Protocol voor de vaste fase synthese van oligomeren van RNA die een 2'- O -thiophenylmethylmodificatie en karakterisering via cirkelvormige dichroïsme
July 28th, 2017
Dit artikel geeft een gedetailleerde procedure voor de solide fase synthese, zuivering en karakterisering van dodecamers van RNA gemodificeerd op de C2'- O- positie. UV-vis en cirkelvormige dichroïstische fotometrische analyses worden gebruikt om structurele aspecten te kwantificeren en karakteriseren, dwz enkelstrengen of dubbelstrengen.
Het algemene doel van dit rapport is om de procedure te illustreren om oligonucleotiden van RNA via vastefasesynthese te verkrijgen. RNA-dodecamers worden gesynthetiseerd als modellen en ook hun zuivering en karakterisering zullen worden gedemonstreerd. Door middel van zijn visuele component zal deze publicatie het bereik van de methodologieën en faciliteiten die worden gebruikt door onderzoekers in verschillende velden verbreden.
Het verstrekken van een visuele hulp, samen met een klein protocol, zal onderzoekers in staat stellen deze technieken toe te passen. Een voordeel van deze techniek is dat deze techniek geschikt is voor een breed scala aan modificaties. Naarmate de toepassingen van vandaag veeleisender worden, is het belangrijk om een standaardprotocol te hebben.
De fosforamidietfysica ervaart een heropleving vanwege de robuustheid van de methode en het potentieel voor het verkrijgen van oligonucleotiden voor therapeutische toepassingen. Hoewel het kopen van oligonucleotiden aantrekkelijk is, verplaatsen prijs en beschikbaarheid van modificaties de interesse naar het bereiden van deze oligomeren in eigen beheer, waardoor deze procedure van het grootste belang wordt. Om deze procedure te beginnen, weegt u elk fosforamidite in ovengedroogde 10-milliliter amberkleurige flesjes en sluit u elke fles af met een septum dat eerder is doorboord met een 20-gauge naald.
Plaats de flesjes onmiddellijk onder vacuüm met behulp van een desiccator die een droogmiddel bevat. Nadat de desiccator met droge argon is gevuld, verwijdert u elke fles en voegt u onmiddellijk anhydrous acetonitril toe voordat u het op een vastefasepeptidesynthesizer bevestigt. Vervolgens verwijdert u de septa van elke fles en plaatst u deze op de synthesizer via een fleswisselfunctie.
Om de vastefasesynthese op te zetten, selecteert u het softwarepictogram. Selecteer de naam van de synthesizer en klik op OK. Maak vervolgens een nieuwe synthese door Bestand en Nieuwe syntheseorder te selecteren. Gebruik vervolgens het promptvenster om de uitvoerdatum, klant en uitvoer-ID in te voeren. Selecteer het instrument, sequentienaam en sequentie.
Onder het tabblad Cyclus wijst u de eerder gemaakte methode toe. Kies vervolgens de handmatige eindprocedure, die het oligonucleotide aan de CPG-hars laat gebonden. Selecteer DMT Uit.
Sla het bestand op door Bestand en Opslaan als te selecteren. Geef vervolgens een naam voor het experiment en klik op Opslaan. Stuur vervolgens het bestand om de synthese te starten door Order en Order naar synthesizer te selecteren. Selecteer op het promptvenster een kolompositie en klik op OK. Selecteer op het Synthesizer-venster Trityl Monitor.
Klik op Kies functie en Trityl Monitor elke stap door 1 in te typen. Begin de synthese door Synthesizer en Klaar om te starten te selecteren. Plaats de kolommen met het gewenste drie-prime-uiteinde op de posities die op het instrument zijn aangegeven.
Klik vervolgens op Start en Nee op het instrument. Zodra de synthese voltooid is, verwijdert u de kolom uit het instrument en plaatst u deze in een ronde bodemfles. Droog de kolom onder verminderde druk gedurende ongeveer 0,5 uur.
Breng de witte hars van de kolom over in een 1,6-milliliter centrifugeerbuisje en voeg 0,5 milliliter van een waterige methylamine en ammoniakoplossing toe. Bevestig de centrifugeerbuisjesdop met parafilm en verwarm de inhoud gedurende anderhalf uur tot 60 graden Celsius. Plaats een zwaar voorwerp op de buisjes om ervoor te zorgen dat de concentratie constant blijft.
