Name: Een stroom Cytometry gebaseerde cytotoxiciteit Assay voor de beoordeling van menselijke NK cel activiteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Leer een stroomcytometrie-gebaseerde cytotoxiciteitstest voor het meten van NK-celactiviteit bij mensen. Deze methode biedt een snel, veilig en reproduceerbaar alternatief voor radioactieve assays in diagnostiek en onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij wil Jill Narciso, UCLA Immunogenetica Center, bedanken voor haar hulp bij de voorbereiding van de manuscript.

De monsters werden verzameld volgens de ethische richtlijnen vastgesteld door het UCLA Human Research Protection Program en IRB goedgekeurd.
1. Bereiding van reagentia
OPMERKING: Tenzij anders aangegeven, dienen alle reagentia voor gebruik gedurende een bepaalde tijd bij kamertemperatuur te worden gebracht. Alle reagentia moeten steriel blijven.
<ol>
	<li>Bereid een 2x werkoplossing van Tween-20 (d.w.z. 0,2%) door 10 µL van Tween-20 oplossing toe te voegen aan 5 mL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium en magnesium met een p20 pipette.
	<ol>
		<li>Gezien de hoge viscositeit van Tween-20, neem de volgende stappen om de nauwkeurigheid te waarborgen: verzamel langzaam om belvorming te voorkomen, dompel de hele punt niet onder om carry-over te voorkomen en pipet omhoog en omlaag meerdere keren in PBS om alle Tween-20 van de punt te wassen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Voeg 2 µL van IL-2 stockoplossing (2,1E6 IU/mL) toe aan 198 µL van compleet medium (d.w.z. 1:100 verdunning), dit is RPMI met 1% penicilline-streptomycine en 10% foetaal bovien serum (FBS), ga dan verder met een extra 1:100 verdunning door 2 µL van IL-2 tussenoplossing toe te voegen aan 198 µL van compleet medium om een 7x werkoplossing te bereiden (210 IU/mL).</li>
	<li>Voeg 2 µL van CFSE stockoplossing (5 mM) toe aan 500 µL van plain medium (RPMI). Vortex, centrifugeren om druppels van de dop te verwijderen, ga dan verder met een extra 1:20 verdunning door 50 µL van de CFSE tussenoplossing toe te voegen aan 950 µL van plain RPMI om een 2x werkoplossing van 1 µM te verkrijgen. Vortex goed en beschermd tegen licht bewaren.</li>
</ol>
2. Isolatie van PBMC's als effectorcellen
OPMERKING: Deze test is gevalideerd voor effectief gebruik met totale PBMC's van gezonde controles. Het wordt echter aanbevolen dat het NK-cellinh alte wordt geverifieerd met elke PBMC-voorbereiding (Figuur 1). Ook is het volume van het gehele bloed voor verzameling gebaseerd op de frequentie van NK-cellen in het perifere bloed en dit kan van persoon tot persoon variëren, vooral tussen gezonde donoren en patiënten.
<ol>
	<li>Verzamel een minimum van 4 mL menselijk heelbloed in natrium of lithium heparine gecoate bloedverzamelbuisjes. Bewaar bloedmonsters bij kamertemperatuur na verzameling en gebruik binnen 30 uur na verzameling.</li>
	<li>Verdun heelbloed met 4 mL van PBS (d.w.z. gelijk volume van PBS tot heelbloed).</li>
	<li>Voeg 4 mL van dichtheidsgradiëntoplossing (zie tabel van materialen) toe aan een 15-mL conische buis. Leg verdund heelbloed voorzichtig over de dichtheidsgradiëntoplossing door de buis te kantelen.</li>
	<li>Centrifugeer bij 650 x g gedurende 24 min met de rem uit.</li>
	<li>Verzamel voorzichtig de laag van mononucleaire cellen, wat de dunne witte laag onder de bovenste laag plasma en bloedplaatjes is, in een nieuwe 15-mL conische buis. Breng het volume naar 15 mL met PBS.</li>
	<li>Centrifugeer bij 450 x g gedurende 10 min met de rem aan. Aspeer de supernatant en suspendeer cellen in 0,5 mL van compleet medium.</li>
	<li>Gebruik een geautomatiseerde celteller of hemocytometer om de cellen te tellen, en pas de PBMC concentratie aan tot 5x106 cellen/mL met compleet medium.</li>
	<li>Controleer het NK-cellinh alte door middel van flowcytometrie (zie stap 4).</li>
	<li>Start de test binnen 30 min. Houd cellen maximaal 10 min op kamertemperatuur, of plaats in een bevochtigde 5% CO2 incubator bij 37 °C totdat ze klaar zijn voor gebruik.</li>
</ol>
3. Isolatie van NK-cellen als effectorcellen
OPMERKING: Dit deel van het protocol is een alternatief voor het gebruik van totale PBMC's als effectorcellen. De typische opbrengst uit 4 mL van het gehele bloed van een gezond individu is ongeveer 4x105 NK-cellen, of ongeveer 5-15% van PBMC's, hoewel deze frequentie varieert tussen donoren 21. Het wordt aanbevolen dat een zuiverheidscontrole wordt uitgevoerd na de isolatie.
<ol>
	<li>Verzamel een minimum van 4 mL menselijk heelbloed in natrium of lithium heparine gecoate bloedverzamelbuisjes. Neem 50 µL van heelbloed om als pre-verrijkingsmonster te kleuren.</li>
	<li>Voeg de verrijkingscocktail toe aan bloedmonsters bij 50 µL/mL (zie tabel van materialen). Meng goed en incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg een gelijk volume van PBS + 2% FBS toe om het monster te verdunnen en meng voorzichtig goed.</li>
	<li>Voeg 4 mL van dichtheidsgradiëntoplossing toe aan een 15-mL conische buis. Leg het verdunde monster voorzichtig op de top van het dichtheidsgradiënt medium.</li>
	<li>Centrifugeer bij 1.200 x g gedurende 10 min met de rem uit.</li>
	<li>Verzamel voorzichtig de laag van verrijkte cellen in een nieuwe 15-mL conische buis. Was de cellen door het volume op te brengen tot 50 mL met PBS + 2% FBS.</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 min. Gooi de supernatant weg en herhaal de wassing.</li>
	<li>Aspeer de supernatant en suspendeer cellen in 0,5 mL van compleet medium.</li>
	<li>Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller of hemocytometer en pas de concentratie

