Name: Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Leer laser microirradiatie om DNA-schade te induceren en celreacties in vivo te bestuderen. Deze methode maakt real-time analyse van reparatiefactor-dynamiek en schadeherkenning op hoge resolutie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Akira Yasui bij Universiteit van Tohoku, Japan voor het GFP-NTH1 expressie plasmide, en Dr. Eros Lazzerini Denchi aan het The Scripps Research Institute, La Jolla, Californië voor de TRF2-YFP en EGFP-53BP11220-1711 expressie plasmiden. Dit werk werd gesteund door de Air Force Office voor wetenschappelijk onderzoek (FA9550-04-1-0101) en de Beckman Laser Institute Inc Foundation (M.W.B), de Ford Foundation Fellowship van de nationale Academie van Wetenschappen (aan B.A.S), en NSF MCB-1615701 en CRCC CTR-17-426665 (naar K. Y.).

De auteurs hebben niets te onthullen.

De voordelen van het gebruik van laser microirradiation voor DDR onderzoek zijn:
1. het is haalbaar voor het opwekken van verschillende typen en hoeveelheden DNA schade van eenvoudige strand einden aan complexe DNA-beschadiging op te sporen verschillende reparatie factoren op het DNA beschadigen sites door de laser bestraling parameters aan te passen. Het is ook mogelijk om meerdere keren in de dezelfde celkern schade toebrengen, teneinde de trans effecten (zoals in <strong class="xfi...

