Name: Nauwkeurige, High-throughput analyse van de bacteriële groei (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Leer een high-throughput methode voor precieze analyse van bacteriële groei met behulp van E. coli en andere micro-organismen. Deze techniek evalueert maximale groeisnelheid en populatiedichtheid efficiënt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs hebben niets te onthullen.

1. voorbereiden van het groeimedium Opmerking: de chemische samenstelling van minimaal middellange M63 is als volgt: 62 mM K 2 HPO 4, 39 mM KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4, 1.8 µM FeSO 4 15 µM thiamine-HCl, 0,2 mM MgSO 4 en 22 mM glucose. M63 wordt gemaakt door het mengen van drie voorraadoplossingen: vijf X oplossing, 20% glucose en MgSO 4 thiamine oplossing. Alle oplossingen bewaren bij 4 ° C.
<ol><li>Voorbereiding van de vijf X oplossing <ol><li>te bereiden FeSO 4 oplossing, gebruik een elektrische pipet en een wegwerp serologische pipet ddH 2 O toevoegen aan een centrifugebuis van 50 mL. Gebruik een P-200 om toe te voegen 0.06 mL HCl verkrijgen van 0,01 M HCl. Voeg 36 mg FeSO 4-7 H 2 O en meng goed.</li>
		<li>Meet 160 mL ddH 2 O in een maatcylinder en toe te voegen aan een bekerglas van 500 mL. Voeg de volgende in deze volgorde: 10.72 g K 2 HPO 4, 5.24 g KH 2 PO 4, 2.0 g (NH 4) 2 SO 4 en 0,5 mL FeSO 4 oplossing (bereid in stap 1.1.1).</li>
		<li>Met behulp van een pH-meter precisie op pH 7.0 door toevoeging van 2 M KOH. Giet de oplossing in een maatcylinder en ddH 2 O toevoegen aan een totaal volume van 200 mL. Steriliseren van de oplossing met behulp van een 250 mL filtratie eenheid (PVDF, 0,22 µM).</li>
	</ol></li> <li>Voorbereiden van de 20% glucose oplossing <ol><li>maatregel 200 mL ddH 2 O in een maatcylinder en giet het in een bekerglas van 500 mL. Voeg tijdens het mixen met een magneetroerder, 50 g glucose. Verdun de oplossing in een maatcylinder tot een totaal volume van 250 mL. Steriliseren van de oplossing, zoals beschreven in stap 1.1.3.</li>
	</ol></li> <li>De MgSO 4 thiamine oplossing voorbereiden <ol><li>150 mL ddH 2 O toevoegen aan een bekerglas van 500 mL. Voeg tijdens het mixen met een magneetroerder, 1.0 g van thiamine HCl en 10 g van MgSO 4-7 H 2 O. Dilute de oplossing in een maatcylinder tot een totaal volume van 200 mL. Steriliseren van de oplossing, zoals beschreven in stap 1.1.3.</li>
	</ol></li> <li>Voorbereiding van minimaal middellange M63 <ol><li>plaats van de vijf X-oplossing, de 20% glucose-oplossing, de oplossing van MgSO 4 thiamine, een elektronische Pipetteer, een P-200 Pipetteer en 200-µL Pipetteer tips op een schone bankje.</li>
		<li>Meten 155.8 mL ddH 2 O in een maatcylinder en giet het in een bekerglas van 500 mL.</li>
		<li>Met behulp van de elektronische pipet en wegwerp serologische Pipetteer 40 mL van de oplossing van de vijf X en 4 mL 20% glucose oplossing aan de gemeten ddH 2 O. toevoegen Voeg vervolgens, 0.2 mL MgSO 4 thiamine oplossing met de P-200. Steriliseren van de oplossing, zoals beschreven in stap 1.1.3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Voorbereiding van de voorraad Glycerol <ol><li>cel cultuur Opmerking: de bacteriestammen (b.v., W3110 en de verminderde genomes) zijn verkrijgbaar bij stam bank organisaties. De stammen worden meestal verkregen in de vorm van kolonies op agar platen.
	<ol><li>Plaats vijf gesteriliseerde glazen buizen met silicone rubber stoppen, een elektronische Pipet, P-1,000, 1.000-µL Pipetteer tips, P-200, 200-µL Pipetteer tips en de doel-stammen (kolonies op platen) op een schone bankje.</li>
