Name: Evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en In Vivo herprogrammering in de skeletspieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Leer een betrouwbare methode om senescente en pluripotente stamcellen in skeletspier te detecteren na weefselbeschadiging. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar cellulaire plasticiteit en spierregeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij zijn Clemire Cimper dank verschuldigd voor haar uitstekende technische ondersteuning. Werk in het laboratorium van H.L. werd gefinancierd door het Institut Pasteur, Centre National pour la Recherche wetenschappelijke, en het Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d'Excellence Revive, Investissement d'Avenir; ANR-10-LABX-73), de Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) en Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. en A.C. worden gefinancierd door de Ph.D. en postdoctorale beurzen van het Consortium doen herleven.

dieren werden behandeld volgens de richtsnoeren van de Europese Gemeenschap en de ethische commissie van het Institut Pasteur (CETEA) goedgekeurde protocollen.
 1. voorbereiding van de voorraad-oplossingen <ol><li>bereiden de materialen voor fixatie van de steekproef van de spier. Los 0,5 g Tragacanthgom met 20 mL water op RT om het bevriezing-insluiting medium voor spier fixatie.</li>
	<li>Bereiden van de oplossingen voor de SA-β-Gal kleuring.
	<ol><li>Bereiden de voorraadoplossingen van K 3 Fe(CN) 6 (100 mM), K 4 Fe(CN) 6 (100 mM), MgCl 2 (1 M) door het oplossen van de respectieve poeders in gedestilleerd water.</li>
		<li>De stockoplossing van 0,2% C 20 H 6 Br 4 Na 2 O 5 (eosine) door het verdunnen in water bereiden.</li>
		<li>Bereiden de stockoplossing van C 14 H 15 BrClNO 6 (X-gal) (50 mg/mL) door de ontbinding van het poeder van de X-gal in C 3 H 7 geen (dimethylformamide, DMF).</li>
		<li>Winkel K 3 Fe(CN) 6 en K 4 Fe(CN) 6 oplossingen bij 4 ° C, en MgCl 2 op RT. 
		Opmerking: X-gal kan worden opgeslagen in aliquot deel bij-20 ° C, maximaal 6 maanden. Eosine oplossing kan worden bewaard bij RT en hergebruikt na filtering indien nodig. K 3 Fe(CN) 6 en K 4 Fe(CN) 6 oplossingen zijn protectedfromthe licht. X-gal oplossing is niet stabiel in water en moet worden beschermd tegen licht.</li>
	</ol></li> <li>Voorbereiding van de oplossingen voor Nanog kleuring: de permeabilization oplossing bevat 0,1% Na 3 C 6 H 5 O 7 (Trinatriumcitraat citraat), 0,1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Triton X-100) in gedestilleerd water, die moeten worden bewaard bij 4 ° C. bereid de blokkerende oplossing met 5% foetale runderserum (FBS) in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), die moet worden opgeslagen op de RT.</li>
</ol> 2. SA-β-Gal Staining op bevroren TA spier sectie <ol><li>bereiden de fixatie materiaal voor de TA-spier door het plaatsen van een kleine hoeveelheid van de tragacanth tandvlees op een schijfje van cork.</li>
	<li>Injured muizen van beide geslachten (2 maanden oud, C57/B6) raakten gewond 10 dagen vóór de met cardiotoxin (CDX) zoals eerder beschreven 13. Gebruik niet-gewond (PBS injectie) TA van de dezelfde muis als de negatieve controle. Desgewenst in vivo herprogrammering is behandelen elke muis met Dox (1 mg/mL) in het drinkwater op dezelfde dag (beschermd tegen het licht), direct na CTX letsel. 
	Opmerking: De Dox oplossing dient te worden gewijzigd om de 3 dagen een totale behandeling gedurende 7 dagen.
	<ol><li>Isoleren zowel TA spieren (gewond en controle) van muizen zoals eerder is beschreven ( figuur 1A) 13. Te waarborgen de dwarse secties, de distale pees van de spier TA invoegen de Tragacanthgom en laat ongeveer ¾ deel van de spier buiten ( figuur 1B) bevriezen in vloeibare stikstof rechtstreeks gekoeld tolueen voor &#60; 1 min. 
		Opmerking: Zorg ervoor dat de TA spier in een loodrechte positie en in het midden van de kurk. Monsters kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C, of direct cryosectioned in secties van 10 µm.</li>
	</ol></li> <li>De TA spieren verwerken zoals beschreven in de figuur 1B.
	<ol><li>Verdelen de 1 st -10 th secties in de juiste volgorde in tien verschillende dia's op de linksboven positie van elke dia. Plaats de 11 th sectie grenzend aan de 1 st-sectie op de eerste dia; de 12 th sectie zal volgen dezelfde volgorde rechts naast de 2 nd-sectie op de tweede dia worden geplaatst. Herhaal dit proces tot 10 secties/dia worden verkregen voor tien dia's (100 afdelingen in totaal) om ervoor te zorgen van minimaal 1 mm afstand tussen de eerste en de laatste sectie.</li>
	</ol></li> <li>Fix de secties voor 4 min in PBS met 1% paraformaldehyde en 0,2% Glutaaraldehyde. Wassen met PBS, 2 x 10 min. Volgende, Incubeer de secties in PBS (pH = 5.5) voor 30 min. het uitvoeren van alle stappen op RT. 
	Opmerking: De fixatie moet worden mild te handhaven enzymatische activiteit. Voer deze stap onder de motorkap. De pH van de PBS is kritisch en de X-gal oplossing moet worden beschermd tegen licht.</li>
	<li>Incubate secties in de X-gal oplossing, bevattende: 4 mM K3Fe(CN) 6, 4 mM K4Fe(CN) 6, 2 mM MgCl2 en 400 µg/mL X-Gal in PBS, pH = 5.5. Incubeer in het donker bij 37 ° C gedurende ten minste 24 h. Wash de dia's met PBS, 3 x 10 min., op RT. 
