathway-parameters en afkapwaarden de belangrijkste overwegingen zijn bij het interpreteren van de resultaten van RNASeq-expressievergelijkingen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals toepassing met mutantlijnen en transcriptoomanalyse van enkelvoudige celtypen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals transcriptoomprofilering van celtypen en veranderingen in genexpressie onder controle van specifieke genen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe zebrafish-transcriptomische data gegenereerd door RNASeq gebruikt kunnen worden voor de identificatie van significante veranderingen in genexpressie tussen experimentele monsters.

sample-preparation-analysis-rnaseq-based-gene-expression-data-from

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

De isolatie van hoge kwaliteit, intact RNA is een essentiële stap in veel laboratoria protocollen. Hier laten we zien RNA-extractie uit hele zebravis embryo's en cDNA synthese voor verdere toepassing in de verschillende experimentele procedures, zoals het gen expressie microarray analyse.

RNA isolatie van embryonale zebravis en cDNA synthese voor de analyse van genexpressie

Gen microarrays zijn krachtige tools in gen expressie profilering bij een genoom-brede niveau. Deze technologie heeft toepassing in een verscheidenheid van biologische disciplines, waaronder ontwikkelingsbiologie en toxicologie. In deze video, we detail een protocol voor de wereldwijde genexpressie analyse met behulp van een uitgebreid oligonucleotide microarray platform voor de zebravis.

Global analyse van genexpressie met behulp van een zebravis oligonucleotide microarray platform

Het artikel beschrijft een protocol om zebravisembryo's te genereren door natuurlijke paring en het sorteren van hun ontwikkelingsstadia. Het protocol wordt verder gebruikt voor de analyse van pancreas β-cellen met behulp van transgene vissen.

Paring en ei-enscenering: een methode om embryo's te genereren en ze te sorteren op ontwikkelingsfase

Cardiale genexpressie profielen te analyseren tijdens zebravis ontwikkeling van het hart, heeft totaal RNA worden geëxtraheerd uit geïsoleerde harten. Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van functionele / kloppende harten door snelle handmatige dissectie van de zebravis embryo's tot cardiale-specifieke mRNA te verkrijgen.

Grootschalige de zebravis embryonale Hart Dissection voor Transcriptionele Analyse

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

Zebravis onlangs gewend waren als een modelsysteem in vivo DNA replicatie timing tijdens ontwikkeling bestuderen. Hier is gedetailleerde de protocollen voor het gebruik van embryo's de zebravis profiel replicatie timing. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van replicatie timing mutanten, individuele celtypes, ziekte modellen en andere soorten.

Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo

Hier presenteren we een protocol voor model menselijke tuberculose in een volwassen zebrafish met behulp van de natuurlijke ziekteverwekker Mycobacterium marinum. Geëxtraheerde DNA en RNA van de inwendige organen van besmette zebrafish kan worden gebruikt om te onthullen dat het totaal mycobacteriële ladingen in de vis en de immuunrespons van de gastheer met qPCR.

Modelleren van tuberculose in Mycobacterium marinum besmet volwassen zebravis

Skeletspierregeneratie wordt aangedreven door weefsel ingezeten spierstamcellen, die bij veel spierziekten zoals spierdystrofie worden aangetast, en dit resulteert in het onvermogen van spieren om te regenereren. Hier beschrijven we een protocol dat het mogelijk maakt om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekte.

Het onderzoeken van Spierregeneratie in Zebrafish Modellen van Spierziekte

Zebravis gericht op reactieve elektrofielen en oxidanten (Z-REX) is een op chemische biologie gebaseerde methode voor het onderzoek van reactieve signalering van kleine moleculen. Deze techniek kan worden toegepast op levende vissen van verschillende ontwikkelingsstadia. Hier koppelen we standaardtests in zebravissen aan Z-REX voor signaalrouteanalyse.

Monitoring van on-target signaalreacties bij larvale zebravissen - Z-REX ontmaskert precieze mechanismen van elektrofiele geneesmiddelen en metabolieten

Hier presenteren we een protocol om eiwitten te labelen met een fluorescentie-eiwitlabel in zebravislarven, een nieuw ontwikkeld en aangepast in vivo systeem dat vooral nuttig is voor het visualiseren van eiwitten met een lage abundantie in zebravissen.

Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren

RASopathieën zijn multisysteem-genetische syndromen die worden veroorzaakt door hyperactivering van de RAS-MAPK-route. Potentieel pathogene varianten die wachten op validatie duiken continu op, terwijl slecht preklinisch bewijs de therapie beperkt. Hier beschrijven we ons in vivo protocol voor het testen en kruisvalideren van RASopathie-geassocieerde ERK-activeringsniveaus en de farmacologische modulatie ervan tijdens de embryogenese door middel van live FRET-beeldvorming in Teen-reporter...

Een efficiënt protocol om ERK-activiteitsmodulatie te beoordelen in vroege zebravismodellen van het Noonan-syndroom via live FRET-microscopie en immunofluorescentie

Leer RNASeq-gebaseerde transcriptoomanalyse voor genexpressieprofielen in zebravisembryo's en larven. Deze methode ondersteunt kwantitatieve vergelijkingen en validatie door qRT-PCR in ontwikkelingsbiologie.

Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis

Meer video's verkennen