		<li>Bloot de monding van de glazen buis naar een bunsenbrander alvorens de siliconen rubberstop te openen. Bloot de siliconen rubberstop aan de vlam nadat de buis is geopend, en plaats dan licht het GLB terug op de glazen buis.</li>
		<li>Gebruik van de elektronische pipet en wegwerp serologische Pipetteer 5 mL M63 toevoegen aan een van de glazen buizen en 4.5 mL M63 tot de andere vier buizen.</li>
		<li>De P-200 tip gebruiken om te kiezen een kolonie en het in de glazen buis met 5 mL M63 beënten.</li>
		<li>Vortex de buis te maken van een schorsing. Dan Verdun de oplossing 10-fold door 0,5 mL van deze oplossing te brengen naar één van de vier buizen met 4.5 mL M63.</li>
		<li>Herhaalt u de procedure die wordt beschreven in stap 2.1.5 voor de overige buizen. Een verdunningsreeks met vijf verschillende concentraties (verdunningen van 1, 10, 100, 1000 en 10.000) is nu klaar.</li>
		<li>Steriliseren de monden van de glazen buizen en de siliconen rubber stoppen zoals beschreven in stap 2.1.2. De buisjes met het stoppen van het GLB. Verontreiniging voorkomen door niet kreuken de silicone rubber stoppen.</li>
		<li>Plaats van de vijf buizen in een voorverwarmde schudden incubator bij 37 ° C staan en schud nu bij 200 omwentelingen per minuut. Incubeer de cultuur, 's nachts of voor 10 tot 30 h.</li>
	</ol></li> <li>Selectie van de cultuur voor de voorraad glycerol <ol><li>plaats van het voorverwarmde kamertemperatuur M63 medium, P-1,000, 1.000-µL Pipetteer tips en een wegwerp cuvette op een schone bankje.</li>
		<li>Toevoegen 1000 µL M63 aan een wegwerp Cuvet met een P-1, 000. Plaats de wegwerp cuvette in een spectrofotometer, start het programma met een vaste golflengte van 600 nm, en maatregel de blanco.</li>
		<li>De vijf glazen buizen van de schudden incubator naar de schone Bank verplaatsen.</li>
		<li>M63 negeren van de wegwerp cuvette en 1.000 µL cultuur toe te voegen aan de dezelfde wegwerp Cuvet met een P-1, 000. Meten van de optische troebelheid van de cultuur van de cel (OD 600) zoals beschreven in stap 2.2.2. 
		Opmerking: Om elke besmetting te voorkomen en om een nauwkeurige meting, bloot de glazen buizen en de stoppers naar de vlam zoals beschreven en vortex de cultuur vóór de bemonstering. Om betrouwbare resultaten, herhaalde metingen worden aanbevolen, met name wanneer de celdichtheid slinkt.</li>
		<li>Van de vijf cel culturen, kies een die is in de vroege fase van de exponentiële groei (OD 600 = 0,01 - 0.05) voor de voorraad glycerol. 
		Opmerking: Als meerdere culturen dichtheden binnen het optimale bereik hebben, het dichtst bij 0.05 gewoonlijk geselecteerd.</li>
	</ol></li> <li>Maken de glycerol voorraden voor herhaalde tests. 
	Opmerking: Dit is beschreven voor het voorbereiden van tien voorraden. Bedragen groter of kleiner kunnen worden gemaakt volgens de experimentele eisen.
	<ol><li>Plaats de gesteriliseerde oplossing van 60% glycerol, tien gesteriliseerd 1.5-mL slangen, P-1,000 en P-200, 1000 - en 200-µL Pipetteer tips en een microtube staan op een schone bankje.</li>
		<li>Voeg toe 250 µL gesteriliseerd 60% glycerol oplossing en 750 µL van de cultuur van de geselecteerde cel naar de 1.5-mL microtube en meng door pipetteren. 
		Opmerking: Het voorraad volume is variabel, maar altijd een 1:3-breedteverhouding 60% glycerol aan de cultuur van de cel; Dit resulteert in een eindconcentratie van 15% glycerol.</li>
