Name: De voorbereiding van gescheiden Mouse Cortical Neuron culturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 2 s
Description: Leer hoe je gescheiden corticale neuronculturen bereidt uit postnatale muizen voor elektrofysiologie en beeldvorming. Deze methode ondersteunt onderzoek naar neuronale ontwikkeling en genetische mutaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Voorbereidingen voor de dag van het kweken: <ul><li> Bereid steriele ontleden oplossing (DS). </li><li> Bereid NBM/B27 (Neurobasal Mediom met B27 supplementen). </li><li> Autoclaaf DDH 2 O en steriliseren glas coversilps, indien nodig. </li><li> Vacht weefselkweek gerechten of glazen dekglaasjes met poly-D-lysine. </li></ul> Poly-D-Lysine Coating: Bereid de dag voor het kweken van onder steriele omstandigheden. <ul><li> Dooi hoeveelheid van 10X PDL en leg ze op ijs. </li><li> Voeg 9 ml steriele ultra-gefilterd water tot 1 ml van PDL en meng goed (1x). </li><li> Coat oppervlakken met 1X PDL &#39;s nachts bij kamertemperatuur als volgt: <ul><li> dekglaasjes (Bellco Glass, Inc Cat # 1943 tot 00.012.): 75 ul / dekglaasje OR </li><li> 24 goed cultuur plaat: 300 ul / putje OR </li><li> 35mm cultuur gerecht: 1ml/dish </li></ul></li><li> Spoel 5X met steriel water (gebruik steriele pasteurpipetten van vloeibare aspireren). </li><li> Verwijder water totdat het oppervlak volledig droog is. </li></ul> Het kweken van de procedure (gedaan in laminaire flow hood onder steriele omstandigheden) <ol><li> Knip blok van agar en lijm deze op de steun blok van de microtoom Vibraslicer (Campden Instruments Ltd) met behulp van superlijm. </li><li> Bij het gebruik van late embryonale stadium (E17-18) muis foetussen, euthanise dam, te verwijderen baarmoeder en vrij individuele foetussen van embryonale zak. Plaats foetussen in steriele petrischaal en verder zoals hieronder beschreven. </li><li> Onthoofden muis foetus of pup (volg de richtlijnen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Committee). </li><li> Verwijder het vel en de schedel en de hersenen plaats op Whatman filter papier schijf in een 60mm petrischaal gevuld met koud DS. </li><li> Snijd het cerebellum met behulp van een steriel scheermesje. </li><li> Pick-up hersenen met behulp van een spatel en afvoer overtollige vloeistof op filtreerpapier, vervolgens over de hersenen te Vibraslicer ondersteuning te blokkeren en lijm de hersenen in plaats (caudale zijde naar boven en ventrale deel geconfronteerd met agar). </li><li> Vul de kamer met koude DS. Ingestelde snelheid keuzeschakelaar op 8-9. </li><li> Snijd 200 tot 400 micrometer secties, te beginnen vanaf bulbus olfactorius. Zodra het blad van de Vibraslicer komt in de cortex, gaan knippen 600μm coronale secties. Een E17-18 de hersenen van muizen levert meestal 3-4 bruikbaar plakken, terwijl een P0 de hersenen van muizen levert bruikbare 4-5 plakjes. </li><li> Overdracht hersenen plakjes van 35 mm petrischaal label DS 2 met behulp van reverse einde van un-plugged 10 ml glazen Pasteur pipet. </li><li> Ontleden van cortex en verwijder de hersenvliezen het gebruik van glazen naalden getrokken uit capillaire buizen. </li><li> Snijd corticale schillen in kleine stukjes, 0,5-1 mm in lengte. </li><li> Filter ES door 0,2 um filter gekoppeld aan een 5 cc spuitje in een 35 mm petrischaal. </li><li> Breng de corticale weefsel stukken om petrischaaltje met gefilterd ES. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li></ol> In de tussentijd: <ol><li> Opruimen kap, Vibraslicer en ontleden tools. </li><li> Voeg 5 ml warm NBM/B27 in een 60 mm petrischaal. </li></ol> Na 30 minuten. incubatie: <ol><li> Overdracht weefsel tot 10 ml DS. Laten bezinken voor 1 minuut. </li><li> Overdracht weefsel eerst Hi buis wervelingen en laten bezinken voor 2-3 minuten. </li><li> Overdracht naar de tweede Hi. Herhalen als hierboven. </li><li> Transfer naar eerste Li. Herhalen als hierboven. </li><li> Overdracht naar de tweede Li. Herhalen als hierboven. </li><li> Overdragen aan derden Li. Herhalen als hierboven. </li><li> Overdracht van weefsel om de 60 mm gerecht met media. </li></ol> Onder de dissectie microscoop: <ol><li> Schoon puin van weefsel en vermaal elk stuk door voorzichtig het passeren van een getrokken glazen pipet (gebruik afnemende boring maten) om los te komen van de weefsel. </li><li> Overdracht celsuspensie tot 15 ml conische buis met de rest van NBM + B27 (Maak een totaal van 13 ml voor een 24 wells plaat of 11 ml voor 5 -. 