	Opmerking: De incubatie vereist een minimum van 24 uur en 48 uur om te maximaliseren van het signaal van de SA-β-Gal kan duren. De oplossing dient te worden gewijzigd na 24 uur incubatie. De dia's moeten worden beschermd tegen licht. Als alleen SA-β-Gal kleuring wordt gewenst, ga verder met stap 2.5. Als mede met Nanog kleuring wordt gewenst, gelieve vooruit naar stap 3.1.</li>
	<li>Fix dia's in 1% paraformaldehyde in PBS voor 30 min. Wash dia's met PBS, 3 x 10 min. Counterstain met 0,2% eosine. Onderdompelen van de dia's in de oplossing van eosine voor 1 minuut en spoel ze kort met gedestilleerd water. Tot slot, monteren de dia's met waterige niet-fluorescerende montage medium (Zie Tabel of Materials). 
	Opmerking: Het is essentieel voor het uitvoeren van de na fixatie. Voer deze stap onder de motorkap. Alle stappen worden uitgevoerd op RT.</li>
</ol> 3. Immunohistochemistry met behulp van Anti-Nanog antilichaam <ol><li>herstellen van de dia's met PBS met 4% paraformaldehyde voor 10 min. wassen met PBS, 2 x 10 min. toevoegen 200 µL van de permeabilization oplossing direct op de dia's en incubeer gedurende 5 min. <ol><li>-Wash glijbanen met PBS, 2 x 5 min en in de laatste wasbeurt, gebruik 200 µL PBS met 0,25% BSA rechtstreeks op de dia's. Uitvoeren van al deze stappen op RT. 
		Let op: Voer de fixatie stap onder de motorkap.</li>
	</ol></li> <li>Incubate dia's met de primaire anti-Nanog antilichaam (eindconcentratie: 1,25 mg/mL) overnachting bij 4 ° C in PBS met 5% FBS. Dia's met PBS, 2 x 10 min wassen en in de laatste wasbeurt, gebruik 200 µL PBS met 0,25% BSA voor 5 min. uitvoeren alle het wassen stappen bij RT. 
	Opmerking: Dia's in een doos met natte papieren handdoek om te voorkomen dat verdamping Incubeer.</li>
	<li>Incubate dia's met 100 µL van rAb-HRP secundair antilichaam uit een gebruiksklare kit (Zie Tabel of Materials) voor 45 min. Wash om dia's met PBS, 3 x 5 min, verwijderen van secundair antilichaam. Uitvoeren van alle stappen op RT met bescherming tegen licht.</li>
	<li>Visualisatie <ol><li>eerste, Verdun de 3,3 &#39;-diaminobenzidine (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), schar) in de buffer van het substraat geboden door de gebruiksklare kit (20 µL van DAB voor 1 mL van de bufferoplossing substraat). Voeg 100 µL van DAB oplossing direct op elke dia en incubeer gedurende maximaal 10 min op RT. 
		Opmerking: De verdunde oplossing DAB moet vers worden bereid en kan worden opgeslagen voor tot een week bij 4 ° C. De incubatietijd kan worden aangepast om te minimaliseren van het signaal van de achtergrond, maar moet hetzelfde zijn voor alle dia's.</li>
		<li>Verwijderen de DAB-oplossing door te spoelen met water. Counterstain de dia's met snel rode oplossing (klaar om te gebruiken, raadpleegt u de Tabel of Materials) voor 20 min. Wash de dia's met water nogmaals kort.</li>
		<li>Uitdrogen hen met 95% ethanol voor 5 min gevolgd door 100% ethanol, 2 x 5 min. Tot slot, monteren de dia's met een snel uithardend montage medium (Zie Tabel of Materials).</li>
		<li>Observeren de dia's onder de Microscoop in helder veld 20 X te vermijden achtergrond. 
		Opmerking: Snel rode oplossing kan worden bewaard bij RT en hergebruikt na filtering.</li>
	</ol></li></ol> 4. Analyse en kwantificering <ol><li>SA-β-Gal kwantificering <ol><li>scannen van dia's en kies de beste gedeelten op elke dia op basis van de verworven beelden. Gebruik minstens 2 secties/TA voor de kwantificering. Beoordelen van de sectie &#39; s kwaliteit op basis van weefsel integriteit, kwaliteit van de kleuring en counterstaining. Kies voor de kwantificering, de twee hoogste kwaliteit secties met de maximaal mogelijke afstand tussen monsters, waarmee een betere vertegenwoordiging van SA-β-Gal kwantificering gedurende de hele TA spier.</li>
		<li>Kwantificering van SA-β-Gal positieve cellen ( Figuur 2).
		<ol><li>Bepalen de rang van de pixelgrootte door handmatig de kleinste en de grootste positieve SA-β-Gal cellen te selecteren.
			<ol><li>Open de digitale afbeelding van de gescande dia ImageJ softwarematig.</li>
				<li>In de interface, klikt u op &#39; analyseren &#39; &#62; &#39; Tools &#39; &#62; &#39; ROI Manager &#39; &#62; &#39; analyseren &#39; &#62; &#39; meting instellen &#39; &#62; &#39; Selecteer gebied &#39;. Gebruik het gereedschap selecteren en omringen de kleinste en grootste positieve SA-β-Gal cel en toevoegen aan de ROI-manager door te klikken op &#39; toevoegen &#39;. Meet de maten met behulp van de &#39; maatregel &#39; knop en de waarden voor later gebruik opslaan.</li>
			</ol></li> <li>Aanpassen van de parameter van de drempel om ervoor te zorgen dat alle zichtbare positieve cellen zijn geselecteerd.
			<ol><li>Zet de afbeelding om grijstinten door te klikken op &#39; Image &#39; &#62; &#39; type &#39; &#62; &#39; 8-bits &#39; ( figuur 2A). Ga vervolgens naar &#39; Image &#39; &#62; &#39; aanpassen &#39; &#62; &#39; drempel &#39;, de tweede cursor totdat alle positieve SA-β-Gal cellen zijn bedekt met rood ( figuur 2B), en klik vervolgens &#39; toepassen &#39;.</li>
