Name: Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Leer multi-foton time-lapse imaging om neurale kamcelmigratie in zebrafishembryo's te visualiseren. Deze techniek biedt diepere weefselpenetratie en minder fototoxiciteit dan confocale microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Thomas Schilling voor het vriendelijk gifting de GS (sox10:eGFP)-fish and Mary Halloran voor het vriendelijk gifting de vis GS(foxd3:GFP) .

Het hier beschreven protocol werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor de humane behandeling van laboratoriumdieren die zijn vastgesteld door het University of Michigan Committee on the Use and Care of Animals (UCUCA).
1. Embryo Collectie voor Time-lapse Beeldvorming
<ol>
	<li>Tussen 15:00 en 21:00 uur, zet mannelijke en vrouwelijke volwassen Tg(sox10:EGFP) of Tg(foxd3:GFP) transgene zebravissen in een verdeelde kweektank voor paarsgewijze paring.
	 
	OPMERKING: De Tg(sox10:EGFP) en Tg(foxd3:GFP) vissen, vriendelijk geschonken door Thomas Schilling en Mary Halloran, respectievelijk, werden gekruist in de Casper (roy -/-, nacre -/-) achtergrond om auto-fluorescentie en interferentie met pigmentatie te verminderen.
	<ol>
		<li>Assembleer de kweektank (gegroefde binnentank + massieve buitentank) en vul deze met omgekeerd osmose (RO) systeem water.</li>
		<li>Breng maximaal 3 vrouwtjes en 3 mannetjes over in tegenoverliggende kanten van de tank gescheiden door een scheidingswand; maximaal 6 vissen kunnen paarsgewijs worden gekweekt in een enkele kweektank.</li>
		<li>De volgende ochtend, verwijder de scheidingswand kort nadat de lichten in het vivarium zijn ingeschakeld.
		 
