Name: Zebravis dodelijke skelet Mutant doordringendheid verschuiven door nakomelingen testen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Leer selectief fokken met nakomelingentesten om de penetratie van letale skeletmutanten in zebrafish te manipuleren. Deze methode genereert hoog- en laagpenetrantere lijnen voor genetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag bedanken Chuck Kimmel voor begeleiding, John Dowd voor hulp bij de ontwikkeling van deze strategie fokken, Macie Walker voor haar werk in het perfectioneren van de skeletal vlek, en Charline Walker en Bonnie Ullmann voor nuttig zebrafish advies. Dit werk werd gesteund door K99/R00 DE024190 te JTN.

alle experimenten beschreven in dit protocol werden voltooid in overeenstemming en naleving van de Universiteit van Colorado en de Universiteit van Oregon institutionele Animal Care en gebruik commissies (IACUC).
 1. voorbereiding van de niet-geselecteerde beginnen voorraad <ol><li>identificeren heterozygoot dragers van de mutant allel van belang door fin bijknippen 11 en genotypering een voorraad van full-broer/zus dieren door een methode van keuze, zoals Kawasaki Advanced Safety 12 , 13 , 14. Dit protocol werd uitgevoerd met de stam van de zebravis mef2ca b1086.</li>
	Kawasaki Advanced Safety genotypering <li> 
	Opmerking: De specifieke primers allel voor Kawasaki Advanced Safety zijn ontworpen door het bedrijf dat de reagentia (Zie Tabel van materialen). De juiste 6-carboxyl-X-rhodamine (ROX) kleurstof concentratie voor de specifieke real-time PCR machine bezoek als u de website van de vennootschap.
	<ol><li>Plaats de zebravis staart weefsel in 50 µL van lysis buffer (10 mM tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, 0,3% niet-ionogene oppervlakteactieve stof, 0,3% Octylphenyl-polyethyleenglycol). 10 µL van 10 mg/mL proteïnase-K per putje van een 96-Wells PCR plaat en verteren in een thermische cycler bij 55 ° C gedurende 2-5 uur gevolgd door een 20 min 94 ° C inactivatie stap toevoegen. Het product van de lysis van de koelkast na vertering. Opmerking: Lysis producten kunnen met succes worden gebruikt voor enkele maanden na bereiding. Wanneer het weefsel was lysed met 50 mM NaOH, waren de Kawasaki Advanced Safety reacties niet succesvol. Deze bevindingen stellen voor dat de methode van de NaOH van genomic DNA preparaat niet compatibel met Kawasaki Advanced Safety is.</li>
		<li>Kwantificeren de genomic DNA met een spectrofotometer. Verdun de genomic DNA-sjabloon met behulp van moleculaire biologie rang water zodat elke reactie ongeveer 20-30 ng bevat. 
		Opmerking: Kwantificeren van 4 of 5 monsters, bundelen ze en maak verdunningen voor alle monsters op basis van het gemiddelde. Wanneer u dit protocol voor volwassen staart weefsel, is een 1:100-verdunning vaak voldoende. De precieze kwantificering van de concentratie van DNA is niet vereist.</li>
		<li>Toevoegen 0.14 µL van de Kawasaki Advanced Safety primer mix en 5 µL van de Kawasaki Advanced Safety meester Meng per monster op ijs in een tube van 1,5 mL microcentrifuge en meng goed voor kort centrifugeren voor het verzamelen van inhoud aan de onderkant van de buis. 
		Opmerking: Kawasaki Advanced Safety master mix is warmte en licht gevoelige, houden van de voorraad op ijs en vermijden van direct licht.</li>
		<li>Pipetteer 5 µL van primer/master mix oplossing in de wells van een 96-Wells optische PCR plaat geschikt voor de real-time PCR-machine wordt gebruikt.</li>
		<li>Pipetteer 5 µL van verdund (ongeveer 5-7 ng/µL) DNA-monsters van de sjabloon in elk goed en gecombineerd met een pipet te mengen.</li>
		<li>Toevoegen 5 µL nuclease-vrij water aan 3 putjes om te dienen als neen-template besturingselementen (NTC) en voeg 5 µL van verdunde bevestigde homozygoot wild type, heterozygoot homozygoot mutant DNA sjabloon en voor de positieve controles.</li>
		<li>Plaatst u een optisch duidelijk film zegel op de plaat ervoor te zorgen dat de film volledig is verzegeld op elk putje.</li>