35 mm schotels Mix voorzichtig en voor grote stukken van het weefsel om zich te vestigen te wachten). </li><li> Transfer celsuspensie (0,5 ml / goed voor een 24 wells plaat of 2 ml / 35 mm cultuur schotel). </li><li> Bij het gebruik van glas dekglaasjes, voeg 80 ul celsuspensie per dekglaasje en laat 1 uur in weefselkweek incubator voor de cellen om zich te houden voor overstromingen van de kamer met meer NBM/B27 media. </li><li> Handhaaf culturen bij 37 ° C en 5% CO 2. </li></ol> Volgende dag 24 wells plaat: Feed elk putje met 0,5 ml niet-neuronale cellen geconditioneerd NBM/B27 medium (cNBM/B27, Protocol voor de voorbereiding van cNBM/B27 medium verschijnt onder) 35mm gerechten: Vervang 0,5 ml met cNBM/B27 medium. Onderhouden cultuur door het vervangen van 0,5 ml van medium met verse cNBM/B27 om de 2-3 dagen. Hoewel de cultuur media bevordert niet glia cel proliferatie, kunnen culturen worden behandeld met 5 urn FDU (5-fluor-2&#39;-deoxyuridine, Sigma F0503) op dag 3-5 in de cultuur verder te verlagen van het aantal gliacellen indien nodig. SET<html> -UP voor Dissection en Cultuur Steriliseer het ontleden van tools in 70% EtOH of autoclaaf hen: <ul><li> Schaar (middelgrote en kleine) Spatels (middelgrote en kleine) </li><li> Pincet (middelgrote en kleine) Razor blade </li><li> Blad voor vibraslicer Buffer bad </li><li> Kleine metalen wig voor blade Ondersteuning voor de hersenen </li></ul> Andere materialen: <ul><li> Petrischalen (60 mm) </li><li> Petrischalen (35 mm) </li><li> Filtreerpapier </li><li> Glazen pipet 10 ml </li><li> Steriele pipetten, 5,10 en 25 ml </li><li> Spuitfilter, 0,2 micrometer </li><li> Spuit 5 cc </li><li> Centrifuge buizen, 15 ml </li><li> Steriele Pasteur glazen pipetten </li><li> PDL gecoat cultuur gerechten of glas coverslips </li></ul> Label zes 15 ml centrifugebuizen en volg de voorbereiding: Buis # 1: Enzyme oplossing: Voeg 50 U van papaïne (Worthington LS 03126) tot 5 ml DS met daarin: <ul><li> 100μl van L-cysteïne (0,8 mg) </li><li> 7 ul 0,1 N NaOH </li><li> 50 ui APV (5mm) </li></ul> Laat oplossing uit op kamertemperatuur te wissen. Merk op dat enzym oplossing zal &#39;troebel&#39; lijken op het eerste en moet helder voor gebruik. Tube # 2 &amp; # 3: Hoi Enzyme remmer: 3 ml DS + 300 ul BSA / Ti + 30 pl APV (5mm). Meng voorzichtig om luchtbellen te vermijden, en verdeel in twee porties 1,5 ml. Tube # 4 - # 6: Laag Enzyme remmer: 8 ml DS + 80 ul BSA / Ti + 80 ui APV (5mm). Meng voorzichtig om luchtbellen te vermijden, te verdelen in drie 2,6 ml monsters. Plaats de buisjes nummers # 2 tot en met # 6 op het ijs. Laat buis # 1 (Enzyme-oplossing) bij kamertemperatuur. OPLOSSINGEN en aliquots <ul><li> Oplossing A (gebufferde zoutoplossing) Sigma Formule gew 500 ml [conc.] </li><li> Natriumchloride NaCl S-9625 58.45 80.0g 137mm </li><li> Kaliumchloride KCl P-4504 74.56 4.0g 5,4 </li><li> Natrium dibasisch watervrij Na 2 HPO 4 S-0876 142,0 0,24 g 0.17mM </li><li> Kalium monobasisch watervrij KH 2 PO 4 P-5379 136,09 0.3g 0.22mm </li></ul> Weeg alle ingrediënten en meng tot oplossen met 400 ml ultra gefilterd water. Breng uiteindelijke volume tot 500 ml. Plaats in een schone fles en autoclaaf. Bewaren bij 4 ° C en label &quot;DS Oplossing A&quot;. <ul><li> Oplossing B (Hepes) Sigma Formule gew 250 ml [conc.] </li><li> Hepes Hepes H-3375 283,3 20.97g 9,9 mm </li></ul> Voeg ultra-gefilterd water tot 200 ml. Meng tot opgelost en breng uiteindelijke volume tot 250 ml. Plaats in een schone fles en autoclaaf. Bewaren bij 4 ° C en label &quot;DS Oplossing B&quot;. <ul><li> Werken Solution 500 ml [conc.] </li><li> Ultra gefilterd water 400 ml </li><li> Stock oplossing A 25 ml </li><li> Stock Oplossing B 14 ml </li><li> D (+)-glucose Sigma G-8270 3,0 g 33.3mM </li><li> Sucrose Sigma S-0389 7.5 g 43,8 mM </li></ul> Breng de pH tot 7,4 met 1 N NaOH. Breng uiteindelijke volume tot 500 ml met ultra gefilterd water. Giet in een schone glazen fles en autoclaaf. Bewaren bij 4 ° C. Label &quot;ontleden Solution&quot;. Poly-D-Lysine Bereiding: <ol><li> Bereid 10x voorraad oplossing van poly-D-lysine (PDL, Sigma P-7280) in een steriele H 2 O op 1mg/ml. </li><li> Maak 1,0 ml porties. Deze oplossing kan worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende maximaal 3 maanden. </li></ol> MEDIA <ol><li> Voeg 10 ml van de B-27 Supplement (Gibco 17504-044) tot 500 ml fles NBM (Neurobasal Medium, Gibco 21103-049). </li><li> Maak 40 ml porties en bewaar bij 4 ° C. </li></ol> APV <ol><li> Voeg 10 ml steriel H 2 O tot flacon van 10 mg APV (2-Amino-5-phosphonopentanoic zuur, Sigma A-5282) en meng. </li><li> Bereid 180 ul aliquots en bewaar bij -20 ° C. </li></ol> BSA / Ti <ol><li> Los 