Na afkoeling tot kamertemperatuur, centrifugeert u het monster kort om de inhoud naar beneden te centrifugeren. Breng vervolgens het supernatant over naar een nieuw centrifugeerbuisje. Koel de buis tot 70 graden Celsius door deze vijf minuten in een dry-ice ethanolbad te plaatsen en concentreer vervolgens tot droog met een speed vac concentrator.
Resuspendeer nu de vaste stoffen in 0,4 milliliter van een aminetrihydrafluoride-oplossing en bevestig vervolgens de dop met laboratoriumfolie. Verwarm de oplossing gedurende anderhalf uur tot 60 graden Celsius. Plaats een zwaar voorwerp op de buisjes om een constante concentratie te garanderen.
Nadat de oplossing is afgekoeld tot kamertemperatuur, voegt u 0,04 milliliter van een natriumacetaatoplossing toe, gevolgd door zachtjes mengen met een pipettip. Voeg een milliliter ethanol toe en koel de oplossing af tot ongeveer 70 graden Celsius met een dry-ice ethanolbad gedurende 15 minuten. Centrifugeer vervolgens de oplossing gedurende tien minuten bij 15.000 RPM bij vier graden Celsius.
Gebruik een pipet om het supernatant te extraheren en droog het resulterende pellet onder verminderde druk. Na het drogen, resuspendeert u het verkregen vaste stof en laadbuffer en mengt u tot de oplossing homogeen is. Laad vervolgens de suspensie op een eerder bereide polyacrylamidegel.
Breng een stroom door de gel tot de bromothymolblauwe marker zich tussen de helft en tweederde van de gel bevindt. Nadat de gel uit de standaard is verwijderd, brengt u de gelinhoud over van het glas naar de plasticfolie en plaatst u deze over een dun laagchromatografieplaatje bedekt met silica, om de banden zichtbaar te maken met behulp van een UV-lamp. Gebruik een marker om de positie af te bakenen waar de bovenste band zich bevindt en snijd deze met een scheermesje.
Plaats de gel met de RNA in een 50-milliliter conische buis en verpletter hem tot kleine stukjes met behulp van een glazen staaf. Suspensieer vervolgens de gelresten in een waterige natriumchlorideoplossing en schud de suspensie gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius. Breng de suspensie over in een 15-milliliter buisje en centrifugeer vervolgens gedurende tien minuten bij 3400 RPM.
Om de steekproef te ontzouten met behulp van een reverse-phase C18-cartridge, was u eerst de cartridge met acetonitril, water, waterige ammoniumchloride en de RNA-oplossing, waarbij de gelresten achterblijven. Na het wassen met water, elueert u het RNA uit de kolom met drie milliliter 60% waterige methanoloplossing in drie verschillende testbuisjes. Koel de buisjes af tot 70 graden Celsius in een dry ice-bad gedurende vijf minuten en concentreer vervolgens de inhoud tot droogheid met behulp van een speed vac concentrator.</
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel illustreert de procedure voor het verkrijgen van RNA-oligonucleotiden via vaste-fase synthese, met een focus op dodecamers. Het bevat zuiverings- en karakteriseringstechnieken, waardoor de methodologieën van onderzoekers worden verbeterd.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Moleulaire biologie
- Nucleïnezuurchemie
Achtergrond
- Vaste-fase synthese is een veel gebruikte techniek voor de productie van oligonucleotiden.
- Karakterisering van RNA-structuren is cruciaal voor het begrijpen van hun functies.
- Visuele hulpmiddelen kunnen het begrip van complexe methodologieën verbeteren.
- Standaardprotocollen zijn essentieel voor reproduceerbaarheid in onderzoek.
Doel van het onderzoek
- Een gedetailleerd protocol bieden voor het synthetiseren van RNA-dodecamers.
- Zuivering en karakteriseringsmethoden demonstreren.
- Het scala aan beschikbare methodologieën voor onderzoekers verbreden.
Gebruikte methoden
- Vaste-fase synthese van RNA-dodecamers.
- Zuiveringstechnieken voor oligonucleotiden.
- UV-vis fotometrische analyse voor kwantificering.
- Circulair dichroïsme voor structurele karakterisering.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle synthese van RNA-dodecamers werd bereikt.
- Karakterisering bevestigde de structurele integriteit van het gesynthetiseerde RNA.
- De gedemonstreerde methoden zijn toepasbaar op verschillende RNA-modificaties.
- Visuele hulpmiddelen verbeteren het begrip van de protocollen aanzienlijk.
Conclusies
- Het gepresenteerde protocol is een waardevolle bron voor onderzoekers.