				<li>Analyseren deeltjes door te klikken op &#39; analyseren &#39; &#62; &#39; analyseren deeltjes &#39; &#62; &#39; grootte (pixel ^ 2) &#39;, en de waarde die is gedefinieerd in stap 4.1.2.1 toepassen, voert u &#39; cirkelvormigheid &#39;: &#39; 0.00-1.00 &#39;, klik op &#39; ok &#39;; een samenvatting van alles wat de getelde deeltjes wordt weergegeven in de ROI-manager ( figuur 2D).</li>
			</ol></li> <li>Transfer van alle geselecteerde deeltjes naar de oorspronkelijke afbeelding. Pas de selectie handmatig om ervoor te zorgen nauwkeurige kwantificering. Toevoegen van positieve cellen (groene pijl, 2E figuur) en/of verwijderen van valse positieve cellen (rode pijl, 2E figuur). Ten slotte meten het gebied waarin de sectie ( figuur 2D) met behulp van de &#39; gereedschap selecteren &#39;. Klik op &#39; ROI manager &#39; &#62; &#39; toevoegen &#39; &#62; &#39; maat &#39;.</li>
			<li>Nog belangrijker is, het aantal positieve cellen door het gebied van de sectie normaliseren.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Nanog kwantificering <ol><li>Nanog positieve cellen onder de Microscoop in het heldere veld handmatig 20 X vergroting tellen. 
		Opmerking: Het snel rode counterstaining maakt het mogelijk goede evaluatie van de morfologie van de TA spier. De kleuring is echter zeer licht en ontbreekt een duidelijke schets van de sectie. De scanner vaak niet identificeren van de grens van de secties en niet goed kan concentreren. Het is mogelijk om te gebruiken markering aan de randen van de secties cirkel voordat u gaat scannen of gebruiken van een gevoeliger scanner voor het detecteren van de sectie. Voor het huidige protocol, is het meest efficiënt om de Nanog positieve cellen handmatig tellen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Limited+in+Vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li>
<li>Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+senescence-associated+secretory+phenotype%3A+the+dark+side+of+tumor+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression.</a> Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).</li>
<li>Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+turnover+of+senescent+cells+during+regeneration+of+a+complex+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+senescent+cells+in+optimal+wound+healing+through+secretion+of+PDGF-AA%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA.</a> Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).</li>
<li>Mosteiro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+damage+and+senescence+provide+critical+signals+for+cellular+reprogramming+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo.</a> Science. 354 (6315), (2016).</li>
<li>Chiche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury-Induced+Senescence+Enables+In+Vivo+Reprogramming+in+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle.</a> Cell Stem Cell. , (2016).</li>
<li>Ritschka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+senescence-associated+secretory+phenotype+induces+cellular+plasticity+and+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration.</a> Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).</li>
<li>Abad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+in+vivo+produces+teratomas+and+iPS+cells+with+totipotency+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features.</a> Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).</li>
<li>Ohnishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+Termination+of+Reprogramming+In+Vivo+Leads+to+Cancer+Development+through+Altered+Epigenetic+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation.</a> Cell. 156 (4), 663-677 (2014).</li>
<li>Guardiola, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Acute+Skeletal+Muscle+Regeneration+by+Cardiotoxin+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li>
<li>Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+is+required+to+prevent+p53-dependent+senescence+following+skeletal+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury.</a> Nat Commun. 6, 8528(2015).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li>
<li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+beta-galactosidase+is+lysosomal+beta-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.</a> Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).</li>
<li>Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+pH+6+beta-galactosidase+activity+indicate+cell+senescence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?</a> Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).</li>
<li>Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SA+beta+Gal+staining%3A+biomarker+or+delusion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">SA beta Gal staining: biomarker or delusion.</a> Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hier presenteren we een methode voor het detecteren van zowel verouderend en pluripotente stamcellen in de skeletspieren van Herprogrammeerbare muizen. Deze methode kan worden gebruikt om te beoordelen en kwantificeren van beide senescentie induceren cellulaire plasticiteit in vivoen onderzoeken van de rol van senescentie in weefselherstel en regeneratie.
In het huidige protocol, wordt de bepaling senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) gebruikt voor het detecteren van <e...