In Vivo DNA schade signalering is niet goed begrepen In vivo, is DNA complexvorm met histonen en andere factoren aan formulier chromatine vezels. Regulering van de structuur van de chromatine is van het allergrootste belang voor DNA-metabolisme. Bijvoorbeeld, is de Histon variant H2AX phosphorylated door Ataxie Teleangiëctasie gemuteerd (ATM) en andere kinases volgende dubbel-strand (DSB) inductie breekt, en is belangrijk voor DSB schade signaal versterking, alsmede het verstrekken van een docking site voor andere factoren. Verspreiding van schade signalering en reparatie traject keuze lijken te kritisch worden beïnvloed door lokale chromatine structuur bij schade sites1. Een aantal chromatine remodeling factoren, histone chaperones en Histon wijzigen enzymen inderdaad schade sites worden gerekruteerd en zijn belangrijk voor efficiënte DNA-reparatie, benadrukken het belang van chromatine verordening in de DDR en2 reparatie , 3 , 4. bovendien schade site clustering of herpositioneren werd waargenomen in gist en drosophila5,6,7,8, die doet denken aan Herlokalisatie van gene loci in de subnuclear compartiment gene verordening9,10is gekoppeld. Recente studies in muizen en menselijke cellen bleek ook mobilisatie van DSB sites, welke invloeden trouw en traject keuze11,12 repareren. Dit leidt tot de mogelijkheid dat DDR/reparatie ook worden nauw met nucleaire architectuur, organisatie van de chromatine van hogere-orde en chromosoom dynamiek in de celkern verbonden kan. Het is dus een kritische studie van de DDR en herstelprocessen in het kader van de endogene nucleaire omgeving in een levende cel om te begrijpen van de korte - en lange termijn gevolgen van DNA-beschadiging high-resolution methoden te ontwikkelen.
Kritische rol van PAR Polymerase (PARP) in het meten van de omvang en de soort schade en het regelen van eiwit vergadering op de Site van de schade PARP1 is een DNA nick sensor snel geactiveerd door DNA-schade die een cruciale rol in DNA reparatie13 speelt. PARP1 was oorspronkelijk gedacht te functioneren samen met X-Ray repareren Cross aanvulling 1 (XRCC1) ter vergemakkelijking van de base excision repair (BER), maar recente studies onthullen haar rol in andere DNA repair pathways, met inbegrip van DSB reparatie14. PARP1 gebruik nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) geactiveerd als substraat om ADP-ribosylate meerdere doel eiwitten, met inbegrip van zelf. Dit enzym en andere familieleden hebben aangetrokken veel aandacht in de afgelopen jaren als PARP-remmers als veelbelovende therapeutische geneesmiddelen voor kanker opgedoken. Hoewel de PARP-remmers bleken aanvankelijk te worden effectief in het borstkankergen (BRCA)-gemuteerd borstkankercellen, er is nu een overvloed aan bewijs voor de gevolgen daarvan in mono- en combinatie therapieën samen met DNA beschadigen agenten/bestraling tegen een breed spectrum van kanker met mutaties niet beperkt tot BRCA15,16,17,18,19,20.
Op moleculair niveau, werd PARP activering getoond om te spelen belangrijke rol bij het organiseren van de structuur van de lokale chromatine op schade sites. PAR-afhankelijke aanwerving van chromatin wijziging enzymen vergemakkelijkt DSB reparatie en dicteert herstel traject keuzes, suggereren de belangrijke steigers rol van PAR wijziging op schade sites. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 we onlangs aangetoond de uitsluiting van p53-bindend-proteïne 1 (53BP1) tegen schade door PAR 32, bieden een alternatieve verklaring voor 53BP1-afhankelijke hyperactivering van niet-homologe endjoining (sites NHEJ) door de PARP-remmer en het benadrukken van het belang van PARP in DSB repareren traject keuze33,34. PARP1 ook factoren rechtstreeks PARylates en is van invloed op de activiteit van meerdere DNA repair14.
Met behulp van Laser Microirradiation als een instrument om te studeren DDR/reparatie In Vivo Laser microirradiation tot sub micron wijzigingen op afzonderlijke chromosomen werd eerst beschreven in 196935 en herzien in detail in 198136. Enkele decennia later, laser microirradiation bleek voor het opwekken van DNA-beschadiging op een gedefinieerde submicrometer regio in de celkern, en bleek te zijn een waardevolle techniek te studeren aanwervings- en wijzigingen van verschillende factoren aan DNA laesies in vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. deze methode maakt de ontdekking van de factoren die geen aparte bestraling-geïnduceerde foci (IRIF vormen) bij schade sites39,42. Het is ook mogelijk om te onderzoeken de spatio dynamiek van chromatine structurele wijzigingen zowel op schade plaatsen en in de rest van de kern. Wij zorgvuldig ten opzichte van de DDRs die zijn geïnduceerd door verschillende laser-systemen en de inbreng van de bevoegdheden om te evalueren van de relatie tussen het type van DNA-schade en de microirradiation voorwaarden32,43,44, 45. De afwijkende werving patronen van 53BP1 en Telomere Herhaal bindende factor 2 (TRF2) werden waargenomen in de vorige laser schade studies, die vormde de basis voor de terugkerende zorg voor de "niet-fysiologische" aard van de laser-veroorzaakte schade46 ,47,48,49. We vonden dat deze duidelijk verschillen nu kon worden verklaard door differentiële PARP signalering die meters de hoeveelheid en complexiteit van geïnduceerde schade32. We bevestigd dat: 1) laser-microirradiated cellen (zelfs na hoge input-power bestraling) in interfase in een schade checkpoint controle-afhankelijke manier worden gearresteerd en levensvatbaar blijven (minstens tot 48 h)32,50; en 2) reparatie factor werving/wijzigingen getrouw recapituleren die waargenomen met de behandeling met conventionele DNA schadelijke stoffen en DSB inductie door enzym32,39,42, 44,,50,51,52. Deze resultaten is groot voorstander van de fysiologische relevantie van het bestuderen van laser schade-geïnduceerde cellulaire reacties.