- Standaardiseerde methoden verbeteren de reproduceerbaarheid bij RNA-synthese.
- Verdere toepassingen kunnen worden verkend met behulp van de geschetste technieken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables in-house synthesis of modified RNA oligonucleotides, supporting target validation and lead identification in nucleic acid therapeutics. By providing a robust, amenability-driven method for incorporating 2'-O-thiophenylmethyl modifications, it reduces reliance on external vendors and accelerates preclinical de-risking. The integration of circular dichroism for structural assessment adds predictive value to early-stage oligonucleotide design.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through site-specific incorporation of 2'-O-thiophenylmethyl modifications to assess functional impact on RNA structure and stability.
- Operational Value: Supports rapid generation of structure-activity relationship (SAR) data by allowing synthesis of oligonucleotides with zero, one, or two modifications at defined positions.
- Predictive Value: Circular dichroism data provides quantitative structural readouts that help de-risk target engagement hypotheses before cellular or in vivo testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces purified, quantifiable RNA dodecamers suitable for use as probes or standards in binding assays and structural screening platforms.
- Operational Value: Standardized solid-phase synthesis and purification workflow (CPG support, AMA cleavage, HF/TriEtOH treatment, PAGE, and C18 RP-HPLC) ensures batch-to-batch reproducibility for assay development.
- Scalability: Methodology is amenable to parallel synthesis and can be adapted to various modifications, supporting medium-throughput oligonucleotide generation for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables generation of modified RNA constructs that mimic potential therapeutic candidates, facilitating extrapolation from chemical modification to biological activity.
- Preclinical De-risking: Observed changes in circular dichroism spectra and thermal melting (Tm) values provide early indicators of structural perturbation and duplex destabilization, informing go/no-go decisions.
- Mechanistic Insight: Allows correlation of 2'-O-thiophenylmethyl incorporation with altered RNA conformation, supporting mechanistic understanding of modification effects on target binding or ribonuclease resistance.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, supporting lead identification through structured oligonucleotide generation and biophysical characterization prior to preclinical advancement.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven synthesis of modified RNA to probe structure-function relationships and validate targets through chemical perturbation.
- Screening: Delivers quantifiable, structurally characterized oligonucleotides suitable for use in affinity-based or functional screening assays.
- Analytics: UV-vis provides accurate quantification; circular dichroism delivers secondary structure metrics (e.g., ellipticity changes) that allow comparison between modified and canonical RNA.
- Translational Research: Supports continuity from discovery to preclinical by generating modified RNA species that can be evaluated for stability, binding, and functional activity in downstream models.
- Enterprise Reuse: Phosphoramidite-based solid-phase synthesis is a platform capability applicable across multiple oligonucleotide projects, reducing revalidation burden and enabling modular adaptation to new chemistries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence by enabling precise modification placement and direct assessment of structural consequences via circular dichroism.
- Operational Value: Delivers reproducible, purified RNA oligonucleotides with defined modification patterns, reducing variability in downstream experiments.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling internal production of complex, modified oligonucleotides that may be costly or unavailable commercially.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing early biophysical data (e.g., Tm, CD shifts) to inform progression of lead candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in phosphoramidite chemistry, oligonucleotide handling, and anhydrous conditions to prevent moisture-induced synthesis failures.
- Needs access to a nucleic acid synthesizer, HPLC or C18 solid-phase extraction equipment, polyacrylamide gel electrophoresis setup, and a circular dichroism spectrometer with temperature control.
- Demands standardized workflows for synthesis, cleavage, deprotection, gel-based purification, desalting, and QC to ensure cross-team consistency.
- Must account for modification-specific coupling efficiencies and potential steric effects during solid-phase synthesis, particularly with bulky 2'-O-thiophenylmethyl groups.
- Limited by the need for specialized reagents (e.g., HF/TriEtOH for deprotection) and safety infrastructure due to hazardous chemical handling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Solid-phase Synthesis of RNA Oligonucleotides
3:25
Deprotection and Purification of RNA Oligonucleotides
7:12
Characterization via MALDI-TOF and RNA Structure Analysis vi CD
9:24
Results: Characterization of RNA Oligomers Containing 2'-Othiophenylmethyl Modification
10:25
Conclusion
![Solid-phase synthese van [4.4] Spirocyclic Oximes](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F58508.jpg%3Fv%3D2026-07-04T05%253A56%253A50.000Z&w=384&q=75)