		<li>Plaats van de resterende negen slangen in de microtube stand en afzien van 100 µL van het mengsel bereid in stap 2.3.2 aan elke buis. Er zijn nu tien identieke glycerol voorraden voor toekomstig gebruik.</li>
		<li>Opslaan van de bestanden in een diepvriezer op -80 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 3. Het verwerven van de groeikrommes <ol><li>het opzetten van de lezer microplate. 
	Opmerking: De voorwaarden weergegeven in aanhalingstekens Toon de specifieke formulering gebruikt op de plaat lezer hier gebruikt (Zie de tabel van materialen).
	<ol><li>Open de software. Open &#34; protocollen &#34; in &#34; Task Manager &#34; en kies &#34; nieuw &#34;. Kies &#34; standaardprotocol &#34;.</li>
		<li>Open &#34; Procedure &#34;, en de instellingen aanpassen. Open &#34; instellen temperatuur &#34;, en selecteer &#34; Incubator op &#34;. Instellen &#34; temperatuur &#34; tot 37 ° C en &#34; verlopende &#34; op 0 ° C. Check &#34; Preheat &#34; voordat u verdergaat met de volgende stap. Open &#34; Start Kinetic &#34;, set &#34; runtime &#34; voor 24:00:00 of 48:00:00, en &#34; Interval &#34; voor 00:30:00 of 01:00:00. 
		Opmerking: Het duurt ongeveer 1 minuut om te lezen een hele 96 goed plaat.</li>
		<li>Open &#34; schudden &#34; en stel &#34; schudden modus &#34; als &#34; lineair &#34;. Controleer &#34; CoInstituut Shake &#34; en stel &#34; frequentie &#34; op 567 cpm. Open &#34; lezen &#34;, controleren &#34; absorptie &#34;, &#34; eindpunt/kinetische &#34;, en &#34; Monochromators. &#34; Set &#34; golflengte &#34; tot 600.</li>
		<li>Klik &#34; valideren &#34; om te bevestigen dat de procedure correct is. Klik op &#34; opslaan &#34; opslaan als een nieuw programma voor toekomstig gebruik.</li>
	</ol></li> <li>Real-time opname van groei <ol><li>tekenen van een 96-wells-plaat-pictogram (8 × 12 tabel) om aan te geven van de standpunten van de geënte cultuur monsters op de 96-wells-plaat. Uitprinten van de tabel en gebruik het als een referentie voor het experiment. 
		Opmerking: Moeten de putten, gelegen aan de randen van de microplate alleen blanco medium bevatten vanwege verdamping.</li>
		<li>Plaats een gesteriliseerde 96-Wells-vlakke onderkant microplate met deksel, P-1000, 1000-µL Pipetteer tips, P-200, 200-µL Pipetteer tips, verschillende 1.5-mL slangen, een 8-meerkanaals-Pipet, een gesteriliseerde reagens reservoir, kamertemperatuur M63 en de glycerol voorraden (bereid in stap 2.3) op een schone bankje.</li>
		<li>Voeg ongeveer 25 mL M63 naar het reservoir reagens. Dit reservoir voorraad voor alle volgende stappen gebruiken.</li>
		<li>Toevoegen 900 µL M63 naar de slangen in voorbereiding voor het maken van de seriële verdunningen.</li>
		<li>Ontdooi de glycerol voorraad bij kamertemperatuur. Voeg 900 µL M63 de ontdooide glycerol materieel en vortex. Dit resulteert in een 10-fold verdunning van de oorspronkelijke glycerol voorraad.</li>
		<li>Breng 100 µL van de 10-fold verdunning naar een ander microtube met 900 µL van M63 en vortex. Dit resulteert in een 100-fold verdunning.</li>
		<li>Herhaal stap 3.2.6 totdat het gewenste aantal verdunningen worden verkregen.</li>
		<li>Vullen de putten aan de rand van de microplate met 200 µL M63 met behulp van een pipet 8-kanaals (P-200). 
		Opmerking: Deze putten kunnen worden gebruikt als de blanco.</li>
		<li>Load 200 µL van elk verdunde monster bereid in stappen 3.2.4 - 3.2.7 de putjes microplate volgens de referentietabel (stap 3.2.1). Vortex verdunde monsters voorafgaande aan laden en belasting hetzelfde monster in meerdere putten op uiteenlopende locaties op de plaat.</li>