<table><tbody><tr><td>Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900</td><td>Coherent Inc.</td><td>Mira 900</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>63X/1.4 NA objective</td><td>Zeiss</td><td>APOCHROMAT Ph3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Compact Rotation Stage&nbsp;</td><td>Newport Corp</td><td>PR50PP</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>Warner</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Heating System</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>10918</td><td></td></tr><tr><td>Gas Incubation System</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>11920</td><td></td></tr><tr><td>Laser Power and Energy Meter (RoHS)</td><td>Coherent</td><td>FieldMaxII-TOP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-R2 Digital CCD Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 META Laser Scanning Microscopes</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X/1.3 NA Zeiss Plan APO</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm Gridded Dishes&nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD-D</td><td></td></tr><tr><td>PtK2 kidney epithelial cells</td><td>ATCC</td><td>CCL 56&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Independent Medium&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>Advanced MEM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12492-013</td><td>aangevuld met L-Glutamine, 4% FBS</td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine&nbsp;</td><td>&nbsp;SIGMA</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>serum free media&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; (Opti-MEM I Reduced Serum Media)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (muis)</td><td>Kamiya Biomedical Company</td><td>MC-062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-XRCC1 (muis )</td><td>Gene Tex Inc</td><td>GTX72311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-53BP1 (konijn)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-22760</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CtIP (konijn)</td><td>Abcam</td><td>ab70163</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAR polymeren (muis)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-SA216-0100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAR (konijn)</td><td>Trevigen</td><td>4336-BPC-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRF2 (muis)</td><td>Novus Biological&nbsp;</td><td>NB100-56506</td><td></td></tr><tr><td>Anti 6-4PP (muis)</td><td>Kamiya Biomedical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rad21 (Konijn)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; (voor cohesine detectie)</td><td>gegenereerd in Yokomori (KY) lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rad51 (Konijn)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8349</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ku70 (muis)</td><td>&nbsp;Novus Biologicals</td><td>NB100-102</td><td></td></tr><tr><td>8-oxiguanine&nbsp;</td><td>Trevigen, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-PARP1&nbsp; (Konijn)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>gegenereerd in KY lab</td><td></td><td>ref 43</td></tr><tr><td>&nbsp;Anti-hCAPG (Konijn)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; (voor condensine detectie)</td><td>gegenereerd in KY lab</td><td></td><td>ref 42</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>&nbsp;Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>HiPerFect siRNA Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>GFP-SMC1 stabiele cellijn&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>gegenereerd in KY lab</td><td></td><td>ref 49&nbsp;</td></tr><tr><td>GFP-NEIL2 stabiele cellijn</td><td>gegenereerd in KY lab</td><td></td><td>ref 54</td></tr><tr><td>GFP-NTH1 stabiele cellijn</td><td>gegenereerd in KY lab</td><td></td><td>ref 32</td></tr><tr><td>GFP-SMC1 plasmid</td><td>gegenereerd in KY lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-Ku plasmid</td><td>gegenereerd in KY lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-MDC1 (konijn)</td><td>&nbsp;Novus Biologicals</td><td>NB100&ndash;395</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gH2AX (konijn)</td><td>&nbsp;Millipore</td><td>07&ndash;164</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stabiele cellijn</td><td>gegenereerd in Berns lab</td><td></td><td>ref 32</td></tr><tr><td>TRF2-YFP PtK2 stabiele cellijn</td><td>gegenereerd in Berns lab</td><td></td><td>ref 32</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PARG remmer</td><td>Trevigen</td><td>4680-096-03</td><td></td></tr><tr><td>DNA&ndash;PKcs remmer NU7026&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N1537</td><td></td></tr><tr><td>ATM remmer KU55933</td><td>&nbsp;Calbiochem</td><td>118500</td><td></td></tr><tr><td>Olaparib&nbsp;</td><td>Apexbio Technology</td><td>A4154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&nbsp;</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS</td><td>100503-916 (EA)</td><td></td></tr><tr><td>Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9</td><td>Bio-Rad</td><td>SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC&nbsp;</td><td>beeldanalyseprogramma</td></tr><tr><td>Excel</td><td>microsoft</td><td></td><td>spreadsheetprogramma</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>detergens</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X zonder calcium en magnesium</td><td>Fisher Scientific</td><td>14200166</td><td>verdun tot 1X&nbsp;</td></tr></tbody></table>

laser microirradiation om te studeren in vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe dna-schade