1 g BSA (Bovine albumine. Sigma A-7030) en 1 g trypsine-remmer (Sigma T-9253) in 10 ml DS. </li><li> Breng de pH tot 7,4 met 1 N NaOH. </li><li> Steriliseren door te filteren door middel van 0,2 um spuitfilter. </li><li> Verdeel het deeg in porties van 400 ul en bewaar bij -20 ° C. </li></ol> L-cysteïne In een eppendorfbuisje te ontbinden 0,6 mg L-Cysteïne (Sigma C-7755) in 200 ul DS. AGAR (4%) <ol><li> Los 4 g Bacto Agar (Difco 0140-01) in 100 ml steriel water. Bewaren bij 4 ° C totdat het nodig is voor cultuur. </li><li> Microwave Agar te smelten en vul een 35 mm petrischaal. Laten we gaan zitten om af te koelen en polymeriseren. </li></ol> PAPAÏNE (Worthington LS 03126) e_title &quot;&gt; niet-neuronale culturen in NUNC CULTUUR FLESSEN COATING CULTUUR FLES (4 Nunc flessen) <ol><li> Voeg 9 mL steriel water om elk van de drie buizen van 10X PDL om 1X PDL te maken. </li><li> Transfer 30 ml 1X PDL in de eerste fles. </li><li> Beweeg een beetje totdat alle groei van oppervlakken bedekt zijn. Laat zitten voor 1 minuut. </li><li> Overdracht 1x PDL naar de tweede fles. Laat zitten voor 1 minuut. </li><li> Herhaal dit met de derde en vierde flessen. </li><li> Spoel alle vier flesjes 2X met 150 ml steriele H 2 O. </li></ol> VOORBEREIDEN enzymoplossing (ES): <ol><li> In een 0,6 ml centrifugebuis van het gewicht van 0,8 mg L-Cysteïne (Sigma C7755), voeg 150 ml DS toe en vortex tot kristallen zijn opgelost. </li><li> Transfer 5 ml DS om een ​​15 ml conische buis, voeg vervolgens 150 ml L-cysteïne. </li><li> Voeg 50 eenheden Papaïne. (Worthington LS 03126) </li><li> Voeg 7ml 0,1 N NaOH. </li></ol> VOORBEREIDEN MEM (GIBCO # 11090-081) <ol><li> Verwijder 65 ml van de 500 ml MEM fles. Bespaar 10 ml tot Glucose voor te bereiden. </li><li> Voeg 5 ml Pen / Strep (Gibco # 15070-063). </li><li> Voeg 10 ml 1M Glucose (Sigma G-8270) (1,8 g / 10 ml MEM) </li><li> Voeg 50 ml foetaal runderserum (Gibco # 16140-071) of Bovine Calf Serum (Omega BC-04). </li><li> Meng goed, hoeveelheid en bewaar bij 4 ° C. </li></ol> NEUROBASAL MEDIUM/B-27 Supplement (NBM/B27) NBM, 500 ml (Gibco # 21103-049), B-27 (50x), 10 ml (Gibco # 17504-044) <ol><li> Voeg de gehele inhoud van de B-27 flacon van de NBM fles en meng. </li><li> Aliquot en bewaar bij 4 ° C. </li></ol> Dissectie van hersenweefsel <ol><li> Droge ontleden tools van 70% EtOH vóór versnijding. </li><li> Breng 10 ml DS in elk van 3-15 ml buis. </li><li> Selecteer muis pups (P0 - P3), hebt u drie hersens voor 4 flessen. </li><li> Voeg koud DS tot 35 mm petrischaal. </li><li> Onthoofden muis pup en ontleden van hersenen. </li><li> Plaats hersenen in de petrischaal met koud DS. </li><li> Hak weefsel in stukken, klein genoeg om door een glazen pipet. </li></ol> ENZYME DISSOCIATIE <ol><li> Verwijder zoveel DS mogelijk van de schotel met een Pasteur pipet. </li><li> Filter ES door een 0,2 um filter en 5cc spuit. </li><li> Plaats ES in de schaal met weefsel. </li><li> Incubeer weefsel bij 37 ° C incubator (CO 2 vrij) gedurende 30 minuten. </li></ol> WASSEN TISSUE <ol><li> Transfer weefsel met glazen pipet met de eerste DS-buis, om ervoor te zorgen om zo weinig mogelijk ES. </li><li> Centrifugeer gedurende 30 seconden bij 1500 rpm. </li><li> Overdracht weefsel en herhaal de procedure nog twee keer. </li></ol> Vermalen <ol><li> Plaats 38 ml MEM / FBS in een 50 ml centrifugebuis </li><li> Voeg 3 ml MEM / FBS om een ​​35 mm schaal en overdracht weefsel om dit petrischaal. </li><li> Distantiëren van het weefsel voorzichtig fijnwrijven het door een 1000μl eppendorf pipet tip. </li><li> Overdracht celsuspensie aan de buis met 38ml van de MEM / FBS en meng goed. </li></ol> Plateren <ol><li> Rechtop kan staan ​​van de cultuur flessen om gelijke hoeveelheden van de celsuspensie en de media krijgen in elke fles. </li><li> Doe 90 ml MEM / FBS in elke cultuur fles. </li><li> Voeg 10 ml celsuspensie in elke fles. </li><li> Label: niet-neuronale, initialen en datum. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2. </li></ol> VOEDING <ol><li> Op dag 3 of 4, voeden cellen met warm MEM / FBS (decanteren alle media en deze met 100 ml MEM / FBS vervangen). Culturen kan 7-10 dagen te worden confluerende. </li><li> Op dag 70 tot 10 u de media voor NBM/B27. </li><li> De volgende dag, het verzamelen van de media. Filter met 0.22μm </li><li> Maak aliquots van 40 ml en diervoeders cultuur met MEM / FBS. </li><li> Komende 2 of 3 dagen, verandering media voor NBM/B27 </li><li> De volgende dag, verzamelen en herhaal de procedure. </li><li> Houd het verzamelen van media voor ca.. 2 weken. </li></ol>