		<li>Plaats van de 96-Wells-microplate op de afleesapparaat.</li>
		<li>Open &#34; lezen nu &#34; in &#34; Task Manager &#34; en kies het programma (punt 3.1). Klik op &#34; OK &#34; te meten. De opname op te slaan als een nieuwe experimentele bestand voor data-analyse (punt 4).</li>
	</ol></li></ol> 4. Data-analyse <ol><li>Export de resultaten van de real-time groei-gegevens (punt 3.2) naar een USB-geheugen houden als een tekstbestand. 
	Opmerking: Een 96-Wells opgemaakte resultaten (curven) wordt weergegeven op de lezer van de plaat in real time. Het uurtarief records (OD-waarden) kunnen worden geëxporteerd als een tabel; de goed nummers (bijvoorbeeld A1, B1) en de meten tijd (bijvoorbeeld 00:00:59) van de rijen en kolommen vertegenwoordigen respectievelijk.</li>
	<li>Het tekstbestand opent met een spreadsheetprogramma.</li>
	<li>De uurlijkse OD 600 leest van de 96-Wells-microplate kopiëren naar een nieuw werkblad voor verdere analyse.</li>
	<li>Aftrekken bij wordt gelezen en de achtergrond tijd nul van de uurlijkse leest van elk monster goed. 
	Opmerking: Voor het gemak, de gemiddelde waarde van de blanco wells met M63 (stap 3.2.8) kan worden gebruikt als de waarde van de achtergrond.</li>
	<li>Berekent het gemiddelde van de vijf opeenvolgende OD 600 leest te schatten van de maximale bevolkingsdichtheid. 
	Opmerking: De grootste gemiddelde waarde van de vijf opeenvolgende OD 600 leest wordt gedefinieerd als de maximale OD 600 van de overeenkomstige groeikromme.</li>
	<li>Berekenen het groeitempo op jaarbasis, µ (h -1), door toepassing van de volgende vergelijking voor alle paren van opeenvolgende waarden van OD 600: 
	<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56197/56197eq1.jpg" /> Opmerking: In deze vergelijking, C i en C i + 1 vertegenwoordigen de OD 600-waarden van twee achtereenvolgende keer punten (t ik en t i + 1, respectievelijk). LN geeft aan natuurlijke logaritme.</li>
	<li>Berekenen de veranderingen in het groeitempo op jaarbasis na verloop van tijd op basis van het uurtarief OD 600 leest volgens stap 4.6. Berekenen van het gemiddelde en de standaardafwijking van de vijf opeenvolgende groeicijfers te schatten van de maximale groei. 
	Opmerking: Het grootste gemiddelde met de kleinste standaarddeviatie wordt gedefinieerd als de maximale groei van de overeenkomstige groeikromme.</li>
</ol> 5. Bevestiging van de mondiale Bias van de 96-Wells luidt (optioneel) Opmerking: zowel de plaat reader en de verbruikbare 96-wells-plaat vooringenomen metingen kunnen veroorzaken. Zeer nauwkeurige en reproduceerbare kwantitatieve om resultaten te bereiken, bevestigen de wereldwijde bias van de 96-wells-plaat wordt ten zeerste aanbevolen.
<ol><li>Voorbereiden van de 96-wells-plaat en de plaat-lezer op de bias test zoals beschreven in paragraaf 3.2.2.</li>
	<li>Voeg toe 20 mL M63 tot een gesteriliseerde 50 mL centrifugebuis. Voeg de glycerol voorraad aan de dezelfde centrifugebuis en vortex. Breng de geschorste oplossing over in een gesteriliseerde reagens reservoir.</li>
	<li>Gebruik van een 8-kanaals Pipetteer 200 µL van de geschorste oplossing overbrengen naar de 96-wells-plaat.</li>
	<li>Plaats van de 96-wells-plaat op de afleesapparaat en start de meting.</li>
	<li>Record het uurtarief OD 600 leest en analyseren zoals beschreven in sectie 4. Vergelijk de berekende maximale groei tarief en de bevolkingsdichtheid van elk putje te bepalen locatiespecifieke bias van de 96-Wells-leest.</li>
</ol>