<ol><li>Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+NK+cell+responses+in+HIV+infection%3A+I.+NK+cell+receptor+genes+as+determinants+of+HIV+resistance+and+progression+to+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS.</a> J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).</li>
<li>Caligiuri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human natural killer cells.</a> Blood. 112 (3), 461-469 (2008).</li>
<li>Topham, N. J., Hewitt, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+cytotoxicity%3A+how+do+they+pull+the+trigger%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger?</a> Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).</li>
<li>Warren, H. S., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NK cells and apoptosis.</a> Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).</li>
<li>Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry-based+Assay+for+the+Monitoring+of+NK+Cell+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li>
<li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLoS One. 10 (10), e0141074(2015).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).</li>
<li>Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+mechanism+of+natural+killer+%28NK%29+degranulation+and+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity.</a> J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).</li>
<li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells%3A+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).</li>
<li>Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+natural+killer+cell+function+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Determination of natural killer cell function by flow cytometry.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).</li>
<li>Jang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+flow+cytometry-based+natural+killer+cytotoxicity+assay+involving+calcein+AM+staining+of+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Lab+Sci%22%5BJournal%5D)">An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells.</a> Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).</li>
<li>Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-release+assay+for+natural+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.</a> J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).</li>
<li>Karimi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cytotoxicity+by+bioluminescence+imaging+outperforms+the+standard+chromium-51+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay.</a> PLoS One. 9 (2), e89357(2014).</li>
<li>Oppenheim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyco-engineered+anti-EGFR+mAb+elicits+ADCC+by+NK+cells+from+colorectal+cancer+patients+irrespective+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy.</a> Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).</li>
<li>West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+cytotoxic+reactivity+of+human+lymphocytes+against+a+myeloid+cell+line%3A+characterization+of+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells.</a> J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).</li>
<li>Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+CFSE-based+assay+to+determine+susceptibility+to+lysis+by+cytotoxic+T+cells+of+leukemic+precursor+cells+within+a+heterogeneous+target+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population.</a> Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).</li>
<li>Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flow+cytometric+assay+for+quantitation+and+multiparametric+characterization+of+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity.</a> J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).</li>
<li>Carotta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+NK+Cells+for+Anticancer+Immunotherapy%3A+Clinical+and+Preclinical+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches.</a> Front Immunol. 7, 152(2016).</li>
<li>Mandal, A., Viswanathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells%3A+In+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Oncol+Stem+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells: In health and disease.</a> Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).</li>
<li>Rezvani, K., Rouce, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Application+of+Natural+Killer+Cell+Immunotherapy+for+the+Treatment+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer.</a> Front Immunol. 6, 578(2015).</li>
<li>Angelo, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+NK+cell+phenotyping+and+variability+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults.</a> Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).</li>
<li>Zons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+europium+and+chromium+release+assays%3A+cytotoxicity+in+healthy+individuals+and+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).</li>
<li>Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+sex%2C+menstrual+cycle%2C+and+oral+contraceptives+on+the+number+and+activity+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells.</a> Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).</li>
<li>Laue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+NK+cell+function+in+obese+healthy+humans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Obes%22%5BJournal%5D)">Altered NK cell function in obese healthy humans.</a> BMC Obes. 2, 1(2015).</li>
<li>Hazeldine, J., Lord, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+ageing+on+natural+killer+cell+function+and+potential+consequences+for+health+in+older+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults.</a> Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen conflicten van belangen.