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA-beschadigingen induceert specifieke signalering en reparatie reacties in de cel, die is van cruciaal belang voor de bescherming van de integriteit van het genoom. Laser microirradiation werd een waardevol experimentele instrument te onderzoeken de DNA schade reactie (DDR) in vivo. Hierdoor real-time hoge resolutie eencellige analyse van macromoleculaire dynamiek in reactie op laser-veroorzaakte schade beperkt tot een submicrometer regio in de celkern. Verschillende laser omstandigheden zijn echter gebruikt zonder waardering van verschillen in de soorten schade veroorzaakte. Dientengevolge, de aard van de schade is vaak niet goed gekenmerkt of gecontroleerd, waardoor de schijnbare tegenstrijdigheden in de aanwerving of wijziging profielen. We toonden aan dat verschillende bestraling voorwaarden (d.w.z., verschillende golflengten evenals verschillende input bevoegdheden (irradiances) van een femtoseconde (fs) nabij-infrarood (NIR) laser) proteïne assembly's van verschillende DDR en reparatie geïnduceerde. Dit weerspiegelt het soort DNA schade geproduceerd. Dit protocol beschrijft hoe titratie van laser ingangsvermogen toestaat inductie van verschillende hoeveelheden en complexiteit van de DNA-beschadiging, die gemakkelijk kan worden gecontroleerd door detectie van base en crosslinking schade, differentiële poly (ADP-ribose) (PAR) signalering, en traject-specifieke reparatie factor assemblages op schade sites. Nadat de schade-voorwaarden zijn vastgesteld, is het mogelijk om te onderzoeken van de effecten van verschillende schade complexiteit en differentiële schade signalering en uitputting van de upstream factor(en) op enige factor van belang.

PtK2 cuvetten stabiel uiting van EGFP-53BP11220-1711 of -TRF2-YFP, werd laser ingangsvermogen titratie uitgevoerd om te bepalen van de optimale voorwaarde voor hun werving (Figuur 1)32.
Op hoge input-vermogen laser schade sites, de aanzienlijke clustering van BPR (crosslinking schade meestal gegenereerd door ultraviolet (UV) schade) evenals GFP-NTH1 DNA-glycosylase die specifiek base schade herkent werden waargenomen. Daarnaast w...

Het doel van dit protocol is te beschrijven hoe laser microirradiation voor het opwekken van verschillende soorten DNA-beschadiging, met inbegrip van relatief eenvoudige strand einden en complexe schade, aan de studie van DNA schade signalering en reparatie factor montage op schade sites in vivo .