<ol><li>Kovarova-Kovar, K., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+kinetics+of+suspended+microbial+cells%3A+from+single-substrate-controlled+growth+to+mixed-substrate+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).</li>
<li>Soupene, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+studies+of+Escherichia+coli+strain+MG1655%3A+growth+defects+and+apparent+cross-regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression.</a> J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).</li>
<li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li>
<li>Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+growth+and+physiology%3A+a+call+for+better+craftsmanship%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship.</a> Front Microbiol. 6, 287(2015).</li>
<li>Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+genome+reduction+and+bacterial+growth%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Correlation between genome reduction and bacterial growth.</a> DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).</li>
<li>Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rate-coordinated+transcriptome+reorganization+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria.</a> BMC Genomics. 14, 808(2013).</li>
<li>Nahku, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+growth+rate+dependent+transcriptome+profiling+of+Escherichia+coli+K12+MG1655+in+accelerostat+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures.</a> J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).</li>
<li>Dai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+translating+ribosomes+enables+Escherichia+coli+to+maintain+elongation+rates+during+slow+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth.</a> Nat Microbiol. 2, 16231(2016).</li>
<li>Madrid, R. E., Felice, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biomass+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microbial biomass estimation.</a> Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).</li>
<li>Harris, C. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+estimation+of+microbial+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">The estimation of microbial biomass.</a> Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).</li>
<li>Yates, G. T., Smotzer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+lag+phase+and+initial+decline+of+microbial+growth+curves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">On the lag phase and initial decline of microbial growth curves.</a> J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).</li>
<li>Kargi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-interpretation+of+the+logistic+equation+for+batch+microbial+growth+in+relation+to+Monod+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics.</a> Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).</li>
<li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+growth+curves%3A+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Food+Sci+Nutr%22%5BJournal%5D)">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).</li>
<li>Sprouffske, K., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growthcurver%3A+an+R+package+for+obtaining+interpretable+metrics+from+microbial+growth+curves%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves.</a> BMC Bioinformatics. 17, 172(2016).</li>
<li>Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rates+made+easy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Growth rates made easy.</a> Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).</li>
<li>Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+growth-rate+composition+formula+for+the+growth+of+E.coli+on+co-utilized+carbon+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates.</a> Mol Syst Biol. 11 (4), 801(2015).</li>
<li>Engen, S., Saether, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((r-+and+K-selection+in+fluctuating+populations+is+determined+by+the+evolutionary+trade-off+between+two+fitness+measures%3A+Growth+rate+and+lifetime+reproductive+success%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success.</a> Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).</li>
</ol>