De hier beschreven methode biedt een eenvoudige en rendabele alternatief voor de traditionele 51Cr release assay te beoordelen van de NK-cel cytotoxische activiteit. Deze methode is de gevoelig, reproduceerbaar zijn, en minder tijd in beslag dan de vorige standaard methoden, zoals CRA, en kan worden gebruikt voor zowel klinische en onderzoek toepassingen.
Terwijl de test met zowel totale PBMCs en verrijkte NK-cellen werkt, is de optie PBMCs gebruiken zonder de noodzaak voor het zuiv...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56191/a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk">A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity</a>. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Target cell death vs effector ratio graph; healthy donor vs patient comparison, percent cell death." src="/files/ftp_upload/56191/56191fig4v1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4">
to:
<img alt="Effector:Target cell death comparison graph, healthy donor vs patient, cytotoxicity analysis." src="/files/ftp_upload/56191/56191fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4">

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56191/a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk">A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity</a>. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.

Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Natural killer (NK) cellen zijn een verfijnde subset van menselijke aangeboren lymfocyten kritisch die betrokken zijn bij de eliminatie van viraal geïnfecteerde cellen, getransformeerde cellen, en andere pathogene bedreigingen 1,2. NK-cel lytische korrels huis cytotoxische eiwitten, zoals Perforine en granzymes. Na activatie, NK-cellen vormen een complexe interactie met hun doelen bekend als immunologische synapse, waarbij deze cytolytische moleculen lokaal vrijgegeven zijn, wat resulteert in de lysis van de cel van de directe doel en apoptosis, samen met cytokine en chemokine release en uiteindelijk in de inductie van een inflammatoire staat 1,3,4.
NK-cel-activatie gaat om een complexe reeks van activeren en remmende interacties tussen NK cel receptoren en liganden uitgedrukt op het oppervlak van doelcellen, vormen een strak gereguleerde systeem. Een van de meest bestudeerde mechanismen van NK cel activatie is het "ontbrekende zelf". Inderdaad, gebrek aan opsporing van klasse die ik major histocompatibility complex (MHC) of human leukocyte antigeen (HLA) moleculen, op geïnfecteerd of cellen triggers NK cel cytotoxiciteit worden omgezet. Tumor en virus-geïnfecteerde cellen in het algemeen downregulate deze antigenen te ontsnappen van T-cel-gemedieerde immuniteit, zo wordend primaire NK cel doelstellingen 1,3,4.
Beoordeling van NK-cel functie is hoofdzakelijk onderverdeeld in degranulatie of cytotoxiciteit testen. Degranulatie testen, zoals stroom cytometrische detectie van de degranulatie-geassocieerde markering CD107a, zijn echter slechts indicatief van NK-cel activatie en niet van hun uiteindelijke functie, de directe moord op target cellen 5,6,7,8. Vandaar heeft deze beperking getrokken onderzoekers cytotoxiciteit testen als een meer vertellen en meer directe alternatief.
De lange tijd "gouden standaard" voor de beoordeling van cel-gemedieerde cytotoxische activiteit van zowel T en NK-cellen is de chroom release assay (CRA). CRA omvat het radioactief labelen van doelcellen met 51Cr en broeden ze samen met effector cellen. Deze test is doordrenkt van het beginsel dat lysis van de cel resulteert in het vrijkomen van eiwit-gebonden 51Cr in de bovendrijvende substantie, die kan worden gemeten door het tellen van de gamma. Deze assay, terwijl effectief, is problematisch voor een verscheidenheid van redenen: hoge materiaalkosten, behandeling en verwijdering van radioactieve 51Cr, spontane release van 51Cr en moeilijk standaardisering - waardoor het totaal onpraktisch 9,10.