Cellulaire senescentie is een vorm van stressrespons gekenmerkt door een stabiel celcyclus arrestatie. In het laatste decennium, heeft onderzoek verankerd dat senescentie geassocieerd met verschillende biologische en pathologische processen wordt, met inbegrip van de embryonale ontwikkeling, fibrose en organisme vergrijzing van1,2. Cellulaire senescentie werd voor het eerst geïdentificeerd in menselijke fibroblasten aan het einde van hun Dr. levensduur getriggerd door telomere verkorting van3. Naast Dr. stress zijn er vele andere stimuli die senescentie induceren kunnen, met inbegrip van DNA schade, oxidatieve stress oncogene signalen en genomische/epigenomic wijzigingen, die kan uiteindelijk het p53/p21 en/of pRB emissieroutes naar de activeren vaststellen en versterken van de permanente groei arrestatie1. Een van de belangrijke kenmerken van verouderend cellen is dat ze metabolisch actief blijven en krachtig express een senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP): afscheiding van vele inflammatoire cytokines, groeifactoren en extracellulaire matrix factoren4. SASP factoren een belangrijke rol in het bemiddelen en versterken het senescentie effect, als gevolg van hun krachtige effecten op het aantrekken van immuuncellen en wijzigen van lokale en systemische weefsel milieus1voorgesteld. Interessant, heeft senescentie onlangs voorgesteld als belangrijk weefsel reparatie en regeneratie5,6. Gegevens uit verschillende labs, met inbegrip van ons, heeft bovendien voorgesteld dat weefsel schade-geïnduceerde senescentie cellulaire plasticiteit, via SASPs, ter bevordering van de regeneratie7-9zou kunnen verbeteren. Daarom, alle opkomende gegevens benadruk het belang van het bestuderen van senescentie in vivo.
In de post geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) tijdperk is cellulaire plasticiteit de capaciteit van een cel om een nieuwe identiteit te verwerven en te nemen een alternatieve lot wanneer blootgesteld aan verschillende stimuli, beide in cultuur en in vivo10. Het is bekend dat volledige herprogrammering bereikt in vivo11,12 worden kan, waar de uitdrukking van de de cassette met vier Yamanaka factoren: Oct4, Sox2, Klf4en c-Myc (OSKM) kunnen geïnduceerde in vivo ter bevordering van de vorming van de teratomas in meerdere organen. Daarom kan een Herprogrammeerbare muismodel (i4F) worden gebruikt als een krachtig systeem om kritische toezichthouders en trajecten die belangrijk voor cellulaire plasticiteit11 zijnte identificeren.
Een geschikt en gevoelige in vivo systeem is essentieel om te begrijpen hoe cellulaire senescentie regelt cellulaire plasticiteit in het kader van weefselregeneratie. Wij presenteren hier een robuust systeem en een gedetailleerd protocol bij het evalueren van het verband tussen senescentie en cellulaire plasticiteit in het kader van weefselregeneratie. De combinatie van cardiotoxin (CTX) geïnduceerde spier schade in de Tibialis Anterior (TA) spiergroep, een gevestigde systeem te bestuderen Weefselregeneratie en de muismodel van i4F, kan de detectie van cellulaire senescentie zowel in vivo herprogrammering tijdens regeneratie van de spier.
Om te beoordelen van het verband tussen cellulaire plasticiteit en senescentie, zijn i4F muizen gewonden met CTX voor het opwekken van acute spier schade en behandeld met doxycycline (0,2 mg/mL) meer dan 7 dagen voor het opwekken van in vivo herprogrammering. Terwijl een CTX acute spier schade geïnduceerde en regeneratie protocol heeft onlangs gepubliceerde13, om ethische redenen, zal deze procedure in het huidige protocol worden weggelaten. TA spier monsters zal worden genomen op 10 dagen post letsel13, wanneer het hoogtepunt van verouderend cellen zijn eerder waargenomen14. Dit gedetailleerde protocol beschrijft hier, alle vereiste stappen voor het evalueren van het niveau van senescentie (via SA-β-Gal) en herprogrammering (via IHC kleuring voor Nanog).
Senescentie-geassocieerde beta-galactosidase (SA-β-Gal) assay is de meest gebruikte test voor de opsporing van beide verouderend cellen in cultuur en in vivo15. Vergeleken met andere testen, maakt de SA-β-Gal-bepaling de identificatie van de verouderend cellen in hun eigen omgeving met intact weefsel architectuur, die vooral belangrijk voor in vivo onderzoek is. Bovendien is het mogelijk om alleen de SA-β-Gal-assay met andere markeringen met behulp van IHC. Echter, de SA-β-Gal assay hoeft vers of bevroren monsters, die nog steeds een belangrijke beperking. Wanneer vers of bevroren weefsels routinematig beschikbaar, zoals bevroren TA spier monsters zijn, is SA-β-Gal uiteraard de meest geschikte test te detecteren verouderend cellen. NANOG is de markering gebruikt om te ontdekken van reprogramed cellen om twee redenen: 1) het is een fundamentele marker voor pluripotent; 2) nog belangrijker, de expressie wordt niet gedreven door doxycycline (dox), dus het detecteert geïnduceerde pluripotent in plaats van de gedwongen expressie van de Yamanaka cassette.
Het is belangrijk op te merken, de kleuring protocollen gepresenteerd in deze studie kunnen afzonderlijk worden uitgevoerd om de kwantificering procedure te vereenvoudigen, maar kunnen ook worden gedaan in een mede kleuring procedure te visualiseren beide verouderend en pluripotente stamcellen op dezelfde sectie.