		<li>Kort centrifugeren de plaat duikt met 600 x g te verzamelen van de inhoud aan de onderkant en belletjes uit de mix verwijderen. 
		Opmerking: Houd de plaat op ijs en schild van licht tot klaar om verder te gaan.</li>
		<li>De fietsen programma vermeld in tabel 1 te gebruiken voor het uitvoeren van de belangrijkste Kawasaki Advanced Safety reactie.</li>
		<li>De resulterende scatterplot geproduceerd door de computer van de analyse weergeven Een succesvolle reactie 4 afzonderlijke groepen van punten op het perceel ( Figuur 3) zal tonen: drie proeven groeperingen overeenkomen met genotype en een groepering van de NTC in de buurt van de oorsprong. De positieve controle moeten scheiden met de adequate steekproef grouping.</li>
		<li>Het computerprogramma herkent niet de plot groeperingen als corresponderend met specifieke genotypen, extra sets fietsen kunnen worden vereist (tabel 2). De extra programma herhalen totdat de computer strakke groeperingen door genotype herkent.</li>
		<li>De genotypering resultaten exporteren naar een spreadsheet-bestand voor eenvoudiger gebruik en analyse.</li>
	</ol></li> <li>Huis van de geïdentificeerde heterozygoot dieren samen op het hoofdsysteem water.</li></ol>
 2. de eerste ronde van nakomelingen scoren <ol><li>paarsgewijs Kruis broer/zus heterozygoten <ol><li>nadat de dieren uit de fin clip herstellen, paarsgewijs intercrosses instellen. Scheidingslijnen gebruiken om ervoor te zorgen dat embryo's worden synchroon 16.</li>
		<li>Verzamelen van de embryo's en de ouderlijke paren geïsoleerd in het kweken van kooien houden.</li>
		<li>Geïsoleerde volwassenen controleren zodat agressieve vis kunnen worden gescheiden of van dekking voorzien (geraspte vis netten werk mooi). Vis moeten worden gevoed en hun water gewijzigd volgens IACUC richtlijnen terwijl in statische water.</li>
	</ol></li> <li>Embryo's fokken <ol><li>fase en verhogen de zebravis embryo's larven onder standaardomstandigheden 17.</li>
		<li>Verzamelen fenotypische wild-type dieren met behulp van een glazen pipet op dag 5 of 6 wanneer de zwemblaas is opgeblazen in 75% van de koppeling. Plaats van fenotypische wilde typen in de opname van welke ouders leverde hen kinderkamer. 
		Opmerking: Met mutant allelen die kunnen dodelijk, die voor veel skelet mutanten geldt, homozygoot mutanten niet formulier zwemmen blazen 18 , 19. Daarom fenotypische wilde soorten gemakkelijk kunnen worden onderscheiden van hun mutant broers en zussen, gebaseerd op de opgeblazen zwemmen blazen.</li>
	</ol></li> <li>Alcian blauw/Alizarine Red kraakbeen en bot kleuring <ol><li>verdoving larven die doen niet blazen hun duik blazen met behulp van 0,17 g/L tricaïne-S in embryo media. Dieren in 1,5 mL microcentrifuge buizen met een wide-boring glazen pipet van Pasteur verzamelen. Toevoegen van niet meer dan 100 larven per buis.</li>
		<li>Verwijderen van embryo water uit elke buis en lossen van dieren in 1 mL 2% paraformaldehyde in 1 x PBS per buis. 
		Let op: Waterige PFA is brandbaar en zal leiden tot ernstig huid- en oogirritatie. Draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen en oogbescherming, en handen grondig wassen na gebruik.</li>
		<li>Rock voor 1 h; langere fixatie schaadt bot kleuring. De buizen controleren regelmatig tijdens dit en alle latere rockende stappen om ervoor te zorgen geen larven zijn vast aan de kant of in de onderkant van de buis samengeklonterd.</li>
		<li>Het fixeer van buizen met behulp van een precisiepipet glas verwijderen, voeg 1 mL 50% ethanol, en rock gedurende 10 minuten</li>
		<li>Voorbereiden verse kleurstofoplossing door het toevoegen van 20 µL van 0,5% Alizarine rood per 1 mL Alcian Meng (0,04% Alcian blauw/10 mM MgCl 2 / 80% ethanol). Verwijderen van 50% ethanol en voeg 1 mL kleurstofoplossing aan elke buis, en rock's nachts. Larven kunnen blijven in de vlek tot maximaal 5 dagen.</li>