		OPMERKING: In de huidige studie zijn de lichten aan op een cyclus van 14 uur licht (aan om 9:00 uur) en 10 uur donker (uit om 23:00 uur).</li>
		<li>Sta 20 minuten ongestoorde paring toe of totdat voldoende aantallen embryo's zijn geproduceerd; de embryo's zullen zich aan de onderkant van de kweektank bevinden. Wanneer eieren worden waargenomen, til de gegroefde binnentank samen met de vissen op en plaats ze (vissen en binnentank) snel in een schone massieve buitentank gevuld met RO-water.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bereid standaard 1X embryo medium voor door per 1 L RO-water het volgende toe te voegen: 0,287 g (4,9 mM) NaCl, 0,127 g (0,17 mM) KCl, 0,048 g (0,33 mM) CaCl2.2H2O, 0,04 g (0,33 mM) MgSO4 (watervrij). Roer de oplossing tot de zouten volledig zijn opgelost.</li>
	<ol>
		<li>Voeg 100 µL van 0,1% methyleenblauw toe als fungicide. Voeg 0,25 g natriumbicarbonaat toe om de pH op 7,75 aan te passen. Bewaar het medium bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Verzamel eieren uit de buitentank met behulp van een eierverzamelscherm en breng de eieren over naar petrischalen (~50 embryo's per schotel) met 30 mL 1X embryo medium. Bewaar de verzamelde eieren bij 28,5 °C.</li>
	<li>Embryo voorbereiding
	<ol>
		<li>Tg(sox10:EGFP) embryo's.
		<ol>
			<li>Voor Tg(sox10:EGFP) embryo's, verwijder bij 12 uur post-fertilisatie (hpf) de dode eieren en beoordeel de ontwikkelingsfase van de embryo's. Selecteer GFP-positieve embryo's met behulp van een disserterende fluorescente stereomicroscoop met een standaard 460-490 nm bandpass excitatiefilter. Verwijder met behulp van een pincet de chorion uit 3-4 embryo's die GFP uitdrukken, en breng deze embryo's over naar een aparte petrischaal met 30 mL vers 1X embryo medium.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tg(foxd3:GFP) embryo's.
		<ol>
			<li>Voor Tg(foxd3:GFP) embryo's, verwijder bij 22-24 hpf de dode eieren en beoordeel de ontwikkelingsfase van de embryo's. Selecteer positieve embryo's met behulp van een disserterende fluorescente stereomicroscoop met een standaard 460-490 nm bandpass excitatiefilter. Verwijder met behulp van een pincet het chorion uit 3-4 embryo's die GFP uitdrukken.</li>
			<li>Bereid 1000X Fenylthioureum (PTU) stamoplossing door 0,75 g (3%) PTU op te lossen in 25 mL Dimethylsulfoxide (DMSO). Verdeel de stamoplossing in porties en bewaar deze bij 4 °C. Voeg 30 µL van 1000X PTU (3%) stamoplossing toe aan 30 mL 1X embryo medium om een 0,003% PTU oplossing te genereren.</li>
			<li>Plaats de gescreende en gedechorioneerde GFP-positieve embryo's in een 0,003% PTU oplossing om pigmentatie te remmen. Begin de behandeling van de embryo's met PTU niet eerder dan 20 hpf, omdat vroege behandeling (bij < 20 hpf) nadelige effecten kan hebben op de ontwikkeling van de neurale crest en het neuroepitheel.28</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Voordat het time-lapse experiment wordt uitgevoerd, bewaak de embryo's door live imaging met behulp van een standaard stereomicroscoop met intervallen van 12-24 uur in leeftijdsgematchte vergelijkingen als controle voor temperatuurdrift.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Montage van Embryo voor Time-lapse Beeldvorming
<ol>
	<li>Voorbereiding van time-lapse embryo medium
	<ol>
		<li>Bereid een standaard 0,4% tricaine stamoplossing door 0,004 g tricaine toe te voegen aan 100 mL RO-water. Verdeel (~1 mL) de stamoplossing in verse 1,5-mL centrifugeerbuisjes en bewaar bij -20 °C.</li>
		<li>Bereid time-lapse embryo medium (50 mL 1X embryo medium, 0,016% tricaine) door 2 mL 0,4% tricaine oplossing toe te voegen aan 48 mL 1X embryo medium. Als er gebruik wordt gemaakt van embryo's >22 hpf, voeg dan ook 50 µL 3% PTU stamoplossing toe aan het embryo medium (eindconcentratie 0,003% PTU).</li>
	</ol>
	</li>
	<li><