Een aantal niet-radioactieve testen, met fluorescerende labeling, enzym release en zelfs bioluminescentie, zijn sindsdien ontwikkeld als alternatief voor CRA 11,12,13,14. Hier beschrijven we een stroom cytometry gebaseerde methode voor meting van de NK-cel cytotoxische activiteit op K562 doelcellen thats eenvoudig, gevoelige en reproduceerbaar. K562 cellen zijn een menselijke erythroleukemic cel lijn met verminderde expressie van HLA-klasse I en verhoogde expressie van liganden voor activatory NK receptoren, waardoor ze bijzonder vatbaar voor NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit 15. In deze test, K562 cellen worden vooraf aangeduid met carboxyfluorescein DIACETAAT succinimidyl ester (CFSE) en mede gekweekt in verschillende verhoudingen met beide perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) of gezuiverd van NK cellen 1. CFSE is een stabiele, binding aan eiwitten fluorescerende kleurstof waarmee discriminatie van doelcellen van effector NK cellen 16,17. Na de co incubatie, wordt een nucleïnezuur vlek, specifiek doordringt het membraan van dode cellen, gebruikt voor het identificeren van gedode doelcellen (zie tabel van materialen). De monsters worden vervolgens verworven op een cytometer van de stroom om te bepalen van het percentage van doden (dat wil zeggen, vlek +) CFSE + doelcellen.
Deze test kan worden gebruikt als een routinematige diagnostische screening voor monogeen gebreken op het gebied van het NK cel compartiment, waarvan er ongeveer 30 bekende gebreken veroorzaakt functionele of klassieke NK-cel-deficiëntie, aanwezig zijn en voor primaire of secundaire hemophagocytic lymphohistiocytosis. Het is ook nuttig NK cel activiteiten bij patiënten met terugkerende, ernstige herpes virale infecties, te evalueren immuunsysteem reconstitutie na transplantatie van hematopoïetische cel of post immunomodulerende therapie 18,19,20, en voor een heleboel applicaties van fundamenteel onderzoek te onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>Fosfaat-gebufferde Saline (1x, zonder Ca2+ en Mg2+)</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Heat-inactivated Fetal Bovine Serum</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td>Voorraad oplossing bij 10.000 U/mL</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>Gelyofiliseerd uit een 0,2 μm gefilterde oplossing in Acetonitrile en TFA met BSA als dragereiwit. Reconstrueer met 500 ul bij 100 μg/mL in steriele 100 mM azijnzuur bevattend ten minste 0,1% bovien serumalbumine (2,1x10E6 IU/ml)</td></tr><tr><td>K562 Cellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>Kankercel lijn&nbsp;</td></tr><tr><td>T-75 celcultuur kolven</td><td>Corning</td><td>431464</td><td></td></tr><tr><td>CFSE celproliferatie kit</td><td>Life Technologies (CellTrace)</td><td>C34554</td><td>Reconstitueer 1 vial met 18 ul DMSO om een 5mM voorraadoplossing te bereiden. Niet invriezen/ontdooien.</td></tr><tr><td>Sytox Red</td><td>Life Technologies</td><td>S34859</td><td>Voorraadoplossing wordt geleverd bij 5 μM in 1 mL DMSO. De DMSO-oplossing kan worden onderworpen aan meerdere vries-ontdooicycli zonder reagentendegradatie.</td></tr><tr><td>Natrium/lithium heparine bloedopnamebuisjes</td><td>BD</td><td>02-687-95</td><td></td></tr><tr><td>U-bodem 96-well plate</td><td>Corning</td><td>CLS3897</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyreen ronde bodembuizen (5mL)</td><td>BD Falcon</td><td>14959-5</td><td></td></tr><tr><td>50 mL polypropyleen conische buis</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 mL polypropyleen conische buis</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Reagens reservoir</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>Human NK cel verrijking cocktail</td><td>StemCell Technologies (RosetteSep)</td><td>15065</td><td></td></tr></tbody></table>