De auteurs hebben niets te melden.

<table><tbody><tr><td>5-Fluoro-2&amp;rsquo;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Vibraslicer</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium (NBM)</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-5-fosfonopentaanzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>Bovien albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsineremmer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9253</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide, 1N oplossing</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteïne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>Papaïne</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS 03126</td><td></td></tr><tr><td>Steriel 0,2 &amp;mu;m spuitfilter</td><td>Fisher Scientific</td><td>DDA02025S0</td><td></td></tr><tr><td>Glazen dekglasjes, No1, 12mm</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-00012</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11090-081</td><td>met Earle&amp;rsquo;s zouten zonder L-glutamine, nodig voor het kweken van niet-neuronale culturen</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>voor niet-neuronale culturen</td></tr><tr><td>Foetaal bovine serum</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td>nodig voor niet-neuronale culturen</td></tr><tr><td>Nunclon &quot;Triple Flask&quot; weefselkweekfles</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-25</td><td>Gebruiken voor niet-neuronale culturen. Deze flessen zijn zeer handig bij het produceren van &quot;geconditioneerd Neurobasal medium/B27&quot;, maar elke andere weefselkweekfles of schaal kan in plaats daarvan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Glazen bodem &quot;Imaging dishes&quot;</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>Kweekschalen van 35mm met glazen bodem, ideaal voor calcium- of natrium-imaging bij gebruik van een geïnverteerde imaging-opstelling. Echter kostbaar!</td></tr></tbody></table>