<ol><li>Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+steps+in+neural+crest+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Early steps in neural crest specification.</a> Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).</li>
<li>Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+maps+of+neural+crest+and+mesoderm+in+the+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).</li>
<li>Minoux, M., Rijli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+cranial+neural+crest+cell+migration+and+patterning+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development.</a> Development. 137, 2605-2621 (2010).</li>
<li>Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+neural+crest+cell+formation+and+migration+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos.</a> Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).</li>
<li>Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+avian+ocular+and+periocular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Origins of avian ocular and periocular tissues.</a> Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+and+retinoic+acid+interact+to+regulate+zebrafish+craniofacial+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development.</a> Dev Biol. 373, 300-309 (2013).</li>
<li>Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+and+pitx2+regulate+early+neural+crest+survival+and+migration+in+craniofacial+and+ocular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+B+Dev+Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development.</a> Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).</li>
<li>Trainor, P. A., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+paraxial+mesoderm+and+neural+crest+cells+of+the+mouse+embryo-codistribution+in+the+craniofacial+mesenchyme+but+distinct+segregation+in+branchial+arches%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches.</a> Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).</li>
<li>Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox+proteins+and+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sox proteins and neural crest development.</a> Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).</li>
<li>Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+network+during+neural+crest+induction%3A+from+cell+specification+to+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival.</a> Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).</li>
<li>Dressler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+and+craniofacial+anomalies+associated+wth+Axenfeld-Rieger+syndrome+with+PITX2+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Case+Report+Med%22%5BJournal%5D)">Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation.</a> Case Report Med. , 621984(2010).</li>
<li>Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalies+associated+with+Axenfeld-Rieger+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).</li>
<li>Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype-phenotype+correlations+in+Axenfeld-Rieger+malformation+and+glaucoma+patients+with+FOXC1+and+PITX2+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).</li>
<li>Tumer, Z., Bach-Holm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenfeld-Rieger+syndrome+and+spectrum+of+Pitx2+and+Foxc1+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations.</a> Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).</li>
<li>Schoner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrocephalus%2C+agenesis+of+the+corpus+callosum%2C+and+cleft+lip%2Fpalate+represent+frequent+associations+in+fetuses+with+Peters+plus+syndrome+and+B3GALTL+mutations.+Fetal+PPS+phenotypes%2C+expanded+by+Dandy+Walker+cyst+and+encephalocele%5BTitle%5D)+AND+%22Prenat+Diagn%22%5BJournal%5D)">Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele.</a> Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).</li>
<li>Aliferis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+nonsense+B3GALTL+mutation+confirms+Peters+plus+syndrome+in+a+patient+with+multiple+malformations+and+Peters+anomaly%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly.</a> Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).</li>
<li>Lesnik Oberstein,, S, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peters+Plus+syndrome+is+caused+by+mutations+in+B3GALTL%2C+a+putative+glycosyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase.</a> Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).</li>
<li>Brittijn, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+development+and+regeneration%3A+new+tools+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research.</a> Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+model+of+Axenfeld-Rieger+Syndrome+reveals+that+pitx2+regulation+by+retinoic+acid+is+essential+for+ocular+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).</li>
<li>Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyp1b1+regulates+ocular+fissure+closure+through+a+retinoic+acid-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).</li>
<li>Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxd3+controls+melanophore+specification+in+the+zebrafish+neual+crest+by+regulation+of+Mitf%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf.</a> Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).</li>
<li>Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morpholino+phenocopy+of+the+colourless+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A morpholino phenocopy of the colourless mutant.</a> Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).</li>
<li>Dutton, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+colourless+encodes+sox10+and+specifies+non-ectomesenchymal+neural+crest+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates.</a> Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).</li>
<li>Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-derived+glia+ensheath+peripheral+nerves+and+mediate+motor+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development.</a> Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16299478">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Denk, W., Delaney, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+functional+imaging+of+neurons+using+2-photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy.</a> J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0022991">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling.</a> PLoS ONE. 6, e22991(2011).</li>
<li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+craniofacial+development+in+the+sox10%3Akaede+transgenic+zebrafish+line+using+time-lapse+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (79), e50525(2013).</li>
<li>Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+microscopy+of+the+developing+mouse+embryonic+yolk+sac+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature.</a> Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).</li>
<li>McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+craniofacial+morphogenesis+in+zebrafish+using+4D+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (83), e51190(2014).</li>
<li>Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mouse+development+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).</li>
</ol>

Dit werk werd financieel ondersteund door middel van subsidies uit het nationale Instituut van het oog van het National Institutes of Health (K08EY022912-01) en de visie onderzoek kern (P30 EY007003).

Multi foton time-lapse imaging kunt het volgen in vivo van voorbijgaande aard en trekvogels cel populaties. Deze krachtige techniek kan worden gebruikt om embryonale processen in real-time te bestuderen, en in de huidige studie, de resultaten van deze methode de huidige kennis van neurale crest cel migratie en ontwikkeling verbeterd. Eerdere time-lapse imaging studies gebruiken meestal confocale laser scanning microscopie. 29 , 30 , <sup class...