		<li>Verwijderen van de vlek-oplossing van de buizen en voeg 1 mL van 80% ethanol/10 mM MgCl 2 oplossing aan elke buis. Rock van de buizen voor ten minste 1 uur; spoelen overnachting kan produceren een duidelijker Alcian blauw-vlek.</li>
		<li>Verwijderen van de 80% ethanol/10 mM MgCl 2 oplossing van de buizen, voeg 1 mL 50% ethanol en rock voor 5 min.</li>
		<li>Verwijderen van de 50% ethanol oplossing van de buizen en voeg 1 mL 25% ethanol en rock voor 5 min.</li>
		<li>Verwijder de oplossing van 50% ethanol uit de buisjes en voeg 1 mL vers bereide 3% H 2 O 2 /0.5% KOH bleken oplossing. Laat de caps open en laat de buisjes staan in in een rek van de micro-buis gedurende ongeveer 10 min of totdat een vage bruine verkleuring kan worden gezien in het bovenste deel van de oplossing. 
		Opmerking: Een laag van bubbels formulier op de top van de oplossing. Zorgvuldige timing is nodig bij deze stap zo voorbij bleken zal resulteren in een slechte dubbele vlek.</li>
		<li>Verwijder de bleken oplossing en voeg 1 mL 25% glycerol/0.1% KOH; rock voor 10 min. tot 1 h.</li>
		<li>25% glycerol/0.1% KOH-oplossing verwijderen uit de buizen, voeg 1 mL van 50% glycerol/0.1% KOH-oplossing aan elke buis, rock voor 10 min naar girale.</li>
		<li>50% glycerol/0.1% KOH-oplossing verwijderen uit de buisjes en 50% glycerol/0.1% KOH-oplossing opnieuw toe te voegen aan elke buis. Rocking zal 's nachts helpen verwijderen van luchtbellen die binnen larven accumuleren kunnen. Winkel gekleurd skelet preparaten bij 4 ° C wanneer niet wordt gebruikt.</li>
	</ol></li> <li>Fenotype scoren <ol><li>Score gekleurd gemuteerde nakomelingen voor de doordringendheid van het geselecteerde fenotype. In Nichols et al. 1 mutanten werden gescoord voor een voorval van ectopische bot. 
		Opmerking: Omdat de ouders van de zebravis in statische water en de Alizarine rode vlek met de tijd verdwijnen kan, het is belangrijk te scoren skeletten binnen een paar dagen van de voltooiing van het skelet voorbereiding.</li>
		<li>Doordringendheid is het aandeel van een genotype dat een fenotype heeft. Het percentage doordringendheid berekenen door de volgende formule: % doordringendheid = (mutanten met fenotype) / (totale aantal mutanten) × 100</li></ol></li></ol> 3. Familie selectie <ol><li>Kies twee hoge doordringendheid en twee lage doordringendheid gezinnen voor de volgende generatie. Naast doordringendheid is het belangrijk om te overwegen van vruchtbaarheid en kracht bij het kiezen van welke gezinnen te propageren; Zie discussie voor meer details hierover.</li>
	<li>Geven elk ouderlijke paar een sub voorraad id: familie.01,.02, etc.</li>
	<li>Huis ouderlijke paren op het hoofdsysteem met verschillende gemengde seks &#39; metgezel &#39; vis. Metgezel vis kunnen elke regel van de zebravis met permanente, duidelijk onderscheidende kenmerken, zoals de gewijzigde structuur van de pigmentatie of fin. 
	Opmerking: Terwijl veel onderzoekers met succes alleen fokken paren in een tank houden, gunstige resultaten worden gezien door de huisvesting van de paren met verschillende metgezel vis. Deze optionele stap kunt fokken van paren van dieren te worden bewaard in de grotere scholen en gemakkelijk ontvangen zodat zij herhaaldelijk overschreden worden kunnen zo nodig. Ouderlijke paren kunnen herhaaldelijk worden overschreden voor het genereren van grote full-broer/zus gezinnen; wacht ten minste één week voordat herhalen hetzelfde ouderlijke paar oversteken.</li>
	<li>Ruiming van de larvale gezinnen uit stap 2.2.2. die niet werden geselecteerd voor de volgende generatie.</li>
	<li>Label de tanks met de wild-type sibling larven uit geselecteerde gezinnen waar de doordringendheid van hun mutant broers en zussen en verhogen naar volwassenheid als normale.</li>
	<li>De volgende generatie zal hebben ten minste vier volledige-broer/zus families, twee voor de opwaartse lijn en twee voor de neerwaartse lijn.</li>
	<li>Wanneer larven geslachtsrijp, herhaal het protocol begint bij stap één met de nieuwe generatie.</li>
</ol>