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Het algemene doel van dit protocol is om te beschrijven hoe laser-microbestraling kan worden gebruikt om verschillende typen DNA-schade op te wekken, waaronder enkelstrengsbreuken en complexe schade, om DNA-schadesignalering en de assemblage van reparatiefactoren in vivo te bestuderen. In de jaren 60 en 70 richtten we een laserstraal via een microscoop, die u achter mij ziet, waardoor we een klein gebied van een chromosoom konden beschadigen. De cel delde en overleefde, en we konden niet begrijpen waarom.Nou, 40 jaar later gebruiken we deze methode nu om selectief DNA-herstel te bestuderen, en dat is wat u vandaag zult zien. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van DNA-herstel, zoals hoe DNA-schade wordt herkend en verwerkt en hoe het schadesignaal zich in de cel verspreidt. Laser-microbestraling maakt real-time, hoge-resolutie analyse op enkelcelniveau mogelijk van macromoleculaire dynamiek als reactie op DNA-schade beperkt tot een gebied van enkele micrometers binnen de celkern.Verschillende lasercondities zijn echter gebruikt zonder rekening te houden met de verschillen in de veroorzaakte typen schade, wat leidde tot inconsistenties in cellulaire responsen, factorrekrutering en modificaties. Om fluorescentie-gelabelde eiwitten tot expressie te brengen in Hela-cellen, zaait u op dag één zes tot acht maal 10⁴ cellen in 0,5 ml cultuurmedium in één putje van een 24-wells plaat. Plaats de plaat vervolgens in de weefselkweekincubator.Voer op dag twee liposoom-gemedieerde DNA-transfectie uit door 0,3 micrograms van een mammaliaan expressieplasmid DNA dat codeert voor een fluorescentie-gelabelde DNA-reparatiefactor te verdunnen in 25 microliters serumvrij kweekmedium. Hier gebruiken we het damage site targeting domein van 53BP1 gefuseerd aan GFP voor dubbelstrengsbreuken, of DNA-glycosylase NTH1 gefuseerd aan GFP voor baseschade. Verdun in een andere 1,5 milliliter buis één microliter liposoom-gebaseerd DNA-transfectiereagens in 25 microliters serumvrij kweekmedium; meng vervolgens de inhoud van de twee buizen, het verdunde DNA en het transfectiereagens, en incubeer de buis gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om DNA-lipidecomplexen te vormen.Spoel de cellen eenmaal met 0,5 milliliters kweekmedium, verwijder vervolgens het medium en voeg 0,5 milliliters vers kweekmedium toe aan de cellen. Voeg de DNA-lipidecomplexen toe aan de cellen en meng deze voorzichtig door de plaat een paar keer te schudden. Plaats de cellen vervolgens terug in de incubator.Verwijder na vier tot zes uur het kweekmedium van de cellen en voeg 300 µL 0,5% Trypsin-EDTA toe. Verwijder de oplossing, voeg vervolgens 200 µL Trypsin-EDTA toe en incubeer de cellen gedurende drie tot vier minuten bij 37 °C. Nadat is bevestigd dat de cellen zijn losgekomen, worden 800 µL kweekmedium toegevoegd en worden de cellen geresuspendeerd door voorzichtig te pipetteren om celklonters op te breken.Overbreng de celsuspensie naar een kweekschaaltje van 35 millimeter met een gegridde dekglasplaat, en voeg kweekmedium toe tot een eindvolume van twee milliliters. Na 48 uur zullen de cellen een confluentie van 30 tot 60% hebben bereikt met expressie van het fluorescerende eiwit, en gereed zijn voor de inductie van laserschade. Zet de NIR-laser aan en laat het lasersysteem één uur opwarmen voor gebruik.Plaats een schaal met cellen op een op 37 °C verwarmde tafel in een kamer die controle van kooldioxide en vochtigheid mogelijk maakt. Gebruik voor live-cell analyse van fluorescent gelabelde eiwitten een olie-immersieobjectief met hoge vergroting en een geschikte fluorescentiefiltercombinatie, afhankelijk van het label. Zoek naar cellen met een vergelijkbare expressie van het fluorescerende eiwit.Vermijd cellen met een te zwakke of te sterke expressie om de cel-op-cel variabiliteit in fluorescentiemetingen te verminderen. Gebruik voor confocale microscopie een 100x 1.3 numerische apertuur olie-objectief en de software-bleachfunctie om lineaire tracks binnen de celkern te targeten. Stel het percentage lasertransmissie in op 5% zonder andere instellingen te wijzigen.Plaats vervolgens een cel in het midden van het beeldveld. Klik op het interessegebied en trek met de muis een lijn of een kader in de nucleus van ongeveer 50 bij vier pixels. Voorkom dat de kernmembraan of nucleoli worden geraakt.Klik vervolgens op de bleach-knop om DNA-schade te induceren. Hier is het verschil tussen de maximale rekrutering van GFP-53BP1 en GFP-NTH1 duidelijk zichtbaar. Voor het