Nauwkeurige, High-throughput analyse van de bacteriële groei

Het algemene doel van dit experiment is om bacteriële groei nauwkeurig te analyseren in een high-throughput methode. Met deze procedure kunnen zowel meerdere media als verschillende stammen gelijktijdig worden getest. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de velden van de systeembiologie en microbiologie, zoals welke factoren bepalend zijn voor de celgroei.

De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat onderzoekers hiermee nauwkeurig globale parameters van de maximale groeisnelheid en de maximale populatiedichtheid in groeicurves van bacteriecellen kunnen evalueren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de groei van E. coli, kan ze ook worden toegepast op andere micro-organismen, zoals bij groeianalyses en screening van milieu-bacteriën.

Plaats ter begin vijf gesteriliseerde glazen buizen met siliconen rubberen stoppers, pipetten en de doelstammen in een sterielkast. Vlam een bunsenbrander langs de opening van de glazen buis voordat de siliconen rubberen stopper wordt verwijderd. Vlam de siliconen rubberen stopper na het openen van de buis en plaats de dop vervolgens voorzichtig terug op de glazen buis.

Gebruik vervolgens de elektronische pipet en een wegwerpserologische pipet om vijf milliliter M63 toe te voegen aan één van de glazen buisjes en 4,5 milliliter M63 aan de overige vier buisjes. Gebruik de p200-tip om een kolonie op te pikken en deze te inoculeren in het glazen buisje met vijf milliliter M63. Vortex het buisje om een suspensie te maken.

Verdun vervolgens de oplossing 10-voudig door 0,5 milliliters van deze oplossing over te brengen naar een van de vier buisjes die 4,5 milliliters M63 bevatten. Herhaal dit proces voor de overige buisjes. Nadat de openingen van de glazen buisjes en de siliconen rubberen stoppers zijn gesteriliseerd, worden de buisjes met de stoppers afgesloten.

Plaats vervolgens de vijf buizen in een voorverwarmde schuddende incubator bij 37 °C en schud deze met 200 rpm. Incubeer de cultuur overnight of gedurende 10 tot 30 uur. Voeg na incubatie met de p1000 1.000 µL M63 toe aan een wegwerpcuvet.

Plaats de wegwerpcuvet in een spectrofotometer. Start het programma bij een vaste golflengte van 600 nanometers en meet de blanco. Verplaats de vijf glazen buisjes van de schudincubator naar de clean bench.

Verwijder M63 uit de wegwerpcuvet en voeg met de p1000 1 000 µL cultuur toe aan dezelfde wegwerpcuvet. Meet vervolgens de optische troebeling van de celcultuur. Voeg daarna 250 µL gesteriliseerde 60% glyceroloplossing en 750 µL van de geselecteerde celcultuur toe aan een 1,5 mL microbuisje en meng door te pipetteren.

Plaats de overige negen microtubes in het statief voor microtubes en verdeel 100 µL van het bereide mengsel over elke buis. Bewaar de stocks in de vriezer bij -80 °C. Om de microplatenlezer in te stellen, opent u eerst de software, opent u de protocollen in de taakbeheerder en kiest u voor het maken van een nieuwe.

Select vervolgens het standaardprotocol. Open de procedure en pas de instellingen aan. Open de temperatuurinstelling en selecteer 'incubator aan'.

Stel vervolgens de temperatuur in op 37 °C en de gradiënt op 0 °C. Controleer de voorverwarming voordat u doorgaat naar de volgende stap. Open 'start kinetic' en stel de looptijd in op 24 of 48 minuten, en stel vervolgens het interval in op 30 minuten of één uur.

Open shake en stel de shake-modus in op lineair. Selecteer continuous shake en stel de frequentie in op 567 cpm. Open vervolgens read en selecteer absorbance, endpoint/kinetic en monochromators.

Stel de golflengte in op 600. Klik ten slotte op validate om te bevestigen dat de procedure correct is. Klik vervolgens op save om deze op te slaan als een nieuw programma voor toekomstig gebruik.

Voeg voor real-time registratie van de groei ongeveer 25 milliliter M63 toe aan een gesteriliseerd reagensreservoir. Voeg vervolgens 900 microliter M63 toe aan de microbuisjes ter voorbereiding op het maken van seriële verdunningen. Voeg daarna 900 microliter M63 toe aan de ontdooide glycerolstock en vortex deze.

Breng 100 microliters van de 10-voudige verdunning over naar een andere microbuis met 900 microliters M63 en vortex. Herhaal deze stap tot het gewenste aantal verdunningen is bereikt. Vul nu de putjes aan de rand van een gesteriliseerde 96-well vlakbodem microplate met 200 microliters M63, met behulp van een achtkanalenpipet.

Breng 200 µL van elk verdund monster aan in de putjes van de microplaat volgens de referentietabel. Om variaties in verspreiding door verhitting en de zaadiefficiëntie te voorkomen, mogen de putjes aan de rand van de microplaat nooit voor de monsters worden gebruikt; breng hetzelfde monster aan in meerdere putjes op verschillende locaties op de microplaat. Plaats de 96-well microplaat in de platenlezer.

Open ReadNow en de taakbeheerder en selecteer het programma. Klik op oké om te beginnen met meten. Sla de opname tot slot op als een nieuw experimenteel bestand voor data-analyse.

Hier wordt een voorbeeld getoond van een referentietabel die is opgesteld voorafgaand aan het experiment. Er is een pictogram van een 96-wellplaat getekend als een tabel van acht bij 12 om de posities van de geïnoculeerde cultuurmonsters op de 96-wellplaat aan te geven. De groeisnelheid wordt berekend door de vergelijking toe te passen op alle paren van opeenvolgende waarden van OD600.

Het gemiddelde en de standaarddeviatie van vijf opeenvolgende groeisnelheden werden berekend om de maximale groeisnelheid te schatten. De groeisnelheden van in totaal 60 celculturen zijn weergegeven in de getoonde heatmap. De overgang van wit naar rood geeft de groeisnelheden aan van laag naar hoog.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze binnen enkele minuten worden uitgevoerd, mits dit correct en in de juiste volgorde gebeurt. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u monsters voorbereidt en in de microplaat plaatst voor zeer nauwkeurige metingen van bacteriële groei in een high-throughput-formaat. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden een referentietabel op te stellen vóór het experiment, om celculturen met een lage dichtheid te vermijden en om ervoor te zorgen dat de cellen binnen 24 uur beginnen te groeien.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals de automatisering van experimentele manipulatie en computationele analyse, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de bepalende factoren zijn voor populatievoortplanting en de dynamiek. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in de velden van de systeembiologie en microbiologie om de fundamentele principes van celgroei te onderzoeken en de samenstellingen van cultuurmedia te optimaliseren.