<ol><li>Nichols, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligament+versus+bone+cell+identity+in+the+zebrafish+hyoid+skeleton+is+regulated+by+mef2ca%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca.</a> Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).</li>
<li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ahsa1+and+Hsp90+activity+confers+more+severe+craniofacial+phenotypes+in+a+zebrafish+model+of+hypoparathyroidism%2C+sensorineural+deafness+and+renal+dysplasia+%28HDR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR).</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).</li>
<li>Cox, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+of+variant+histone+H3.3+for+ectomesenchyme+potential+of+the+cranial+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002938(2012).</li>
<li>DeLaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mef2ca+in+developmental+buffering+of+the+zebrafish+larval+hyoid+dermal+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton.</a> Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).</li>
<li>McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Craniofacial+Morphogenesis+in+Zebrafish+Using+4D+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (83), e51190(2014).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. (29), e1394 (2009).</li>
<li>Lush, J. L. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022030235931095">Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value.</a> J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).</li>
<li>Lerner, I. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLerner%2C+IM+%22Population+Genetics+and+Animal+Improvement%22">Population Genetics and Animal Improvement</a>. , Cambridge University Press. (1950).</li>
<li>Shinya, M., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Highly+Homogeneous+Strains+of+Zebrafish+Through+Full+Sib-Pair+Mating%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating.</a> G3. 1 (5), 377-386 (2011).</li>
<li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dCAPS%2C+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms%3A+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).</li>
<li>Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+Efficient+Zebrafish+Genotyping+Using+PCR+with+High-resolution+Melt+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138(2014).</li>
<li>He, C., Holme, J., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping%3A+the+KASP+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping: the KASP assay.</a> Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).</li>
<li>Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11032-013-9917-x">Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement.</a> Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).</li>
<li>Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/273260117_Introduction_of_High_Throughput_and_Cost_Effective_SNP_Genotyping_Platforms_in_Soybean">Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean.</a> Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).</li>
<li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).</li>
<li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Schilling, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jaw+and+branchial+arch+mutants+in+zebrafish+I%3A+branchial+arches%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches.</a> Development. 123, 329-344 (1996).</li>
<li>McCune, A. R., Carlson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty+ways+to+lose+your+bladder%3A+common+natural+mutants+in+zebrafish+and+widespread+convergence+of+swim+bladder+loss+among+teleost+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Dev%22%5BJournal%5D)">Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes.</a> Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).</li>
<li>Mrakovčič, M., Haley, L. E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1095-8649.1979.tb03612.x/abstract">Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan).</a> J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).</li>
<li>Charlesworth, D., Willis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nrg/journal/v10/n11/full/nrg2664.html">The genetics of inbreeding depression.</a> Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).</li>
<li>McCune, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+genomic+number+of+recessive+lethals+in+natural+populations+of+bluefin+killifish+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish.</a> Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).</li>
<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li>
<li>Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+social+behavior+in+young+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Development of social behavior in young zebrafish.</a> Front Neural Circuits. 9, 39(2015).</li>
<li>Eames, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FishFace%3A+interactive+atlas+of+zebrafish+craniofacial+development+at+cellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Bio%22%5BJournal%5D)">FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution.</a> BMC Dev Bio. 13 (1), 23(2013).</li>
<li>Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((barx1+represses+joints+and+promotes+cartilage+in+the+craniofacial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton.</a> Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).</li>
<li>Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edn1+and+hand2+Interact+in+early+regulation+of+pharyngeal+arch+outgrowth+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development.</a> PLoS One. 8 (6), e67522(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Selectieve fokken onthult de subtiliteit van de genfunctie
Verschuiven van de mutant fenotypen om meer of minder ernstig door selectief fokken is een eenvoudige manier om te krijgen van nieuwe inzichten in genfunctie. In vergelijking met standaardmethoden voor niet-geselecteerde fokken, kan het protocol hier gepresenteerd een veel vollediger begrip van mutant fenotypen opleveren. In het bijzonder door het genereren van spanningen die ernstig zijn, kan de volledige breedte van ...