<table><tbody><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>13746-66-2</td><td>Voor SA-&beta; Gal kleuringsoplossing</td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td>Voor SA-&beta; Gal kleuringsoplossing</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td>Voor SA-&beta; Gal kleuringsoplossing</td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td>Voor SA-&beta; Gal kleuringsoplossing</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma</td><td>D3447</td><td>Voor het induceren van in vivo herprogrammering</td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Lotaxan Valence, Frankrijk</td><td>L8102</td><td>Voor spierbeschadiging</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>111-30-8</td><td>Voor fixatieoplossing</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron microscopy science</td><td>50-980-487</td><td>Voor fixatieoplossing</td></tr><tr><td>NaCitrate : Natriumcitraat monobasisch bioxtra, anhydre</td><td>Sigma</td><td>18996-35-5</td><td>Voor permeabilisatieoplossing</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>Voor permeabilisatieoplossing</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A3608</td><td>Wasoplossing</td></tr><tr><td>Antibody anti- Nanog</td><td>Cell signalling</td><td>8822S</td><td>Konijnen monoklonaal antilichaam</td></tr><tr><td>EnVision+ Kits (HRP. Konijn. DAB+)</td><td>Dako</td><td>K4010</td><td>Voor Nanog-revelatie</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Leica</td><td>380159EOF</td><td>Contrakleuring</td></tr><tr><td>Fast red</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3403</td><td>Contrakleuring</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Immu-Mount</td><td>Fisher scientific</td><td>9990402</td><td>Monteringsoplossing</td></tr><tr><td>Snelhardende montagemedium voor microscopie: Eukitt&reg;</td><td>Sigma</td><td>25608-33-7</td><td>Monteringsoplossing</td></tr><tr><td>Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectieven</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Microscoop voor Nanog-kwantificering</td></tr><tr><td>Muis: i4F-A</td><td>Abad et al., 2013</td><td>N/A</td><td>Herprogrammeerbaar muismodel</td></tr><tr><td>Skelettalspier, Tibialis Anterior</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Scanner</td><td>Zeiss</td><td>Axio Scan Z1</td><td>Schermen van dia's</td></tr></tbody></table>

evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en in vivo herprogrammering in de skeletspieren

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellulaire senescentie is een stress-respons die wordt gekenmerkt door de arrestatie van een stabiele cellulaire groei, die belangrijk is voor veel fysiologische en pathologische processen, zoals kanker en veroudering. Senescentie heeft onlangs ook betrokken bij weefselherstel en regeneratie. Dus, het is geworden steeds kritischer te identificeren verouderend cellen in vivo. Senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) assay is de meest gebruikte bepaling te detecteren verouderend cellen zowel in cultuur en in vivo. Deze test is gebaseerd op de verhoogde lysosomale inhoud in de verouderend cellen, waardoor de histochemische detectie van lysosomale β-galactosidase-activiteit bij een suboptimale pH (6 of 5.5). In vergelijking met andere testen, zoals de stroom cytometry, hierdoor is de identificatie van verouderend cellen in hun verblijfplaats omgeving, die waardevolle informatie zoals de locatie met betrekking tot de architectuur van weefsel, de morfologie, biedt en de mogelijkheid tot koppeling met andere markeringen via immunohistochemistry (IHC). De grote beperking van de bepaling van de SA-β-Gal is de vereiste van vers of bevroren monsters.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om te begrijpen hoe cellulaire senescentie bevordert cellulaire plasticiteit en weefsels regeneratie in vivo. We SA-β-Gal gebruiken voor het detecteren van verouderend cellen in de skeletspieren van verwonding, dat een gevestigde systeem is te bestuderen van weefselregeneratie. Bovendien gebruiken we IHC voor het detecteren van Nanog, een marker van pluripotente stamcellen, in een transgeen muismodel. Dit protocol laat ons toe om te onderzoeken en kwantificeren van cellulaire senescentie in het kader van geïnduceerde cellulaire plasticiteit en in vivo herprogrammering.

Opsporen van spier letsel-geïnduceerde cellulaire senescentie
Het heeft onlangs aangetoond dat spier letsel voorbijgaande cellulaire senescentie14 induceert. Op 10 dagen na letsel (DPI), de meerderheid van de beschadigde myofibers ondergaan regeneratie met de centraal gelegen kernen, een kenmerk van het regenereren van de myofibers, en de architectuur van de spier is hersteld. De infiltrating ontstekingscell...

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol bij het detecteren van zowel verouderend en pluripotente stamcellen in de skeletspieren op letsel tijdens het inducerende in vivo herprogrammering. Deze methode is geschikt voor de evaluatie van de rol van cellulaire senescentie tijdens Weefselregeneratie en herprogrammering in vivo.

Evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en In Vivo herprogrammering in de skeletspieren