een stroom cytometry gebaseerde cytotoxiciteit assay voor de beoordeling van menselijke nk cel activiteit

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Binnen het ingeboren immune systeem spelen effector lymfocyten bekend als de natural killer (NK) cellen een essentiële rol in de verdediging van de gastheer tegen afwijkende cellen, specifiek elimineren tumoraal en viraal geïnfecteerde cellen. Ongeveer 30 bekende monogeen gebreken, samen met een gastheer van andere pathologische condities, veroorzaken functionele of klassieke NK-cel-deficiëntie, manifesteren verminderd of afwezig cytotoxische activiteit. Historisch, is cytotoxiciteit onderzocht met radioactieve methoden, die omslachtig, duur en mogelijk gevaarlijk zijn. Dit artikel beschrijft een gestroomlijnde, klinisch toepasselijke stroom cytometry gebaseerde methode om te kwantificeren NK cel cytotoxische activiteit. In deze test zijn perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) of gezuiverde NK cel preparaten mede bebroede op verschillende verhoudingen met een doel tumor cellijn bekend te zijn gevoelig voor NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit (NKCC). De doelcellen zijn vooraf gelabelde met een fluorescente kleurstof toe hun discriminatie uit de effector cellen (NK-cellen). Na de incubatieperiode, worden gedood doelcellen aangeduid met een vlek van nucleic zuur, die specifiek dode cellen doordringt. Deze methode is vatbaar voor zowel diagnose en onderzoek toepassingen en dankzij de mogelijkheden van de Multi-parameter van stroom cytometry, heeft het toegevoegde voordeel potentieel in staat te stellen een diepere analyse van NK-cel fenotype en functie.

Voordat u de test, is het sterk aanbevolen dat de inhoud van de cel van de NK worden beoordeeld bij de effector populatie van keuze. Figuur 1 toont een typische CD56 kleuring vóór (lichtblauw) en na (rood) NK cel verrijking. NK cellen bestaan uit maximaal 15% van PBMCs en moeten ten minste 80% zuiver na verrijking.
Flow analyse van de cytometrische in deze bepaling impliceert detectie van twee param...

Een stroom cytometry gebaseerde methode om kwantitatief de cytotoxische activiteit van menselijke natural killer cellen wordt hier weergegeven.

Een stroom Cytometry gebaseerde cytotoxiciteit Assay voor de beoordeling van menselijke NK cel activiteit