de voorbereiding van gescheiden mouse cortical neuron culturen

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Deze video zal u door het proces voor het genereren van corticale neuronale culturen uit de late embryo en de vroege postnatale hersenen van muizen. Deze culturen kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder immunocytochemie, biochemie, elektrofysiologie, calcium en natrium beeldvorming, eiwit en / of RNA isolatie. Deze culturen ook een platform om de neuronale ontwikkeling van transgene dieren dat een te late embryonale of postnatale dodelijk genmutatie dragen bestuderen. De procedure is relatief eenvoudig, vergt enige ervaring in weefselkweek techniek en mag niet langer duren dan twee tot drie uur of u goed voorbereid. Een zorgvuldige scheiding van de corticale schil van de thalamo-corticale fiber-darmkanaal vermindert het aantal ongewenste niet-neuronale cellen. Ter verhoging van opbrengsten van neuronale cellen voorzichtig vermaal de stukken van de corticale weefsel na het enzym incubatie stap. Dit is noodzakelijk omdat het voorkomt onnodige schade aan cellen en vroegtijdige neuronale celdood. Aangezien deze culturen worden gehandhaafd in de afwezigheid van glia feeder cellen, ze bieden ook een extra voordeel van de groeiende culturen verrijkt met neuronen.

Deze video toont een procedure voor het genereren van neuronale culturen uit de late embryo en de vroege postnatale muis cortex. Deze culturen kunnen worden gebruikt voor immunocytochemie, biochemie, elektrofysiologie, calcium en natrium beeldvorming en een platform te bieden voor de neuronale ontwikkeling van transgene dieren die een postnatale dodelijke genmutatie dragen bestuderen.

De voorbereiding van gescheiden Mouse Cortical Neuron culturen

Deze video begeleidt u door het proces voor het genereren van corticale neuronale culturen uit de muizenhersenen in het late embryonale en vroege postnatale stadium. Deze culturen ...