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Het algemene doel van dit protocol is om zowel in vivo senescentie als herprogrammering in de skeletspier na weefselbeschadiging te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kritische vragen in het veld van de regeneratieve geneeskunde, zoals de vraag hoe de cellulaire plasticiteit kan worden verhoogd om spierregeneratie te bevorderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een betrouwbare methode biedt om senescente cellen in de residente omgeving te detecteren en te kwantificeren.Cellulaire senescentie is onlangs geïmpliceerd bij weefselherstel en regeneratie. Het begrijpen van de mechanismen waardoor senescentie bijdraagt aan weefselherstel en regeneratie zal zeker een impact hebben op de regeneratieve geneeskunde. We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we de potentiële impact van weefselschade op in vivo herprogrammering in skeletspieren onderzochten.Om deze procedure te starten, worden de slides met spiermonsters vier minuten gefixeerd in 1% paraformaldehyde en 0,2% glutaraldehyde in PBS. Was daarna de slides twee keer met PBS, telkens gedurende 10 minuten. Was de slides vervolgens 30 minuten met PBS, pH 5,5.Incubeer vervolgens de secties met de X-gal-oplossing in het donker bij 37 °C gedurende minimaal 24 uur. Was de coupes daarna drie keer met PBS, telkens gedurende 10 minuten. Fixeer de coupes vervolgens na deze stap met PBS die 1% paraformaldehyde bevat gedurende 30 minuten.Was tenslotte de objectglazen drie keer met PBS. Kleur vervolgens tegen met 0,2% eosine door de objectglazen één minuut lang in de eosine-oplossing te dompelen. Spoel ze daarna kort af met gedestilleerd water.Monteer de coupes met een waterig, niet-fluorescerend monteermiddel. Fixeer de coupes gedurende 10 minuten met PBS met 4%paraformaldehyde. Was ze tweemaal met PBS, telkens gedurende 10 minuten.Voeg vervolgens de permeabilisatielosning toe en incubeer gedurende vijf minuten. Was daarna de slides twee keer met PBS, telkens gedurende vijf minuten. Voeg bij de laatste wasbeurt 200 µL PBS, bevattende 0,25% BSA, gedurende vijf minuten direct op de slides toe.Incubeer de objectglazen overnight bij 4 graden Celsius in PBS met 5% FBS met het primaire anti-Nanog antilichaam in een concentratie van 1,25 micrograms per milliliter. Was de objectglazen tweemaal met PBS, telkens gedurende 10 minuten. Gebruik bij de laatste wasbeurt 200 microliters PBS met 0,25% BSA gedurende vijf minuten.Incubeer de preparaten vervolgens gedurende 45 minuten met 100 µL RAB-HRP secundair antilichaam uit een gebruiksklare kit. Was de preparaten daarna drie keer met PBS, telkens gedurende vijf minuten, om het secundaire antilichaam te verwijderen. Verdun vervolgens DAB in de substraatbuffer die bij de gebruiksklare kit is geleverd.Vortex krachtig. Voeg 100 µL DAB-oplossing direct toe aan elke slide en incubeer maximaal 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de DAB-oplossing door de slides af te spoelen met water.Kleur de coupes tegen met fast red-oplossing gedurende twee minuten. Was de coupes vervolgens opnieuw kort met water. Dehydrateer ze daarna gedurende vijf minuten met 95% ethanol, gevolgd door twee keer vijf minuten met 100% ethanol.Monteer daarna de coupes met een snelhardend monteermiddel. Observeer de coupes onder de microscoop in helderveld bij 20x om achtergrondruis te vermijden. Scan bij deze procedure de coupes en kies op elke coupe de twee secties van de beste kwaliteit met de maximaal mogelijke onderlinge afstand, gebaseerd op de weefselintegriteit, de kwaliteit van de kleuring en de tegenkleuring.Tel de SA-Beta-Gal-positieve cellen in deze twee coupes en bereken de gemiddelde waarde. Bepaal vervolgens de rangorde van de pixelgrootte door handmatig de kleinste en de grootste positieve SA-Beta-Gal-cellen te selecteren. Klik in de ImageJ-interface op Analyze, Tools, ROI Manager, Analyze, Set Measurement.Select vervolgens Area. Gebruik het selectie-instrument om de kleinste en de grootste positieve SA-Beta-Gal-cel te omcirkelen en voeg deze toe aan de ROI Manager door op Add te klikken. Meet daarna de grootten met de Measure-knop en sla de waarden op voor later gebruik.Pas vervolgens de drempelwaarde-parameter aan om er zeker van te zijn dat alle zichtbare positieve cellen zijn geselecteerd. Zet de afbeelding om naar grijstinten door te klikken op Image, Type en vervolgens op 8-bit. Ga daarna naar Image, Adjust en Threshold.Verschuif de tweede cursor totdat alle positieve SA-Beta-Gal-cellen rood zijn gemarkeerd en klik vervolgens op Apply. Analyseer de partikels door te klikken op Analyze, Analyze Particles, gevolgd door Size, en pas de eerder gedefinieerde waarde toe. Voer bij Circularity 0,00-1,00 in en klik op OK. Een overzicht van alle getelde partikels wordt weergegeven in de ROI Manager.Breng nu alle geselecteerde deeltjes over naar de oorspronkelijke afbeelding. Pas de selectie handmatig aan om een nauwkeurige kwantificering te waarborgen. Voeg positieve cellen toe of verwijder fout-positieve cellen.Meet tot slot het oppervlak door de sectie te omlijsten met de selectietool. Klik op ROI Manager, Add en vervolgens op Measure. Tel onder de microscoop handmatig de Nanog-positieve cellen in het helderveld bij een 20x vergroting.Hier wordt een schematische weergave getoond om de in vivo herprogrammering en het niveau van senescentie na spierletsel te evalueren. Hier zijn de representatieve afbeeldingen van SA-Beta-Gal- en Nanog-kleuringen op bevroren coupes van beschadigde skeletspier. Deze beelden tonen de SA-Beta-Gal-kleuring, tegengekleurd met eosine, en de kleuring van Nanog, tegengekleurd met fast red.De niet-geblesseerde spieren worden bovenaan getoond, terwijl de geblesseerde spieren onderaan worden getoond. Deze grafiek toont de kwantificering en correlatie van SA-Beta-Gal-positieve en Nanog-positieve cellen in opeenvolgende secties op 10 dagen na het letsel. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om altijd een negatieve controle op te nemen om de specificiteit van de kleuring te waarborgen.Na deze procedure kunnen alle methoden, zoals immunofluorescentie en het kiezen van verschillende markers voor senescentie, worden uitgevoerd op alle celtypen om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de cellulaire identiteit van de senescente cellen. Na elke ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van senescentie, of weefselherstel en -regeneratie, om te onderzoeken hoe cellulaire senescentie de cellulaire plasticiteit kan bevorderen om weefselherstel en -regeneratie bij zoogdieren te faciliteren. Na het bekijken van deze video zou u dus een goed begrip moeten hebben van hoe zowel senescente als gereprogrammeerde cellen in vivo kunnen worden geïdentificeerd.

evaluation-injury-induced-senescence-vivo-reprogramming-skeletal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De micro-ontleed explantaten techniek is een robuuste en betrouwbare methode voor het isoleren van proliferatieve skeletspieren cellen van jonge, volwassen of embryonale spieren als bron van skeletspieren stamcellen. Uniek, zijn deze cellen zijn klonaal ontleend aan de skeletspieren stamcellijnen gebruikt voor in vivo transplantatie te produceren.