Wij danken Kohei Tsuchiya voor het verstrekken van het CFU assay voorbeeld. Dit werk werd gedeeltelijk financieel ondersteund door een Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek (C) nr. 26506003 (voor BWY) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie, Japan.

Kritische stappen in het protocol zijn de voorbereiding van een gewone aandelen van exponentieel groeiende cellen en de replicatie van de dezelfde monsters in meerdere putten op verschillende posities op de microplate. Eerder, microbiologen begonnen de cultuur van een overnachting pre cultuur. Hoewel deze methode de vertragingstijd van bacteriële groei verminderen kan, is het moeilijk om reproduceerbare groeikrommes. Zoals blijkt uit Figuur 2, resulteerde de onafhankelijke metingen met behul...

Microbiologisch onderzoek beginnen vaak met de cultuur van bacteriële cellen en de beoordeling van de curven van de bacteriële groei, die een fundamentele fenomeen van bacteriële fysiologie1,2,3te vertegenwoordigen. Cultuur van de fundamentele beginselen zijn verkrijgbaar in de gepubliceerde onderzoeksliteratuur en leerboeken omdat bacteriecultuur een fundamentele methode is. Op het niveau van de Bank, aanzienlijke aandacht traditioneel gericht geweest op het optimaliseren van de groei media en het kweken van voorwaarden, maar niet onder controle heeft de groei, die zou waarschijnlijk nog meer inzicht van microbiële fysiologie, is uitgebreid bestudeerde4. Voor exponentieel groeiende bacteriën, is een belangrijke parameter van de cellulaire staat het groeitempo op jaarbasis, die is gemeld moeten worden gecoördineerd met het genoom, transcriptome en Proteoom5,6,7,8 . Kwantitatieve evaluatie van bacteriële groei is dus cruciaal voor het begrip van microbiële fysiologie.
Om te beoordelen bacteriële groei, de experimentele methoden voor het schatten van biomassa zijn gevestigde9,10 en zijn gebaseerd op de detectie van biochemische, fysische of biologische parameters, zoals optische turbiditeit. Bovendien, zijn de analytische methoden gebruikt voor het vastleggen van de dynamische eigenschappen van groei veranderingen vaak gebaseerd op gevestigde niet-lineaire modellen11,12,13, bijvoorbeeld, logistieke vergelijkingen. Groeidynamiek worden over het algemeen verkregen door getimede bemonstering van celgroei in cultuur door het meten van optische troebelheid of kolonievormend eenheid (CFU) testen uitvoeren. De beperking van deze kweken en detectiemethoden worden vermeld is dat de gegevenspunten niet een getrouwe weergave van de populatiedynamiek zijn omdat de meting intervallen vaak in uren zijn en de cultuur-voorwaarde (bijvoorbeeldveranderingen in temperatuur en beluchting) wordt verstoord ten tijde van de bemonstering. Cultuur- en analysetechnieken moeten worden bijgewerkt met behulp van de recente ontwikkelingen in technologie en begrip. Recente vooruitgang in microplate lezers toestaan het real-time opvolgen van bacteriële groei en leiden tot aanzienlijke afname van de kosten van arbeid. Met behulp van deze geavanceerde apparaten, hebben de meest recente studies op bacteriële groei gemeld analysemethoden voor high-throughput metingen14,15.
Het doel van dit protocol is ter beoordeling van de precieze groeidynamiek in een high-throughput wijze, die zullen waardevol voor kwantitatieve studies die uiteindelijk betrekking hebben op de vragen van hoe de groei wordt bepaald en welke factoren beïnvloeden de groei. Het protocol adressen alle factoren die worden in aanmerking voor de herhaalbare en nauwkeurige kwantificatie van bacteriële groei genomen moeten. De experimentele methode en analyse worden in detail in de hoofdtekst beschreven. Deze methode kunnen de nauwkeurige en reproduceerbare analyse van bacteriegroei in zodanig hoge gegevensdoorvoer. Microbiologen kunnen dit protocol gebruiken om extra kwantitatieve resultaten ontlenen hun experimenteel bewijs. Dit protocol kan ook worden gebruikt voor studies in systeembiologie die proberen om algemene conclusies te trekken of om een theoretische overzicht van groei.

<table><tbody><tr><td>K2HPO4</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Wako</td><td>166-04255</td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Wako</td><td>019-03435</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7H2O</td><td>Wako</td><td>138-00415</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine-HCl</td><td>Wako</td><td>201-00852</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Wako</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O)</td><td>Wako</td><td>094-01082</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Wako</td><td>075-00611</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tube (50 mL, gesteriliseerd)</td><td>WATSON</td><td>1342-050S</td><td></td></tr><tr><td>Pipettentips, 200 &micro;L</td><td>WATSON</td><td>110-705Y</td><td></td></tr><tr><td>Pipettentips, 1.000 &micro;L</td><td>WATSON</td><td>110-8040</td><td></td></tr><tr><td>Microtube (1,5 mL)</td><td>WATSON</td><td>131-715C</td><td></td></tr><tr><td>8 multikanaals-pipet</td><td>WATSON</td><td>NT-8200</td><td></td></tr><tr><td>PASORINA ROERDER</td><td>AS ONE</td><td>2-4990-02</td><td></td></tr><tr><td>Glas cilinder (200 mL)</td><td>AS ONE</td><td>1-8562-07</td><td></td></tr><tr><td>Precisie pH-meter</td><td>AS ONE</td><td>AS800 / 1-054-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-200</td><td>GILSON</td><td>1-6855-05</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-1000</td><td>GILSON</td><td>1-6855-06</td><td></td></tr><tr><td>Weggeef Serologische Pipetten (10 mL)</td><td>SANPLATEC</td><td>SAN27014</td><td></td></tr><tr><td>Weggeef Serologische Pipetten (25 mL)</td><td>SANPLATEC</td><td>SAN27015</td><td></td></tr><tr><td>Microtube stand</td><td>BM Bio</td><td>801-02Y</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>BM Bio</td><td>BM-V1</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96-well microplate met deksel (Vlakke bodem, Helder)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 3370</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar reagens reservoir (50 mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 4870</td><td></td></tr><tr><td>Stericup GV PVDF (250 mL, 0,22 &micro;M)</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>DRUMMOND</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Bioshaker (BR-23UM MR)</td><td>TAITEC</td><td>0053778-000</td><td></td></tr><tr><td>Weggeef cel (1,5 mL)</td><td>Kartell</td><td>1938 / 2-478-02</td><td></td></tr><tr><td>DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>A23616</td><td></td></tr><tr><td>EPOCH2</td><td>BioTek</td><td>2014-EP2-002 / EPOCH2T</td><td></td></tr><tr><td>Beker (500 mL)</td><td>IWAKI</td><td>82-0008</td><td></td></tr><tr><td>BIO schone bank</td><td>Panasonic</td><td>MCV-B131F</td><td></td></tr><tr><td>Glasbuizen</td><td>NICHIDEN RIKA GLASS</td><td>P-10M~P-30 /101019</td><td></td></tr><tr><td>Siliconen rubber stoppers</td><td>ShinEtsu Polymer</td><td>T-19</td><td></td></tr><tr><td>Bacterie stammen</td><td>Stambrepositorium; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nauwkeurige, high-throughput analyse van de bacteriële groei