uitvoeren van een kwantitatieve fluorescentieanalyse van levende cellen met de confocale microscoop gebruikt u een 1x vergroting en een argonlaser voor GFP FITC.Stel een resolutie in van 512 x 512 pixels, een scansnelheid van vijf, en kies nummer één voor een snelle scan of twee plus voor middeling over meerdere scans om de signaal-ruisverhouding te verbeteren. Leg vervolgens de beelden vast. Teken de bleach ROY voor schade-inductie, selecteer dan het submenu Time Series van de verworven beelden, stel het aantal in op 20 en de cyclusvertraging op 30 seconden.Kies na de eerste scan eenmaal voor bleken en klik vervolgens op start B. In dit geval wordt het eerste beeld direct vóór de inductie van schade verkregen, gevolgd door de acquisitie van 19 aanvullende beelden met intervallen van 30 seconden. Hier is te zien dat GFP-NTH1 snel en tijdelijk wordt gerekruteerd naar de plaatsen van schade, terwijl GFP-53BP1 langzaam accumuleert en op de plaatsen van schade aanwezig blijft. Sommige herstelfactoren kunnen op een celcyclusspecifieke manier worden gerekruteerd naar de plaatsen van schade.Om cellen in de G1-fase te identificeren voor het induceren van schade, identificeer onder een omgekeerde microscoop, met een 10x objectief en 10x oculairs, metafasecellen die lichtjes opgeheven zijn en een afgeronde vorm hebben. Leg beelden vast om de positie van de metafasecellen op het rasterdekglas te registreren. Bevestig na drie tot vier uur of de celdeling heeft geresulteerd in twee dochtercellen die op de geregistreerde positie klaar zijn voor het induceren van schade.Om cellen in de SG2-fase voor te bereiden, wordt een dubbel thymidineblok-protocol gebruikt. Bevestig de synchronisatie-efficiëntie via DNA-profilering en/of detectie van Rad51 op beschadigingsplaatsen. Bij laserschade met een hoog ingangvermogen werden clustering van CPD UV-schade en GFP-NTH1 DNA-glycosylase, dat specifiek basisschade herkent, duidelijker waargenomen in vergelijking met een laag ingangvermogen.Daarnaast werden hogere niveaus van XRCC1 en CtIP waargenomen, wat het verhoogde aantal enkel- en dubbelstrengsbreuken weerspiegelt en dus aangeeft dat er complexe DNA-schade was geïnduceerd. Zoals hier aangetoond, leiden variaties in het ingangsvermogen van de laser tot veranderingen in de schade-signalering. PARP1 medieert poly ADP-ribosylering of PAR van doeleiwitten op beschadigde plaatsen, wat significant wordt geïnduceerd door een laser met een hoog ingangsvermogen, maar slechts zwak door een lage laserpower.53BP1 wordt gerekruteerd naar beschadigingsplaatsen met een laag, maar niet met een hoog ingangvermogen. Opvallend is dat de rekrutering naar beschadigingen met een laag ingangvermogen werd onderdrukt door de aanwezigheid van een tweede beschadiging met een hoog ingangvermogen in dezelfde celkern. Deze inhibitie werd opgeheven door de PARP-remmer.Omgekeerd versterkte de PARP-remmer die PAR afbreekt het PAR-signaal, en onderdrukte het effectief de rekrutering van 53BP1, zelfs op beschadigde plaatsen met een laag ingangvermogen. Dit geeft aan dat PARP-signalering, en niet de aard van de beschadiging an sich, de rekrutering van 53BP1 bepaalt. Dit is een voorbeeld waarin laser-titratie een differentiële activatie van PARP1 onthulde, die de hoeveelheid en complexiteit van de DNA-beschadiging meet en de toegankelijkheid van de beschadigde plaats reguleert.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer vijf dagen worden uitgevoerd, inclusief de celpreparatie, de configuratie van het lasersysteem, de inductie van DNA-schade, de beeldvorming van levende of immunosilente cellen en de data-analyse. Bij celsynchronisatie of een tijdskostenanalyse kan dit langer duren. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken dat de titratie van het laseringangvermogen na verloop van tijd kan afwijken, zelfs binnen hetzelfde lasersysteem, vooral na een heruitlijning van het systeem; daarom is het van belang om periodiek het rekruteringspatroon van de herstelfactor te controleren.Na deze procedure kunnen resultaten van andere methoden voor DNA-beschadiging, zoals het analyseren van bestraling, chemische middelen of de expressie van endonucleasen, worden uitgevoerd en vergeleken om te bevestigen dat de resultaten niet te wijten zijn aan laserspecifieke artefacten. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van DNA-herstel om de DNA-schaderespons met betrekking tot nucleair chromatine te onderzoeken, en om nieuwe factoren en routes van DNA-beschadiging, herkenning, verwerking en signalering te identificeren.