De zebravis is een krachtig modelsysteem voor het begrijpen van de ontwikkeling van het skelet. Met mutant zebrafish stammen, kunnen biologen ontcijferen genfunctie tijdens skeletogenesis. Skelet mutant fenotypes van zebravis kunnen echter presenteren met variabele doordringendheid1,2,3,4 die ontwikkelingsstoornissen en genetische analyses kan belemmeren. Het doel van deze methode is drievoudig. Eerst, krommen zebrafish mutant die consequent ernstige fenotypen produceren kunt downstream developmental studies zoals time-lapse opname5 en -transplantatie6. Dit soort studies kunnen worden verlamd door wilt studeren fenotypen die alleen inconsistent manifesteren. Ten tweede, inteelt zebrafish stammen kan verminderen variatie in genetische achtergrond, dus het bevorderen van experimentele consistentie en reproduceerbaarheid. Bijvoorbeeld, kunnen uitvoeren van alle in situ hybridisatie analyses op een selectief ingeteelde stam verminderen van storende variabiliteit en versterken van conclusies. Ten derde, genereren van ernstige en milde stammen zal onthullen de volledige fenotypische serie die uit een bepaalde mutatie voortvloeien kunnen.
Selectieve fokken van dodelijke mutanten lijkt op het eerste gezicht onmogelijk. Hoe kan één RAS voor doordringendheid, wanneer de dieren die worden gescoord voor selectie dood zijn? Gelukkig, methoden voor selectieve fokken door familie selectie, specifiek nakomelingen testen, gebleken doeltreffendheid in veeteelt programma's voor vele jaren7,8. Deze programma's worden voornamelijk gebruikt voor selectieve fokken voor trekken die slechts in één geslacht, zoals melkproductie in koeien of eiproductie kippen aanwezig zijn. De mannetjes van deze soorten kunnen niet rechtstreeks worden gescoord maar hun nageslacht worden gescoord, en vervolgens een waarde wordt toegewezen aan de ouders. Lenen van deze strategie, gaat het hier gepresenteerde protocol scoren de vaste en gebeitst gemuteerde nakomelingen van een paar van de zebravis die heterozygoot voor een gemuteerde gen van belang zijn. De doordringendheid van een fenotype in de homozygoot dodelijke gemuteerde nakomelingen wordt toegewezen aan de ouders bij de beslissing welke personen zal produceren de volgende generatie in de lijn. Wij vinden dat deze methode een effectief middel is van het verschuiven van doordringendheid in zebrafish dodelijke skelet mutanten1.
Gelijkaardig aan andere studies, neemt dit protocol selectief fokken onder overweging criteria zoals koppeling grootte, overleven van nakomelingen, normale ontwikkeling van embryo's en sex-ratio9. Deze factoren worden echter alle beschouwd als in het kader van een mutant achtergrond met de doelstelling van het verschuiven van de mutant doordringendheid. Daarom breidt dit protocol vorige selectief fokken paradigma's door het aanbieden van een methode om te versterken developmental mutant analyses, evenals het verhogen van de homogeniteit van de achtergrond.
Dit protocol vereist uitgebreide genotypering, dus is het belangrijk om een betrouwbare, snelle genotypering protocol op voorhand. Er zijn vele genotypering protocollen beschikbaar10,11, maar we vinden de Kawasaki Advanced Safety genotypering12,13,14 is sneller, meer kosten efficiënte en betrouwbaarder dan methoden op basis van restrictie-enzym splitsing van versterkte sequenties10. We nemen daarom een Kawasaki Advanced Safety-protocol in dit werk. Bovendien, we focus op skelet mutant fenotypen in dit protocol en omvatten een procedure voor Alcian blauw/Alizarine rood kleuring gemodificeerde van eerdere protocollen15.
De hier beschreven methode is een eenvoudige strategie voor het verschuiven van dodelijke mutant doordringendheid, naar boven of naar beneden. Terwijl dit protocol is gericht op het skelet mutant fenotypen, wij geloven dat het zal een nuttige strategie voor veehouderij van alle mutant zebrafish regels. In feite, overstijgt het nut van deze fokken strategie waarschijnlijk zebrafish. We voorspellen dat dit protocol kan worden gewijzigd om te verschuiven van doordringendheid in een brede waaier van organismen. Dodelijke doordringendheid verschuiven door het testen van de nakomelingen kan helpen duwen voorwaarts de voortgang van elk ontwikkelings geneticus.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde, pelleted, solid</td><td>Ted Pella Co.</td><td>18501</td><td>Pelleted PFA is een veiligere alternatief voor poedervormige PFA</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride, solid</td><td>Acros Organics</td><td>223210010</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, Aqueous</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>190 proof Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue, solid</td><td>Anatech Ltd.</td><td>867</td><td>Moet van Anatech zijn</td></tr><tr><td>Alizarin Red, solid</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP229 1</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP263500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide,&nbsp; solid</td><td>Fisher</td><td>P250 500</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-time PCR Machine</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' seal</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>KASP Master Mix, High ROX</td><td>LGC</td><td>KBS-1016-022</td><td>https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk</td></tr><tr><td>KASP By Design Primer Mix</td><td>LGC</td><td>KBS-2100-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl, solid</td><td>Fisher</td><td>BP153 500</td><td></td></tr><tr><td>potassium chloride, solid</td><td>Fisher</td><td>BP366 500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP337 100</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fisher</td><td>BP1700 100</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Drop Pasteur Pipets</td><td>Fisher</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>voor DNA kwantificering</td></tr></tbody></table>