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Het algemene doel van deze procedure is het beoordelen van de cytotoxische activiteit van menselijke NK-cellen. Deze methode kan worden gebruikt om patiënten met zowel een functionele als een klassieke NK-celdeficiëntie te monitoren. De belangrijkste voordelen van deze op flowcytometrie gebaseerde techniek zijn dat deze sensitief en reproduceerbaar is, en sneller is dan standaardmethoden voor de beoordeling van de NK-celfunctie, zoals de radioactieve chroomvrijgave-assay.Deze methode kan worden gebruikt om nieuwe therapieën gericht op NK-cellen te testen, evenals voor diepgaande multi-parameter flowcytometrische analyses van de biologie van NK-cellen, wat voorheen onmogelijk was. Begin met het isoleren van perifere mononucleaire bloedcellen, of PBMC's, uit volbloedmonsters middels dichtheidsgradiëntscheiding volgens standaardprotocollen. Het gebruik van PBMC's in plaats van gezuiverde NK-cellen is zeer voordelig bij het werken met klinische monsters.Verdun de geïsoleerde cellen tot een concentratie van 5 x 10⁶ cellen per milliliter in volledig medium en verzamel de K562-doelcellen onmiddellijk door centrifugatie. Resuspendeer 5 x 10⁵ K562-cellen in 500 µL vers medium aangevuld met 1% FBS. Label vervolgens de doelcellen met 500 µL CFSE-werkoplossing en meng de celoplossing voorzichtig door drie tot vijf keer te pipetteren.Na 10 minuten bij 37 °C, beschermd tegen licht, wordt de labelingsreactie gestopt door 10 milliliters compleet medium toe te voegen gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Verzamel na afloop van deze incubatie de cellen door middel van centrifugatie en resuspendeer het pellet van de gelabelde doelcellen in één milliliter compleet medium voor het tellen. Verdun de cellen vervolgens tot een concentratie van 1 × 10⁵ cellen per milliliter in vers compleet medium en plaats de doelcellen in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO₂.Om een succesvolle assay te verkrijgen, moet de stress van de targetcellen tot een minimum worden beperkt en moeten de effectorcellen zo snel mogelijk na verzameling worden getest. Label binnen 30 minuten na het labelen van de targetcellen een 96-well plaat met een U-bodem voor weefselkweek volgens de tabel. Voeg vervolgens 100 µL compleet medium toe aan de wells met een effector-tot-targetcellratio van 25:1, 12,5:1 en 6,25:1, de wells met alleen targetcellen en de wells met alleen effectorcellen.Voeg 100 µL effectorcellen toe aan de putjes voor de cytotoxiciteitscontrole en de putjes met een effectorcel-doelcelverhouding van 50:1 en 25:1. Begin vervolgens bij het putje met de 25:1 effectorcel-doelcelverhouding en breng 100 µL cellen over naar het putje met de eerstvolgende lagere celverhouding voor de volgende twee putjes, waarbij de putjes met alleen doelcellen worden overgeslagen. Meng de inhoud goed tussen elke celoverdracht en voeg de laatste 100 µL cellen toe aan de putjes met alleen effectorcellen. Voeg 100 µL van een 2X 0,2% Tween-werkoplossing toe aan de K562-positieve sterftekontroleputjes met alleen Tween.Voeg 30 µL van de werkoplosging uit flacon twee toe aan de putjes van de positieve controle voor NK-celcytotoxiciteit. Voeg vervolgens 1 × 10⁵ gelabelde K562-doelcellen per milliliter in 100 µL compleet medium toe aan alle putjes, behalve aan de putjes die alleen effectorcellen bevatten. Wanneer alle cellen zijn geplaatst, worden alle putjes gemengd met de multichannelpipet.Zet de cellen met een korte centrifugatie en plaats de plaat gedurende vier uur in de celkweekincubator. Plaats de plaat aan het einde van de incubatie op ijs of op een koud platform en voeg 50 µL vers bereide dode-celkleuring toe aan elke put. Meng vervolgens alle putten voorzichtig en analyseer de cellen via flowcytometrie.Flowcytometrische analyse van CSFE en dode-celkleuring na vier uur koud cultiveren, zoals zojuist aangetoond, onthult dat de cellen in de putjes met alleen doelcellen 15% celsterfte of minder vertonen. Er wordt geen CSFE-signaal gedetecteerd in de putjes met alleen effectorcellen, waarbij minder dan vijf procent celsterfte in deze putjes wordt waargenomen. Terwijl de celsterfte in de putjes met Tween-gemedieerde doding van doelcellen doorgaans boven de 85% ligt. Bij patiënten met een defect in de NK-celfunctie wordt een verminderde dodingactiviteit waargenomen bij de meeste of alle geteste ratio's in vergelijking met gezonde individuen, wat aantoont dat de NK-cellen van deze patiënten een differentiële afname van de cytotoxiciteit vertonen die correleert met een dalende effector-doelcelratio.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in zes en een half uur worden voltooid, inclusief twee uur voor voorbereiding en uitplating, vier uur incubatie en 30 minuten acquisitie. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de targetcellen en effectorcellen parallel voor te bereiden om de vertraging tussen de celvoorbereiding en het begin van de co-incubatie te minimaliseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de cytotoxische activiteit van menselijke NK-cellen tegen fluorescentie-gelabelde targetcellen kan worden gemeten via flowcytometrie.

a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier beschrijven we een methode om efficiënt uit te breiden en te zuiveren van grote aantallen menselijke NK-cellen en beoordelen hun functie.