Erfelijke oogziekten jeugd blindheid kunnen veroorzaken en zijn vaak te wijten aan afwijkingen van de craniale neurale crest. Neurale kamcellen zijn voorbijgaande stamcellen die voortvloeien uit de neurale buis en vormen van talrijke weefsels in het lichaam. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 neurale kamcellen, afgeleid van het prosencephalon en mesencephalon, aanleiding geven tot de botten en het kraakbeen van de midface en frontale regio's, en de iris, hoornvlies trabecular gevlochten en sclera in het anterieure segment van het oog. 4 , 6 , 7 , 8 neurale kamcellen uit de rhombencephalon vorm die de faryngaal bogen, kaak en cardiale uitstroom tractus. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 studies hebben gewezen op de bijdrage van de neurale crest aan oogbeschadigingen en/of en periocular ontwikkelen, wijzend op het belang van deze cellen in gewervelde oog ontwikkeling. Immers, verstoring van neurale crest cel migratie en differentiatie leiden tot craniofaciale en oogbeschadigingen en/of afwijkingen zoals waargenomen in Axenfeld-Rieger syndroom en Peters Plus syndroom. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 zo een grondig inzicht in de migratie, de proliferatie en differentiatie van deze neurale kamcellen geven inzicht in de complexiteit ten grondslag liggen aan erfelijke oogziekten.
De zebravis is een krachtige modelorganisme voor het bestuderen van oogbeschadigingen en/of ontwikkeling, zoals de structuren van de zebravis oog vergelijkbaar met hun tegenhangers van zoogdieren zijn, en vele genen zijn evolutionair bewaard tussen zebravis en zoogdieren. 18 , 19 , 20 voorts zebrafish embryo's zijn transparant en een zoutwatervis, vergemakkelijkt de visualisatie van oog ontwikkeling in real-time.
Uitbreiding op de eerder gepubliceerde werk,6,7,20 de trekkende patroon van neurale kamcellen werd beschreven met behulp van meerdere foton fluorescentie time-lapse imaging op transgene zebrafish lijnen gemarkeerd met groen fluorescente proteïne (GFP) onder de Transcriptionele controle van het SRY (seks-bepalen regio Y)-vak 10 (sox10) of Forkhead vak D3 (foxd3) gen regelgevende regio's. 21 , 22 , 23 , 24. multi photon fluorescentie time-lapse imaging is een krachtige techniek die combineert de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie om hoge resolutie, drie-dimensionale beelden van specimens gelabeld met fluorophores te vangen. 25 , 26 , 27 het gebruik van de multi photon laser heeft duidelijke voordelen boven standaard confocale microscopie, waaronder verhoogde weefsel penetratie en verminderde fluorophore bleken.
Met behulp van deze methode, waren twee verschillende populaties van neurale kamcellen variërend in timing van de migratie en migratiestromen trajecten gediscrimineerde, namelijk foxd3-positieve neurale kamcellen in de periocular mesenchym en het derde oog- en sox10-positieve neurale kamcellen in de craniofaciale mesenchym. Met deze methode wordt een benadering van de migratie van oculaire en craniofaciale neurale crest migratie in zebrafish visualiseren ingevoerd, waardoor het gemakkelijk is om te observeren gereglementeerde neurale crest migratie in real-time tijdens de ontwikkeling.
Dit protocol biedt informatie voor het genereren van time-lapse video's tijdens de vroege ontwikkeling van de oog in GS (sox10:EGFP) en de transgene zebrafish GS (foxd3:GFP), als voorbeeld. Dit protocol kan verder worden toegepast voor de hoge resolutie, drie-dimensionale, real-time visualisatie van de vroege ontwikkeling van een structuur van het oogbeschadigingen en/of en craniofaciale afgeleid van neurale kamcellen in zebrafish. Bovendien kan deze methode verder worden toegepast voor de visualisatie van de ontwikkeling van andere weefsels en organen in de zebravis en andere diermodellen.