zebravis dodelijke skelet mutant doordringendheid verschuiven door nakomelingen testen

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Mutant fenotypes van zebravis zijn vaak onvolledig penetrant, alleen in sommige mutanten manifesteren. Interessante fenotypen die inconsistent worden weergegeven kunnen moeilijk zijn om te studeren, en kunnen leiden tot verwarrende resultaten. Het protocol beschreven hier is een eenvoudige fokken paradigma te verhogen of doordringendheid in dodelijke zebrafish skelet mutanten. Omdat dodelijke mutanten kunnen niet selectief rechtstreeks worden gefokt, is de strategie van de klassieke selectief fokken van nakomelingen testen werkzaam. Deze methode omvat ook protocollen voor Kompetitive Allele specifieke PCR (Kawasaki Advanced Safety) genotypering zebravis en kleuring larvale zebrafish kraakbeen en bot. Toepassing van de strategie van de veehouderij die hier worden beschreven kunt verhogen de doordringendheid van een interessante skelet fenotype waardoor meer reproduceerbare resultaten in downstream toepassingen. Bovendien kan verminderen de mutant doordringendheid via deze selectieve fokken strategie onthullen de ontwikkelings processen waarvoor de functie van het gemuteerde gen meest cruciaal. Terwijl het skelet speciaal hier wordt geacht, stellen wij voor dat deze methode nuttig voor alle zebrafish mutant lijnen zijn zal.

Dit protocol is een lange termijn veehouderij techniek handig voor begrip zebrafish skelet mutanten (Figuur 1). Selectieve fokken door het testen van de nakomelingen moet opleveren een verschuiving in de algehele doordringendheid zowel neerwaartse en opwaartse in een paar generaties (Figuur 2). In onze eerdere werk reed twee rondes van het selectieve fokken naar beneden de gemiddelde doordringendheid van 17% tot 3%<sup class="xre...

Het doel van dit protocol is te wijzigen van de doordringendheid van dodelijke skelet mutant fenotypen in zebrafish door selectief fokken. Dodelijke mutanten naar volwassenheid kunnen niet worden gekweekt en zelf gefokt, dus dit protocol beschrijft een methode voor het bijhouden en selecteren doordringendheid door meerdere generaties nakomelingen testen.

Zebravis dodelijke skelet Mutant doordringendheid verschuiven door nakomelingen testen