Hallo, mijn naam is Hilgenberg. Ik werk hier aan de universiteit in California, Irvine, bij de afdeling Anatomie en Neurobiologie. Vandaag ga ik u vertellen over hoe we corticale culturen van muizen prepareren.Dit zijn muizen van een postnatale dag waaruit we deze neuronen prepareren. We gebruiken deze culturen doorgaans voor elektrofysiologie, of voor eiwit- of RNA-preparaties. We gebruiken dezelfde culturele preparatie voor calcium-imaging of natrium-imaging.Het mooie van deze culturen is dat het een aanpassing is van het banker-protocol, maar we kweken deze culturen zonder gliale feeder-cellen, wat het veel praktischer maakt en waardoor de culturen gewoonlijk rijker zijn aan neuronen dan aan gliale cellen. Laten we beginnen en ik zal u laten zien hoe we deze neuronen prepareren. Goed, we zijn nu op het punt gekomen waarop we de hersenen kunnen verwijderen en kunnen beginnen met de eigenlijke dissectie.Maar vooraf is het belangrijk om te vermelden dat de dekglasjes waarin deze cellen worden gezaaid, gecoat moeten worden. Dit doen we gewoonlijk een nacht lang bij kamertemperatuur met een polylysineconcentratie van 0.1 mg/ml. De volgende dag verwijderen we de polylysine en wassen we de dekglasjes drie keer achter elkaar.Afhankelijk van de toepassing gebruikt u grote schalen, kleine schalen of glazen dekglasjes. Goed, dit is de typische opstelling voor de zuurkast en ik heb kort uitgelegd welke oplossingen u klaar moet hebben staan en ook welke instrumenten handig zijn voor de isolatie van, of de dissectie van de hersenen en vervolgens het eigenlijke coupesnijden van de hersenen. Wat we hier hebben is de dissectie-oplossing die koud is.Normaal gesproken wordt het op ijs bewaard. We hebben een Vibratome-snijapparaat om de hersenen in secties te snijden. Ik heb een bak met dissectie-oplossing waarin de hersenen worden geplaatst en vervolgens worden gesneden.En ik heb diverse instrumenten die ik nodig heb voor de verwijdering van de hersenen. Ik heb een boorplaat. Het is een 4%boor die ik gebruik om de hersenen op hun plaats te houden.We hebben een spuit nodig, een paar steriele filters, Rotman-papierschaaltjes en Petrischalen van verschillende maten. En dit is mijn instrument om de muizenpijp te raken. Ik heb hier ook getrokken glazen pipetten.Dit zijn glazen capillairen die ik gebruik als dissectie-instrumenten en om de stukjes hersenen op te pakken en deze in wezen te herhalen. Onze enzymoplossing bevat dissectie-oplossing. Hierin bevindt zich L cysteine om de pepaine te activeren, evenals 0,1 normaal natriumhydroxide om de pH te balanceren.Zodra u de pepaine toevoegt, is de oplossing enigszins troebel en moet deze helder worden voordat we deze daadwerkelijk kunnen gebruiken voor de enzymatische digestie van het weefsel. We zijn nu in principe klaar om met de procedure te beginnen. De fibro Slicer is voorbereid.Ik heb een mes geplaatst om mijn brein in plakjes te snijden en ik heb ook het vat eronder geplaatst dat de buffer bevat en het brein ondersteunt. En ik ben klaar om het AGA-blok te monteren op mijn steunplaat, die ook het brein zal ondersteunen. Deze AGA is uitgehard, het is 4% AGA, en ik zal nu door een gebied zoals dit snijden.En aan de zijkanten laat ik in feite gewoon een rechthoekige booruitsparing maken. Vervolgens gebruik ik een spatel om dit stukje uit het boorblok te drukken. Nu ga ik deze boor op mijn steunplaat lijmen, waarbij de platte zijde van de boor naar voren is gericht.Dit is de steun waarop de hersenen worden gelijmd en die vervolgens door deze boorspits op zijn plaats wordt gehouden. Wanneer we de sectie op deze manier uitvoeren, bewegen de hersenen niet naar achteren. Nu kunnen we de hersenen verwijderen.Gewoonlijk gebruiken we een muis van P0 of P1. Oké, dit is de gedecapiteerde kop van de muis en ik ga nu snel de hoofdhuid verwijderen. Ik begin met het doorsnijden van de spierband die hier zit en aan de andere kant.Vervolgens gebruik ik de schaar. Ik ben zeer voorzichtig dat de binnenzijde van de schaar de hersenen niet beschadigt. En ik knip aan beide zijden rond de schedel.Nu kunnen we simpelweg het kraakbeen oppakken; ik gebruik hiervoor mijn kleine ULA en verwijder de hersenen op deze manier. Deze hersenen gaan vervolgens in mijn Petrischaal, die ik heb gevuld met de snijoplossing en waarin onderaan een Whatman-filterpapier ligt. Wat ik nu wil doen, is de basis van de hersenen afsnijden, zodat ik een mooi glad en vlak oppervlak heb om de hersenen op mijn houder te monteren.Ik ga nu een heel klein druppeltje secondelijm op mijn steunplaat aanbrengen. Ik pak nu de hersenen op met de spatel en ik gebruik mijn gebogen pincet om me daarbij te helpen. Wat ik vervolgens wil doen, is het overtollige vloeistof van de dissectie-oplossing eraf druppelen, waarna ik de hersenen tegen mijn boorsteun zal monteren.We zijn nu klaar om de hersenen over te brengen naar het bufferbad. Daarom voeg ik dissectie-oplossing toe aan dat kleine vat en ga ik de houder toevoegen die de hersenen ondersteunt. Deze wordt gemonteerd met de hersenen naar het mesje gericht.Oké, de hersenen zijn nu gemonteerd en ik ga de fibro slicer gebruiken. Ik probeer het begin van de hersenen te vinden door de hersenen naar het mes toe te bewegen. Ik heb zojuist een klein stukje van de olfactory afgesneden. Nu verplaats ik mijn mes ongeveer 600 micrometers naar beneden en maak ik een volgende snede, die precies door de cortex moet gaan.Daar gaat de cortex, die schuift op het mes. Vervolgens beweeg ik mijn mes nog 600 µm naar beneden en snijd ik de tweede sectie. Het is belangrijk dat dit continu, zonder onderbreking en soepel gebeurt.Wanneer u het mes terugtrekt, stopt u de fibersnijder. Nu ga ik een glazen pipet gebruiken, die ik op de verkeerde manier vasthield. Ik gebruik eigenlijk het achterste uiteinde om deze corticale sectie hier omhoog te bewegen en over te brengen naar een schone Petrischaal.Ik ga verder door de hersenen, telkens met 600 micrometer, totdat ik ongeveer vijf tot zes coupes heb verzameld voor een P0- of P1-muis. En totdat ik aan het uiterste einde van de cortex kom. Nu zijn we klaar om de cortex van de rest van de hersenen te isoleren.Ik gebruik glazen pipetten die zijn uitgetrokken tot ze even scherp zijn als dissectie-instrumenten. Meestal begin ik met het eerste gedeelte dat