laser-microirradiation-to-study-vivo-cellular-responses-to-simple

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Lasers worden vaak gebruikt in studies van de cellulaire respons op DNA-schade. Echter, ze genereren lesies waarvan de afstand, frequentie en botsingen met replicatievorken worden zelden gekenmerkt. We beschrijven een benadering die de bepaling van deze parameters laser gelokaliseerde crosslinks tussen de strengen mogelijk maakt.

Single Molecule Analyse van de Laser Gelokaliseerde Psoralen Adducten

Laser microirradiation is een nuttig instrument voor onderzoek naar DNA-herstel in levende cellen. Een methodologische aanpak voor het gebruik van UVA lasers voor het opwekken van verschillende DNA laesies wordt weergegeven. We hebben een methode voor het lokale microirradiation die de normale celcyclus; onderhoudt geoptimaliseerd zo doorloop bestraalde cellen mitose.

Geavanceerde confocale microscopie technieken om te studeren van eiwit-eiwitinteractie en kinetiek op DNA laesies

Confocale fluorescentie microscopie en laser micro-bestraling aanbod tools voor inducerende DNA-beschadiging en het toezicht op de reactie van DNA reparatie eiwitten in geselecteerde sub nucleaire gebieden. Deze techniek is onze kennis van schade detectie, signalering en werving aanzienlijk vooruitgegaan. Dit manuscript toont deze technologieën te onderzoeken van een- en tweepersoonskamers strand break repair.

Toepassing van Laser-Micro-bestraling voor onderzoek van enkele en dubbele Strand Break Repair in zoogdiercellen

Een systeem voor het opwekken van laesies op de gedefinieerde regio sub nucleaire's vereist studeren DNA schade reparatie kinetiek. Beschrijven we een methode om gelokaliseerde double-stranded einden met behulp van een laser-scanner confocal microscoop uitgerust met een 405 nm laser maken en leveren van geautomatiseerde procedures om te kwantificeren van de dynamiek van reparatie factoren bij deze letsels.

Onderzoek van eiwit werving aan DNA laesies met behulp van 405 Nm Laser-Micro-bestraling

Dit protocol beschrijft een niet-invasieve methode om S-fase cellen efficiënt te identificeren voor downstream microscopiestudies, zoals het meten van DNA-reparatie eiwitrekrutering door lasermicrobestraling.

Laser micro-bestraling om DNA-rekrutering tijdens de S-fase te bestuderen

We beschrijven een robuuste gen vervangende strategie om de vuiligheid schimmel Ustilago maydis genetisch te manipuleren. Dit protocol wordt uitgelegd hoe u deletiemutanten genereren om infectie fenotypes onderzoeken. Kan worden uitgebreid tot genen in elke gewenste wijze, bijvoorbeeld wijzigen door toevoeging van een sequentie die codeert voor een fluorescerend eiwit tag.

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie

Gerichte DNA-schade kan worden bereikt door een DNA-beschadigend middel aan een triplex-vormend oligonucleotide (TFO) te koppelen. Met behulp van gemodificeerde TFO's kunnen DNA-schade-specifieke eiwitassociatie en DNA-topologiemodificatie in menselijke cellen worden bestudeerd door het gebruik van gemodificeerde chromatine-immunoprecipitatie-assays en DNA-superspiralisatie-assays zoals hier beschreven.

Tools om de rol van de Architectural eiwit HMGB1 Bestudeer in de verwerking van Helix vervormen, site-specifieke DNA InterStrand Crosslinks

Bestaande methoden voor het modificeren van planten hebben een beperkte toepasbaarheid. De nieuwe peptide-afgeleide technologie die hier wordt voorgesteld, belooft zowel eenvoud als efficiëntie in de introductie van exogeen eiwit of genen in de gewenste intracellulaire compartimenten van intacte planten.

-Peptide afgeleide methode om genen en eiwitten Across Cellulaire en organellen Barriers in Planten Transport

Hier presenteren we protocollen voor humane celcultuur om factoren voor translatie-initiatie te analyseren die zich binden aan de 5' dop van mRNA tijdens fysiologische zuurstofcondities. Deze methode maakt gebruik van een agarose-gekoppelde m7GTP dop-analogon en is geschikt om dop-bindende factoren en hun interacterende partners te onderzoeken.

Analyse van Cap-bindende eiwitten in menselijke cellen blootgesteld aan Physiological Oxygen Voorwaarden

Hier beschrijven we een chromatine immunoprecipitation (ChIP) en ChIP-seq de protocol van de voorbereiding van de bibliotheek voor het genereren van wereldwijde epigenomic profielen van lage-overvloed kip embryonale monsters.

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) Protocol voor lage-overvloed embryonale monsters

Leer laser microirradiatie om DNA-schade te induceren en celreacties in vivo te bestuderen. Deze methode maakt real-time analyse van reparatiefactor-dynamiek en schadeherkenning op hoge resolutie mogelijk.

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

Meer video's verkennen