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacteriële groei is een centraal concept in de ontwikkeling van moderne microbiële fysiologie, evenals in het onderzoek van cellulaire dynamiek op het niveau van de systemen. Recente studies hebben correlaties tussen bacteriële groei en genoom-brede evenementen, zoals genoom vermindering en transcriptome reorganisatie gemeld. Correct analyseren bacteriële groei is van cruciaal belang voor het begrijpen van de groei-afhankelijke coördinatie van gene functies en cellulaire componenten. Dienovereenkomstig, de precieze kwantitatieve evaluatie van bacteriële groei in een high-throughput wijze is vereist. Opkomende technologische ontwikkelingen bieden nieuwe experimentele instrumenten waarmee updates van de methoden die worden gebruikt voor het bestuderen van de bacteriële groei. Het protocol hier geïntroduceerd maakt gebruik van een microplate-lezer met een geoptimaliseerde experimentele procedure voor de reproduceerbaar en nauwkeurige evaluatie van bacteriële groei. Dit protocol is gebruikt voor het evalueren van de groei van een aantal eerder beschreven Escherichia coli stammen. De belangrijkste stappen van het protocol zijn als volgt: de voorbereiding van een groot aantal cel voorraden in kleine flesjes voor herhaalde tests met reproduceerbare resultaten, het gebruik van 96-wells-platen voor high-throughput groei evaluatie en de handmatige berekening van twee grote parameters (d.w.z., maximale groei tarief en de bevolkingsdichtheid) vertegenwoordigen de groeidynamiek. In vergelijking met de traditionele kolonievormend eenheid (CFU) test, die het aantal cellen dat na verloop van tijd op agar platen in glazen buizen worden gekweekt tellen, de huidige methode is efficiënter en biedt meer gedetailleerde temporele records van wijzigingen van de groei, maar heeft een strengere aantoonbaarheidsgrens op lage bevolkingsdichtheid. Kortom is de beschreven methode gunstig voor de nauwkeurige en reproduceerbare analyse van de high-throughput van bacteriële groei, die kan worden gebruikt om algemene conclusies te trekken of theoretische opmerkingen te maken.

De beschreven methode biedt een middel om het vangen van dynamische groei van de bacteriën in een continue, hoge-doorvoer wijze met behulp van een 96-Wells formaat reader waarmee meerdere extinctie metingen op verschillende tijdstippen (van minuten tot uren tot dagen). De groeikrommes van een assortiment van E. coli stammen uiting van verschillende genoom kunnen precies worden verkregen in een enkele experiment (figuur 1A). In vergelijking met de bes...

Kwantitatieve evaluatie van bacteriële groei is van essentieel belang voor het begrip van microbiële fysiologie als een verschijnsel systemen-niveau. Een protocol voor experimentele manipulatie en een analytische aanpak worden ingevoerd, waardoor nauwkeurige, high-throughput analyse van bacteriële groei, die een belangrijke onderwerp van belang in de systeembiologie.

Nauwkeurige, High-throughput analyse van de bacteriële groei

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Het algemene doel van dit experiment is om bacteriële groei nauwkeurig te analyseren in een high-throughput methode. Met deze procedure kunnen zowel meerdere media als verschillende stammen gelijktijdig worden getest. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de velden van de systeembiologie en microbiologie, zoals welke factoren bepalend zijn voor de celgroei.De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat onderzoekers hiermee nauwkeurig globale parameters van de maximale groeisnelheid en de maximale populatiedichtheid in groeicurves van bacteriecellen kunnen evalueren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de groei van E. coli, kan ze ook worden toegepast op andere micro-organismen, zoals bij groeianalyses en screening van milieu-bacteriën.Plaats ter begin vijf gesteriliseerde glazen buizen met siliconen rubberen stoppers, pipetten en de doelstammen in een sterielkast. Vlam een bunsenbrander langs de opening van de glazen buis voordat de siliconen rubberen stopper wordt verwijderd. Vlam de siliconen rubberen stopper na het openen van de buis en plaats de dop vervolgens voorzichtig terug op de glazen buis.Gebruik vervolgens de elektronische pipet en e