<table><tbody><tr><td>Breeding Tanks with Dividers</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td>Kruising Tank Set (1.0-liter) Helder Polycarbonaat met Deksel en Inzet</td></tr><tr><td>M205 FA Combi-Scope</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td>Stereofluorescentie Microscoop - FusionOptics en TripleBeam</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Millipore (EMD)</td><td>7760-5KG</td><td>Dubbel PE zak. CAS Nr. 7647-14-5, EC Nummer 231-598-3</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Millipore (EMD)</td><td>1049380500</td><td>Kaliumchloride 99.999 Suprapur. CAS Nr. 7447-40-7, EC Nummer 231-211-8.</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Poly fles; 500 g. CAS Nr. 10035-04-8</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate (Anhydrous)</td><td>Millipore (EMD)</td><td>MX0075-1</td><td>Poly fles; 500 g. CAS Nr. 7487-88-9, EC Nummer 231-298-2</td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Millipore (EMD)</td><td>284-12</td><td>Glasmaatje; 25 g. Poeder, Gecertificeerde Biologische Kleurstof</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Millipore (EMD)</td><td>SX0320-1</td><td>Poly fles; 500 g. Poeder, GR ACS. CAS Nr. 144-55-8, EC Nummer 205-633-8</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>>98%. CAS Nummer 103-85-5, EC Nummer 203-151-2</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D8418-500ML</td><td>Moleculair Biologie kwaliteit. CAS Nummer 67-68-5, EC Nummer 200-664-3</td></tr><tr><td>Tricaine Methanesulfonate</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>MS222</td><td>Tricaine-S</td></tr><tr><td>Low-Melt Agarose</td><td>ISC Bioexpress</td><td>E-3112-25</td><td>GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g</td></tr><tr><td>Open Bath Chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40HP</td><td>High Profile</td></tr><tr><td>Glass Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>Cirkel dekglas. 25 mm diameter</td></tr><tr><td>High Vacuum Grease</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5C</td><td>2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832</td></tr><tr><td>Quick Exchange Platform</td><td>Warner Instruments</td><td>QE-1</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>Stage Adapter</td><td>Warner Instruments</td><td>SA-20LZ-AL</td><td>16.5 x 10 cm</td></tr><tr><td>TC SP5 MP multi-photon microscope</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser</td><td>SpectraPhysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Safety Box</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)&nbsp; Software</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMovie Version 10.1.4 Software</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multi foton time lapse imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in zebrafish embryo's

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Aangeboren oog- en craniofaciale afwijkingen weerspiegelen verstoringen in de neurale crest, een voorbijgaande bevolking van trekkende stamcellen die aanleiding tot talrijke celtypes in het lichaam geven. Inzicht in de biologie van de neurale crest is beperkt, als gevolg van een gebrek aan genetisch hanteerbare modellen die bestudeerd in vivo worden kunnen en in real-time. Zebravis is een bijzonder belangrijk developmental model voor het bestuderen van de trekkende cel populaties, zoals de neurale crest. Onderzoek naar neurale crest migratie naar het derde oog, werd een combinatie van de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie uitgevoerd om vast te leggen met een hoge resolutie, drie-dimensionale, real-time video's van het derde oog in transgene zebrafish embryo's, namelijk GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP), zoals sox10 en foxd3 zijn aangetoond in talloze dierlijke modellen om te reguleren van vroege crest van de neurale differentiatie en waarschijnlijk vertegenwoordigen markers voor neurale kamcellen. Multi foton time-lapse imaging werd gebruikt om te onderscheiden van het gedrag en de migratiepatronen van twee neurale crest cel populaties bij te dragen tot de vroege ontwikkeling van het oog. Dit protocol biedt informatie voor het genereren van time-lapse video's tijdens de zebravis neurale crest migratie als een voorbeeld, en verder kan worden toegepast om te visualiseren van de vroege ontwikkeling van vele structuren in de zebravis en andere modelorganismen.

Multi foton fluorescentie time-lapse imaging gegenereerd een aantal video's dat geopenbaard de migratiepatronen van craniale neurale kamcellen die aanleiding tot de craniofaciale structuren en anterieure segment van het oog in de GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP) zebrafish lijnen geven. Als voorbeeld migreren sox10 -positieve neurale kamcellen tussen 12 en 30 hpf vanaf de rand van de neurale buis in de craniofaciale regio (Video 1, <strong clas...