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

Het algemene doel van deze fokstrategie is om de penetrantie van mutanten naar boven of naar beneden te manipuleren. Deze selectieve fokmethode maakt een vollediger begrip van mutante fenotypes mogelijk. Door mutante stammen met een hoge en lage penetrantie te genereren, kan de volledige fenotypische reeks van een mutatie worden begrepen.De meeste zebravissen schalen waarbij mutanten recessief letaal zijn, waardoor homozygote mutanten sterven voordat ze direct gefokt kunnen worden. Daarom passen we de klassieke selectieve fokstrategie van nageslachtenonderzoek toe, die we hier demonstreren. We hebben deze methode voor het eerst toegepast bij een poging om de ontwikkeling van ectopische botcellen via time-lapse op te nemen.Frustrerend genoeg verschenen er vaak extra botcellen, dus we zijn begonnen met het aanpassen van mutante penetranten door middel van selectieve fokkerij. Hoewel we deze methode op zebravis-schaal met een mutante lijn uitvoeren, kan deze ook worden toegepast op andere mutante fenotypen van de zebravis en waarschijnlijk op andere organismen. Bereid na het voorbereiden van de niet-geselecteerde startvoorraad zebravisen volgens het tekstprotocol de KASP-genotypering als volgt uit.Plaats het staartweefsel van de zebravis in 50 µL lysisbuffer in de wells van een 96-wells plaat. Voeg 10 µL van 10 mg/mL proteinase K per well toe en verteer de weefselmonsters in een thermocycler bij 55 °C gedurende twee tot vijf uur. Volg dit met een inactiveringsstap van 20 minuten bij 94 °C.Koel het lysaat na de digestieVoeg op ijs 0,14 microliters van de KASP primer mix en vijf microliters van de KASP master mix per monster toe aan een 1,5 milliliter microcentrifugebuis en meng dit goed. Centrifugeer vervolgens kort om de inhoud op de bodem van de buis te verzamelen. Pipetteer vijf microliters van de primer master mix-oplossing in de wells van een 96 well optische PCR-plaat die geschikt is voor de gebruikte real-time PCR-machine.Pipette vervolgens 5 µL van de verdunde DNA-template-monsters in elke put en aspireer met een pipet om te mengen. Plaats een optisch transparante folieafdichting over de plaat en zorg ervoor dat de folie elke put volledig afsluit. Centrifugeer de plaat kort bij 600 x G om de inhoud op de bodem te verzamelen en luchtbellen uit het mengsel te verwijderen.Bekijk na het uitvoeren van de belangrijkste KASP-reactie de resulterende scatterplot die door de analysecomputer is gegenereerd. Huisvest de geïdentificeerde heterozygote dieren samen in het hoofdwatersysteem. Zodra de dieren zijn hersteld van de vinnik, worden paargewijze intercrosses opgezet; gebruik dividers om te waarborgen dat de embryo's gesynchroniseerd zijn.Verzamel de embryo's en houd de ouderparen geïsoleerd in kweekkooien. Monitor de geïsoleerde volwassen vissen, zodat agressieve vissen gescheiden kunnen worden of voorzien kunnen worden van schuilplaatsen. Om de embryo's op dag vijf of zes op te kweken, wanneer de zwemblaas bij 75% van een clutch is opgeblazen, gebruik dan een glaspipet om fenotypisch wild-type dieren te verzamelen.Plaats fenotypische wilde types in de kwekerij en noteer welke ouders deze hebben opgebracht. Na het verdoven van larven die hun zwemblaas niet opblazen volgens het tekstprotocol, wordt een glazen Pasteurpipet met een wijde opening gebruikt om de dieren te verzamelen in microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter. Verwijder het embryowater uit elke buis en vervang dit door één milliliter 2%paraformaldehyde in 1x PBS.Schud de buisjes gedurende één uur op een schudplatform om de dieren te fixeren. Controleer de buisjes regelmatig tijdens deze en alle volgende schudstappen om er zeker van te zijn dat er geen larven tegen de wand zijn blijven plakken of zich op de bodem van de buis hebben opgehoopt. Gebruik een glazen pipette om het fixatief uit de buisjes te verwijderen.Voeg vervolgens één milliliter 50% ethanol toe. Schud de monsters nog 10 minuten. Bereid een verse kleuringsoplossing door 20 microliters 0,5% alizarine rood toe te voegen per één milliliter Alcian-premix.Verwijder de 50% ethanol en voeg één milliliter kleuringsoplossing toe aan elke buis. Laat de buisjes vervolgens een nacht lang schudden. Score enkele dagen na het bleken van de embryo's volgens het tekstprotocol de gekleurde mutante nakomelingen op penetranten.In dit voorbeeld scoren we op elke occurrence van een topic bone. Kies voor de volgende generatie twee families met een hoge penetrantie en twee families met een lage penetrantie. Geef elk ouderpaar een sub-stock-identificatie, bijvoorbeeld familie 4.01, 02, enzovoort.Het is ook nuttig om het generatienummer van de outcross of inteelt op alle labels te vermelden. Huisvest ouderparen in het hoofdsysteem met enkele gemengde sekse-gezelschapsvissen. Gezelschapsvissen kunnen elke zebravislijn zijn met permanente, duidelijke onderscheidende kenmerken, zoals een aangepaste pigmentatie of vinstructuur.Label de tanks met de wild-type siblinglarven uit geselecteerde families samen met de penetranten van de mutante siblings en kweek de vissen op tot volwassenheid volgens de normale procedure. Selectieve fokkerij door nakomelingentesten zou in enkele generaties een verschuiving in het totale aantal penetranten moeten opleveren, zowel naar beneden als naar boven. In deze voorbeelden, toegepast op de mef2ca b1086 mutant, werd geselecteerd op hoge of lage penetrantie van een ectopisch bot tussen het operculum en de branchiostegale straal in lethale homozygote mutanten.Bij een succesvolle cast-procedure moet het computerprogramma typegroeperingen van monsters die corresponderen met het gentype herkennen, en moeten de NTC's zich nabij de oorsprong van de plot bevinden nadat er voldoende cycli zijn uitgevoerd. Zoals hier wordt aangetoond, vertoont een succesvolle Alcian blue- en alizarinerood-kleuring levendig gekleurde bot- en kraakbeenelementen die niet transparant of vaag zijn. De grenzen van de kraakbeenelementen moeten scherp verschijnen en individuele chondrocyten moeten herkenbaar zijn.Alcian blue met een te hoge concentratie was niet duidelijk te onderscheiden van andere weefsels, waardoor analyse onmogelijk werd. De implementatie van deze techniek bij het onderhoud van de zebravislijn zal waarschijnlijk de penetrantie over een paar generaties wijzigen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals NC2-hybridisatie en timelapse-beeldvormingsstudies, consistenter resultaten opleveren.We gebruiken deze techniek om de erfelijkheid van fenotypevariatie te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u uw mutantstammen selectief kunt fokken om de penetrantie te wijzigen, zelfs als de mutatie letaal is.

shifting-zebrafish-lethal-skeletal-mutant-penetrance-progeny

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier presenteren we een systematische aanpak voor het ontwikkelen van fysiologisch relevante, gevoelige en...