ik heb, het kleinste stuk, waarbij we het olfactorische gebied moeten verwijderen. Daarnaast probeer ik de hersenvliezen uit dit preparaat te verwijderen.Verwijder vervolgens het olfactory-gedeelte van dit stuk door het voorzichtig van de meninges af te pellen. Soms zijn er stukken die minder gemakkelijk te scheiden zijn; ga in dat geval gewoon verder en laat deze achter om de goede stukken te behouden. Ik werk altijd richting één uiteinde en ga zo sectie voor sectie te werk.Het is belangrijk dat u de hersenvliezen verwijdert. Wanneer u deze secties bekijkt, wilt u ze soms omdraaien om beter te kunnen zien waar het vezelstrengpad zich bevindt dat de meeste niet-neuronale cellen bevat die u in deze preparatie liever niet heeft. Oké, op deze sectie kunt u dit vezelstrengpad onder de corticale laag duidelijk zien. Ik steek precies tussen de plek waar de corticale laag eindigt en ik wijs het vezelstrengpad aan dat de meeste niet-neuronale cellen bevat die we in deze preparatie proberen te vermijden.Ik snijd langs deze lijn en probeer de vezelbanen achter te laten. Dit is de stap waarbij het weefsel in kleine blokjes wordt gesneden. Oké, ik steriliseer nu mijn enzymoplossing via een filter van 0,2 micron dat aan een injectiespuit is bevestigd.En ik voeg dat direct toe aan mijn corticale fragmenten, precies zo. Zorg ervoor dat er voldoende vloeistof is die alle corticale fragmenten omringt. Deze corticale fragmenten gaan vervolgens 30 minuten in een incubator op 37 °C, wat het weefsel aanzienlijk zou moeten versoepelen. De corticale fragmenten zijn nu 30 minuten geïncubeerd in de incubator.Ondertussen heb ik wat neurobasaal medium met B 27-supplement opgewarmd, waarin deze cellen uiteindelijk terechtkomen. Ik heb hier ook enkele oplossingen klaargezet. De eerste is de dissectie-oplossing.Het is dus een gewone dissectie-oplossing. Vervolgens worden ze overgebracht naar een oplossing met een hoge concentratie trypsineremmer die BSA bevat als scavenger en een PV om de NMDA-receptorcomponent te blokkeren. Daarna volgen drie wasbeurten met een lage concentratie trypsineremmer, BSA en APV. Ik ga deze stukjes nu uit de propaanolusie verwijderen en ze overbrengen naar een conische buis met DS-dissectie-oplossing.Deze klonten zullen door de zwaartekracht naar beneden zakken en het kan een minuut of twee duren voordat ze allemaal zijn bezonken in het kegelvormige gedeelte van de buis. Vervolgens pak ik ze weer op en breng ik ze over naar de oplossing die de hoge trypsin-remmer bevat. Ook nu willen we wachten tot deze klonten naar de bodem van de buis zijn gezakt.Er volgt nog een wasbeurt met een hoge concentratie trypsineremmer, waarna deze klonten worden gewassen in een lage concentratie trypsineremmer. Na mijn laatste wasbeurt en de lage enzymremmer zal ik de cellen overbrengen naar mijn voorverwarmde neurobasale medium en begin ik de cellen mechanisch te dissociëren door ze herhaaldelijk op en neer te pipetteren met een glazen capillair met een afnemende diameter. Ik ga nu de cellen en de weefselklonten tritureren.Maar voordat ik dat doe, zal ik al het zichtbare debris verwijderen. Er is bijvoorbeeld eiwit en DNA dat uit de cellen lekt en deze wattenbolachtige substantie vormt, die aan de weefselklompen blijft kleven. U wilt dit eerst verwijderen omdat het anders uw pipetpunt verstopt en u het weefsel door een te kleine diameter dwingt.Vervolgens ga ik enkele van deze glazen capillairen afbreken om een opening van de juiste grootte te verkrijgen, zodat ik mijn cellen in en uit de opening kan verplaatsen. Dit is een goede pipet. Bij deze kun je zien dat hij mooi rond is en geen scherpe randen heeft.Ik ga dit in mijn glazen pipet plaatsen. Er bevindt zich een filter van 0,2 micron ertussen en ik ga nu de weefsels in en uit mijn glazen capillair bewegen. Het eerste proces zou vrij soepel moeten verlopen, omdat de weefselklonters niet veel groter zijn dan de opening van de pipet.Het doel is enkel om het weefsel los te maken. Vervolgens gebruik ik een iets kleinere pipetpunt. Ik wil bij voorkeur een mooie, schone, ronde pipetpunt gebruiken.Dit ziet er goed uit. En opnieuw: alle klonters worden tegelijkertijd in en uit de pijp bewogen. Het weefsel is nu zo zacht en losgekomen dat als u deze klonters opnieuw in medium resuspendeert, de cellen in feite zullen loslaten.Ik ga nu al mijn gedissocieerde cellen overbrengen naar een schone 15 ml conische buis en deze nog twee of drie keer voorzichtig op en neer resuspenderen om cellen die nog in grotere klonten zitten te verbreken. Vervolgens wachten we één of twee minuten zodat de grotere fragmenten die nog aanwezig zijn kunnen bezinken. Ook kunnen er glasfragmenten van de gebroken glazen capillairen aanwezig zijn die naar de bodem moeten zakken.Vervolgens kunnen we aliquots hiervan uitplaten op volledig gecoate dekglasjes of schaaltjes. Ik plateer 80 µL uit op dit glazen dekglasje dat vooraf is gecoat met polylysine, waarbij er een mooie bel ontstaat. De cellen zullen uiteindelijk bezinken en hechten aan het glazen dekglasje.Na ongeveer een uur zijn de cellen neergezakt en ik ga nu heel voorzichtig wat meer medium aan de hele schaal toevoegen. De schaal kan voorzichtig worden bewogen, zoals hier. Vervolgens gaan deze cellen in de incubator bij 37 °C en morgen zal ik ze voeden met geconditioneerd medium.Oké, dit zijn de corticale cellen. Ze zijn net iets minder dan één dag oud. Ze zijn gisteren uitgeplaat en u kunt zien dat er voldoende neuronen zijn, er zijn veel longneuronen aanwezig, en er zit ook wat celdebris tussen.Dit zijn de cellen die het niet hebben overleefd. Deze zullen bij de volgende paar voedingen worden weggewassen. De dode cellen zijn de zeer kleine ronde cellen met geplooide membranen.Ik heb zojuist laten zien hoe u deze gedissocieerde corticale culturen voorbereidt. Het is belangrijk om te onthouden dat u, wanneer u de corticale schors van de hersensnijden verwijdert, deze scheidt van de thumb sala corticale vezelbanen, aangezien deze veel niet-neurale cellen bevatten. Bovendien mag u de cellen bij het tritueren niet te veel belasten, omdat dit in feite de meeste geïsoleerde cellen die u tot nu toe heeft gegenereerd, doodt.Ga dus voorzichtig om met de weefselsnijden en u zult een prachtige cultuur verkrijgen. Veel succes met uw experimenten.