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

Geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide myogene voorlopers zijn veelbelovende kandidaten voor celtherapiestrategieën om spierdystrofieën te behandelen. Dit protocol beschrijft transplantatie en functionele metingen die nodig zijn om de engraftment en differentiatie van iPSC-afgeleide mesoangioblasten (een type spiergenitors) te evalueren in muismodellen van acute en chronische spierregeneratie.

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Skeletspieren is essentieel voor de motoriek en is het lichaam 'belangrijkste eiwit store. Muscle gezondheid metingen binnen C. elegans beschreven. Prospectieve veranderingen in de spier structuur en functie worden beoordeeld met behulp van gelokaliseerde GFP en kationische kleurstoffen.

Methoden om subcellulaire compartimenten van Muscle beoordelen C. elegans

Dit protocol beschrijft een robuuste, reproduceerbare en eenvoudige methode van isolatie en de cultuur van myoblast stamcellen uit de skeletspieren van volwassen en ouderen. De spieren die hier gebruikt behoren voet- en beenspieren. Deze aanpak maakt het isoleren van een verrijkte populatie van primaire myoblasten voor functionele studies.

Voorbereiding en Cultuur van Myogene voorloper cellen / Primary myoblasten uit Skeletal Muscle van Adult en Aged Humans

We beschrijven een nieuwe experimentele techniek die wij minimaal invasieve spier insluiten (MIME), die is gebaseerd op het bewijsmateriaal bellen dat skelet spierweefsel levensvatbare myogenic cellen, die vergemakkelijken donor-cel-gemedieerde myogenesis bevat kunnen wanneer ingeplant een host spier.

Minimaal invasieve spier insluiten (MIME) - een roman experimentele techniek ter vergemakkelijking van de Donor-cel-gemedieerde Myogenesis

Meting van knaagdier skeletspieren contractiele functie is een nuttig instrument dat kan worden gebruikt voor het bijhouden van de progressie van de ziekte, alsmede de werkzaamheid van de therapeutische interventie. Hier beschrijven we de niet-invasieve, in vivo beoordelingvan de releveurs spieren die na verloop van tijd in de dezelfde muis kan worden herhaald.

Niet-invasieve beoordelingvan releveurs spier functie in muizen

Skeletspierregeneratie wordt aangedreven door weefsel ingezeten spierstamcellen, die bij veel spierziekten zoals spierdystrofie worden aangetast, en dit resulteert in het onvermogen van spieren om te regenereren. Hier beschrijven we een protocol dat het mogelijk maakt om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekte.

Het onderzoeken van Spierregeneratie in Zebrafish Modellen van Spierziekte

In dit protocol wordt een in vitro kweek- en functionele analysemethode voor spierstamcellen beschreven, die de meeste van hun interacties met hun endogene niche behoudt.

Single Myofiber Culture Assay voor de beoordeling van volwassen spierstamcelfunctionaliteit Ex Vivo

Skeletspieren bestaan uit meerdere celtypen, waaronder residente stamcellen, elk met een speciale bijdrage aan de homeostase en regeneratie van spieren. Hier worden de 2D-kweek van spierstamcellen en de spiercelniche in een ex vivo setting beschreven die veel van de fysiologische, in vivo en omgevingskenmerken behoudt.

Niet-gefractioneerde bulkkweek van skeletspieren van muizen om niche- en stamcelrust te recapituleren

Het doel van dit protocol is om een orofaciale spierfibrosemodel op te stellen. Vergelijking van de histologie tussen muizenkauwspier en tibialis anterieure spier na bevriezingsletsel bevestigde fibrose van de kauwspier. Dit model zal verder onderzoek naar het mechanisme dat ten grondslag ligt aan orofaciale spierfibrose vergemakkelijken.

Bevriezingsletsel in de Masseter-spier van de muis om een orofaciale spierfibrosemodel vast te stellen

Leer een betrouwbare methode om senescente en pluripotente stamcellen in skeletspier te detecteren na weefselbeschadiging. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar cellulaire plasticiteit en spierregeneratie.

Evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en In Vivo herprogrammering in de skeletspieren

Meer video's verkennen