In vivo modellering van de Morbid Human Genome behulp Danio rerio

De zebravis is nu een gevestigde en krachtige tool voor het modelleren van musculaire dystrofieën, aangeboren myopathieën en gerelateerde neuromusculaire ziekten. Tweekleurigheid en door aanraking veroorzaakt ontsnappingsgedrag zijn twee veelvoorkomende niet-invasieve tests die worden gebruikt om de mate van musculaire desorganisatie en bewegingsbeperking van zebravisembryo's tijdens de vroege ontwikkeling te bepalen.

Analyse van skeletspierdefecten bij larven van zebravis door middel van birisfringence- en touch-evoke escape response-assays

De zebravis is een krachtig modelsysteem voor ontwikkelingsbiologie en onderzoek naar menselijke ziekten vanwege hun genetische overeenkomsten met hogere gewervelde dieren. Dit protocol beschrijft een methodologie om haploïde zebravis-embryo's te creëren die kunnen worden gebruikt voor forward screen-strategieën om recessieve mutaties in genen die essentieel zijn voor vroege embryogenese te identificeren.

Productie van Haploid zebravis embryo&#39;s door<em&gt; In Vitro</em&gt; Bemesting

Zebravis als betrouwbare genetische modelorganismen in biomedisch onderzoek, vooral met de komst van gen-bewerken technologieën zijn gebruikt. Wanneer larvale fenotypen verwachting, kan DNA-extractie en genotype identificatie worden uitdagende. Hier beschrijven we een efficiënte genotypering procedure voor zebrafish larven, door de staart knippen, zo spoedig 72 uur na bevruchting.

High-throughput DNA-extractie en de genotypering van 3dpf Zebrafish larven door Fin knippen

Dit werk beschrijft een protocol voor het modulaire Tol2-transgenesesysteem, een gateway-gebaseerde kloonmethode om transgene constructies in zebravisembryo's te creëren en te injecteren.

Het Zebrafish Tol2-systeem: een modulaire en flexibele gateway-gebaseerde transgenesebenadering

Dit protocol beschrijft hoe efficiënte adenine-basisbewerking zonder PAM-beperking kan worden uitgevoerd om een nauwkeurig zebravisziektemodel te construeren met behulp van zSpRY-ABE8e.

Efficiënte PAM-loze basisbewerking voor zebravismodellering van menselijke genetische ziekten met zSpRY-ABE8e

Dit protocol beschrijft een screeningprocedure voor geneesmiddelen bij zebravislarven 3-7 dagen na de bevruchting, gevolgd door morfologische beoordeling.

Screening van kleine moleculen en toxiciteitstesten bij zebravislarven in een vroeg stadium

RASopathieën zijn multisysteem-genetische syndromen die worden veroorzaakt door hyperactivering van de RAS-MAPK-route. Potentieel pathogene varianten die wachten op validatie duiken continu op, terwijl slecht preklinisch bewijs de therapie beperkt. Hier beschrijven we ons in vivo protocol voor het testen en kruisvalideren van RASopathie-geassocieerde ERK-activeringsniveaus en de farmacologische modulatie ervan tijdens de embryogenese door middel van live FRET-beeldvorming in Teen-reporter...

Een efficiënt protocol om ERK-activiteitsmodulatie te beoordelen in vroege zebravismodellen van het Noonan-syndroom via live FRET-microscopie en immunofluorescentie

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van maternale mutant dat een stabiele zpc:cas9 knock-in-lijn koppelt aan Tol2-gemedieerde afgifte van sgRNA-expressiecassettes.

Generatie van maternale mutanten met behulp van zpc:cas9 knock-in zebravissen

Dit werk beschrijft een protocol voor het kwantificeren van de vorm van craniofaciaal kraakbeen met behulp van vrije software (tpsDigs2, MorphoJ en PAST) om veranderingen in gezichtsstructuur bij zebravislarven te meten.

Morfometrische analyses van vorm: De analysesoftware-toolbox voor craniofaciale vormkwantificatie bij zebravissen

Leer selectief fokken met nakomelingentesten om de penetratie van letale skeletmutanten in zebrafish te manipuleren. Deze methode genereert hoog- en laagpenetrantere lijnen voor genetisch onderzoek.

Zebravis dodelijke skelet Mutant doordringendheid verschuiven door nakomelingen testen

Meer video's verkennen