Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

Het algemene doel van multi-foton tijdsverloop beeldvorming is om hoogwaardige driedimensionale realtime beelden van migrerende celpopulaties vast te leggen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals het in kaart brengen van migratieroutes van verschillende celpopulaties. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van traditionele confocale microscopie is dat multi-foton lasers een diepere weefselpenetratie hebben en minder fototoxiciteit.

Dit verhoogt de bruikbaarheid in dikker weefsel en maakt langere perioden van beeldacquisitie mogelijk. Om in te stellen voor embryo-collectie tussen 15:00 en 21:00 uur, verzamel kweektanks en vul ze met omgekeerd osmose, of RO water.

Breng maximaal drie vrouwtjes en drie mannetjes over naar tegenoverliggende kanten van de verdeelde tank. Verwijder de volgende ochtend de scheidingswand kort nadat de lichten in het vivarium aangaan. Laat ongestoord paren gedurende 20 minuten of totdat er voldoende aantallen embryo's zijn geproduceerd.

De embryo's zullen zich op de bodem van de kweektank bevinden. Wanneer eieren worden waargenomen, tilt u de binnentank met gleuven op samen met de vissen en plaatst u ze snel in een schone, solide buitentank gevuld met RO water. Gebruik een eierverzamelscherm om eieren uit de buitentank te verzamelen en breng de eieren over naar petrischalen met 30 milliliter 1X embryo medium.

Incubeer de verzamelde eieren bij 28,5 graden Celsius. Voor transgene embryo's, 24 uur na bevruchting of HPF, verwijder de dode eieren en beoordeel de ontwikkelingsstadium van de embryo's. Gebruik een pincet om de chorions te verwijderen van drie tot vier embryo's die GFP uitdrukken.

Onder een dissectiefluorescentie stereo microscoop met een standaard 460 tot 490 nanometer bandpass excitatiefilter, zoek naar GFP positieve embryo's. Breng deze embryo's over naar een aparte petrischaal met 30 milliliter vers 1X embryo medium. Na 20 HPF, plaats de gescreende en dechorionated GFP positieve embryo's in 0,003%PTU oplossing om pigmentatie te remmen.

Vermijd het initiëren van de behandeling eerder omdat dit nadelige effecten kan hebben op neurale crest en neuroepitheliale ontwikkeling. Voeg 0,4 gram LowMelt Agarose poeder toe aan 20mL van 1x embryo medium. Verhit de mix gedurende één tot twee minuten of tot de oplossing helder is en alle deeltjes zijn opgelost.

Pipetteer ongeveer 1mL van de Agarose oplossing in verse 1,5mL centrifugeerbuisjes voor opslag. Om de open badkamer in te stellen, plaats een kleine hoeveelheid hoog vacuüm vet op de basis van de open badkamer. Plaats een rond glazen deksel op de basis en schroef de bovenkant van de open badkamer op de basis totdat deze strak zit.

Pipetteer ongeveer 500-700 microliter 2%Agarose oplossing in de open badkamer totdat de basis ongeveer 3/4 gevuld is. Wacht 30 seconden om de Agarose lichtjes te laten afkoelen zonder volledig te polymeriseren en breng vervolgens een enkel embryo naar het midden van de basis. Gebruik onder een fluorescente stereo microscoop een 10 microliter micro pipettip om de embryo te oriënteren en in de buurt van de bodem van de Agarose te positioneren, zodat het niet weg drijft wanneer het embryo medium wordt toegevoegd.

Een kritische stap is om ervoor te zorgen dat het embryo correct in de Agarose is gepositioneerd. In deze experimenten, oriënteren we het embryo lateraal, maar het embryo kan ook worden gepositioneerd om te focussen op dorsale en ventrale gebieden. Monitor en herpositioneer het embryo totdat de Agarose is gestold.

Gebruik vervolgens een transferpipet om de geassembleerde open kamer volledig te vullen met tijdsverloop embryo medium. Nadat de hele set up op het podium van de microscoop is geplaatst, gebruikt u volgens het tekstprotocol de vijfmaal objectief om het embryo te lokaliseren. Vervolgens handmatig de stage naar de hoogste positie verhogen en gebruik de fijne focus om het embryo in het midden van het microscoopbereik te positioneren.

Verlaag de stage handmatig en verander het vijfmaal objectief naar het 25 maal water immersie objectief. Verhoog voorzichtig de stage om het embryo terug in focus te brengen. Klik in de software op de XYTZ modus voor het verkrijgen van meerdere beelden bij tijds- of T-intervallen in het XY vlak over een diepte van Z. Gebruik de epifluorescentie of heldere veldweergave om de focusdiepte in het gebied van belang te vinden, die de z-stack zal afbakenen.

Voor deze experimenten is de laterale rand van het oog het begin van de z-stack. Wanneer hierop wordt gefocust, klikt u in de software op de begin knop. Nadat u naar de middenlijn van het embryo, dat het einde van de z-stack is, hebt gefocust, klikt u op de eind knop.

Een kritische stap is ervoor te zorgen dat de Z stap het gebied van belang omvat. In ons geval willen we de breedte van het oog van de laterale naar de mediale randen vastleggen. Klik op het menu voor het aanpassen van de acquisitietijd en de beeldfrequentie.

Voor adequate herstel van de fluor4 en overleving van het embryo, zorg voor een verhouding van minimaal één tot drie tussen z-stack acquisitie wanneer laservermogen aan staat en hersteltijd wanneer laservermogen uit staat. Met voldoende tijd voor embryo herstel, stel de tijd tussen z-stacks in het aangewezen venster in. Stel vervolgens de totale duur van de experiment in het juiste venster in.

Schakel nu de live beeld instelling in om de laatste aanpassingen aan de laser instellingen te maken. Pas de lasertransmissie, versterking en offset schuifregelaars binnen de software aan om het fluorescentie beeld te optimaliseren. Pas ook de oriëntatie van het embryo aan zo nodig, afhankelijk van de lengte van het experiment, verwachte groei van het embryo, enzovoort.

Zorg ervoor dat het gebied van belang gedurende de duur van het experiment binnen het frame blijft. Tijdens tijdsverloop acquisitie, zet de epifluorescentie lichtbron uit, bedek de stage met de laser veiligheidsdoos die voldoende is voor bescherming tegen achtergrond