preparation-of-dissociated-mouse-cortical-neuron-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een protocollen voor een embryonale hersenen van de rat totale cultuur-systeem is beschreven. Multipotente voorlopercellen in de aggregaten kunnen ontwikkelen en differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten.

Voorbereiding van de Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron en Glia Development Studies

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om te ontleden, transfecteren via elektroporatie en cultuur muis hippocampus en corticale neuronen. Op korte termijn culturen kan worden gebruikt voor studies van axon uitgroei en begeleiding, terwijl de lange-termijn culturen kunnen worden gebruikt voor onderzoek naar synaptogenese en dendritische rug analyse.

Nucleofection en Primaire Cultuur van de embryonale Mouse hippocampus en de corticale neuronen

Dit artikel beschrijft methoden voor het afleiden van verrijkte populaties van muizen oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's) in het primair cultuur, die een onderscheid te rijpen oligodendrocyten (OLS) te produceren. Daarnaast is dit rapport beschrijft technieken te produceren voor muriene myelinating co-culturen door zaaien muis OPC's op een bedje van neurieten muis dorsale wortel ganglion neuronen (DRGNs).

Afleiding van Verrijkt oligodendrocyt Culturen en oligodendrocyt / Neuron Myelinating co-culturen van Post-natale Murine Tissues

In this video, we describe the method to obtain a pure preparation of astrocytes from newly born mice.

Astrocyte Isolation: A Method to Obtain Pure Preparation of Mouse Cortical Astrocytes

This video illustrates a method for establishing an indirect neuron-astrocyte co-culture using a compartmentalized approach. In this setup, neurons and astrocytes are spatially separated but share a conditioned medium. Neurotrophic factors released by astrocytes promote neuron differentiation and the formation of synaptic connections, suggesting neuron-glia interactions.

An Indirect Neuron-Astrocyte Co-Culture Technique for Studying Neuron-Glia Interactions

Astrocyten zijn erkend als veelzijdige cellen die deelnemen in de fundamentele biologische processen die essentieel zijn voor de normale ontwikkeling van de hersenen en functies binnen het centraal zenuwstelsel repareren. Hier presenteren we een snelle procedure voor pure muis astrocyten culturen te verkrijgen om de biologie van deze belangrijke klasse van het centrale zenuwstelsel cellen te bestuderen.

Isolatie en Cultuur van de Muis Corticale Astrocyten

Een protocol om een co-cultuursysteem te genereren dat bestaat uit neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), primaire corticale neuronen en astrocyten wordt beschreven. Dit co-cultuursysteem maakt detectie mogelijk van de vorming van synaptische contacten en circuits tussen nieuwe, iPSC-afgeleide neuronen en reeds bestaande corticale neuronen die channelrhodopsine-2 tot expressie brengen.

Een optogenetische Aanpak voor het beoordelen van de vorming van neuronale verbindingen in een co-cultuur systeem

Dit protocol beschrijft de indirecte neuron-astrocyten co-cultuur voor verzuilde analyse van neuron-glia interacties.

De indirecte Neuron-astrocyten Coculture Assay: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up voor het gedetailleerd onderzoek van het neuron-glia interacties

Hier presenteren we een protocol voor Ca2 + imaging in zenuwcellen en gliacellen, waarmee de dissectie van Ca2 + signalen bij subcellular resolutie. Dit proces is van toepassing op alle celtypes waarmee de expressie van genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren.

Dissectie van lokale Ca2 + signalen in gekweekte cellen door membraan-gerichte Ca2 + indicatoren

Hier beschreven we een protocol om de assemblage en structuur van de axon initiële segmenten (AIS) van hippocampale neuronen die geen vooraf geassembleerde AIS missen vanwege de afwezigheid van een gigantische ankyrine-G kwantitatief te bestuderen.

Gebruik van primaire gekweekte hippocampale neuronen om de assemblage van axon-initiële segmenten te bestuderen

Leer hoe je gescheiden corticale neuronculturen bereidt uit postnatale muizen voor elektrofysiologie en beeldvorming. Deze methode ondersteunt onderzoek naar neuronale ontwikkeling en genetische mutaties.

De voorbereiding van gescheiden Mouse Cortical Neuron culturen

Meer video's verkennen