precise-high-throughput-analysis-of-bacterial-growth

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Kurokawa, M., et al. Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the high-throughput quantification of bacterial growth using a microplate reader. It outlines the steps involved in culture preparation, optical density measurement, and analysis of growth dynamics.

Precise and High-Throughput Analysis of Bacterial Growth Using a Microplate Reader

Source: Cabeen, M. T., et al. Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates the use of a microfluidic device to observe bacterial growth at the single-cell level. It showcases how non-motile bacterial cells, confined within micro-scale trenches, are continuously nourished and imaged under a fluorescence microscope. The setup enables real-time visualization of cell division and lineage tracking across multiple generations.

Tracking Bacterial Growth at Single-Cell Resolution in a Microfluidic System

ScanLag is een methode met hoge doorvoer voor het meten van de vertraging in groei, namelijk latentietijd, evenals de groeisnelheid van kolonies voor duizenden cellen parallel. Screening met behulp van ScanLag maakt de onderscheiding mogelijk tussen lange latentietijd en langzame groei op het niveau van een enkele variant.

ScanLag: High-throughput Kwantificering van Colony Groei en vertraging

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

De groei van van bacteriële culturen in micro titer gerechten vergemakkelijkt een hoge doorvoer bemonstering die meerdere technische en biologische repliceren assays van nucleotide zwembad overvloed, met inbegrip van die van (p) ppgpp. De effecten van groei overgangen veroorzaakt door bronnen van fysiologische stress en herstel van stress kunnen worden gecontroleerd.

Gebruik van Microtiter schotel Radiolabeling voor meervoudige in vivo metingen van Escherichia coli (p) Ppgpp gevolgd door Dunnelaagchromatografie

Bij deze methode kwantificeren we de bindende affiniteit van RNA-bindende eiwitten (rbp's) naar verwant en niet-verwant binding sites met behulp van een eenvoudige, Live, reporter assay in bacteriële cellen. De test is gebaseerd op onderdrukking van een reporter-gen.

Een test voor het kwantificeren van eiwit-RNA-binding bij bacteriën

Deze moleculair gebaseerde aanpak voor het bepalen van bacteriële fitness vergemakkelijkt nauwkeurige en nauwkeurige detectie van micro-organismen met behulp van unieke genomische DNA-barcodes die worden gekwantificeerd via digitale PCR. Het protocol beschrijft de berekening van de concurrerende index voor salmonella stammen; de technologie is echter gemakkelijk aan te passen aan protocollen die absolute kwantificering van enig genetisch-smeedbaar organisme vereisen.

Digitale PCR-gebaseerde competitieve index voor high-throughput analyse van de geschiktheid in salmonella

Dit protocol staat een tijd opgeloste beschrijving van bacteriële groei onder stressomstandigheden op de eencellige en de celpopulatie niveaus.

Multi-Scale analyse van bacteriële groei onder stress behandelingen

Gistgroei fenotypes worden nauwkeurig gemeten door middel van zeer parallelle time-lapse beeldvorming van geïmmobiliseerde cellen die uitgroeien tot microkolonnies. Tegelijkertijd kunnen stresstolerantie, eiwitexpressie en eiwitlokalisatie worden gemonitord, waardoor geïntegreerde datasets worden gegenereerd om te bestuderen hoe omgevings- en genetische verschillen, evenals genexpressie heterogeniteit tussen isogene cellen, de groei moduleren.

Live imaging met hoge doorvoer van microkolonnies om heterogeniteit in groei en genexpressie te meten

Hier beschrijven we een plasmide overexpressie scherm...

High-throughput gist Plasmide Overexpressie Screen

Leer een high-throughput methode voor precieze analyse van bacteriële groei met behulp van E. coli en andere micro-organismen. Deze techniek evalueert maximale groeisnelheid en populatiedichtheid efficiënt.

Nauwkeurige, High-throughput analyse van de bacteriële groei

Meer video's verkennen