Uitbreiding, zuivering, en functionele beoordeling van de humane perifere bloed NK-cellen

This video demonstrates the lytic activity of natural killer cells against fluorescently-stained target cells. The method enables NK cell-induced cytotoxicity measurement by staining dead cells and using a flow cytometer to quantify live and dead target cells.

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Dit protocol beschrijft een gevoelige, cel-gebaseerde cytotoxiciteit assay. Door het tellen van de afname in frequentie van levende doelwit CD4+ T-cellen in aanwezigheid van een toenemend aantal effector CD8+ T-cellen, staat deze assay toe de directe beoordeling van de cytolytische activiteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen.

Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten

Een eenvoudige en betrouwbare werkwijze is beschreven om een ​​set van NK celfuncties zoals degranulatie cytokine en chemokine productie in verschillende NK cel subsets te analyseren.

Flowcytometrie-gebaseerde test voor het toezicht op NK celfuncties

Dit werk beschrijft een geavanceerd werkproces voor de nauwkeurige en snelle bepaling van het NK (Natural Killer) celgetal en de NK celcytotoxiciteit in menselijke bloedmonsters.

Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed

Ontduiking van natuurlijke killer (NK) celgemedieerde uitroeiing door kankercellen is belangrijk voor kanker initiatie en progressie. Hier presenteren we twee niet-radioactiviteit-gebaseerde protocollen om NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit te evalueren in de richting van levertumorcellen. Daarnaast wordt een derde protocol gepresenteerd om NK-celmigratie te analyseren.

Meting van Natural Killer Cell-Gemedieerde Cytotoxiciteit en Migratie in de context van levertumorcellen

Een protocol voor het bestuderen van FcγRIIIa-gedreven gebeurtenissen door therapeutische antilichamen in menselijke natural killer cellen wordt hier beschreven. Dit kunstmatige stimulatieplatform maakt het mogelijk om stroomafwaartse effectorfuncties te onderzoeken, zoals degranulatie, chemokine / cytokineproductie en signaalroutes gemedieerd door de FcγRIIIa- en Fc-delen van antilichamen die betrokken zijn bij binding.

Beoordeling van menselijke natural killer celgebeurtenissen gedreven door FcγRIIIa betrokkenheid bij de aanwezigheid van therapeutische antilichamen

Dit protocol beschrijft een labelvrije methode voor de snelle analyse van het aantal en de activiteit van natural killer (NK) cellen met behulp van lensloze schaduwbeeldvormingstechnologie. Deze methode kwantificeert morfologische veranderingen in individuele NK-cellen door computeranalyse van hun diffractiepatronen.

In het veld inzetbaar lensloos beeldvormingsplatform voor snelle labelvrije analyse van de activering van natural killer-cellen

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde in vitro. workflow voor consistente meting van natuurlijke, chimere antigeenreceptor-gemedieerde en antistofafhankelijke cytotoxiciteit van menselijke natuurlijke moordenaars met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie.

Kwantificatie van NK-cel cytotoxiciteit versterkt door chimerische antigeenreceptoren en therapeutische antilichamen met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie

Tregs zijn krachtige onderdrukkers van het immuunsysteem. Er is een gebrek van unieke oppervlakte markers om ze te definiëren, dus, de definities van Tregs zijn vooral functioneel. Hier beschrijven we een...

Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Leer een stroomcytometrie-gebaseerde cytotoxiciteitstest voor het meten van NK-celactiviteit bij mensen. Deze methode biedt een snel, veilig en reproduceerbaar alternatief voor radioactieve assays in diagnostiek en onderzoek.

Een stroom Cytometry gebaseerde cytotoxiciteit Assay voor de beoordeling van menselijke NK cel activiteit

Meer video's verkennen