Een combinatie van de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie werd uitgevoerd om vast te leggen van real-time, hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van neurale crest migratie in GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP) zebrafish embryo's.

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Het algemene doel van multi-foton time-lapse imaging is het vastleggen van driedimensionale realtime beelden met een hoge resolutie van migrerende celpopulaties. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals het in kaart brengen van migratiepaden van verschillende celpopulaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van traditionele confocale microscopie is dat multi-foton lasers een diepere weefselpenetratie hebben en een verminderde fototoxiciteit vertonen.Dit verhoogt de bruikbaarheid in dikkere weefsels en maakt langere perioden van beeldacquisitie mogelijk. Om de embryo-collectie tussen 15:00 en 21:00 uur voor te bereiden, stelt u de kweekbassins samen en vult u deze met omgekeerde osmosewater, of RO-water.Verplaats maximaal drie vrouwtjes en drie mannetjes naar tegenovergestelde zijden van de verdeelde tank. Verwijder de volgende ochtend de scheidingswand kort nadat de lichten in het vivarium zijn aangegaan. Laat de dieren 20 minuten lang ongestoord paren, of tot er voldoende embryo's zijn geproduceerd.De embryo's bevinden zich onderin het kweekvat. Wanneer er eitjes worden waargenomen, tilt u de geperforeer

multi-photon-time-lapse-imaging-to-visualize-development-real-time

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

In deze video worden de technieken voor multicolor confocale time-lapse imaging en gerichte cel ablatie verstrekt. Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van meerdere celtypen van belang te...

Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation

De huidige video toont een methode die gebruik maakt van de combinatie van elektroporatie en confocale microscopie te leven imaging op individuele neurale stamcellen uit te voeren in de zich ontwikkelende zebravis voorhersenen.

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Source: Williams, A. L., et al. Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (2017)This video showcases a multi-photon time-lapse imaging protocol to visualize the migration of neural crest cells in a zebrafish embryo in real-time with high resolution.

Visualizing Neural Crest Cell Migration in a Zebrafish Embryo Using Multi-Photon Time Lapse Imaging

Visualisatie van experimentele gegevens is uitgegroeid tot een belangrijk element in de presentatie van de resultaten aan de wetenschappelijke gemeenschap. Generatie van de live time-lapse opname van groeiende embryo draagt ​​bij aan een betere presentatie en begrip van complexe ontwikkelingsprocessen. Dit protocol is een stap-voor-stap handleiding voor cel etikettering via photoconversion van kaede eiwit in de zebravis.

Visualisatie van craniofaciale ontwikkeling in de SOX10: kaede transgene zebravis Line Met behulp van Time-lapse confocale microscopie

Time-lapse confocale beeldvorming is een techniek nuttig voor het karakteriseren van embryonale ontwikkeling. Hier beschrijven we de methode karakteriseren craniofaciale morfogenese in wildtype en PDGFRA, Smad5 en SMO mutant embryo's.

Het analyseren Craniofacial Morphogenesis in zebravis behulp 4D confocale microscopie

Hier presenteren we een veelzijdige montagemethode die langetermijn tijds-gelaps beeldvorming mogelijk maakt van de ontwikkeling van het achterste lichaam van levende zebravisembryo's zonder de normale ontwikkeling te verstoren.

Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

In vivo imaging is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het zenuwstelsel te onderzoeken. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen in real time te visualiseren binnen het zich ontwikkelende zebraviszenuwstelsel.

Visualiseren van de zich ontwikkelende hersenen in levende zebravissen met behulp van Brainbow en Time-lapse Confocalimaging

Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.

4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

Hier wordt een protocol verstrekt voor time-lapse beeldvorming van oculaire morfogenese met behulp van een commercieel beschikbare lightsheet-microscoop en een beeldverwerkingswerkstation om de resulterende gegevens te analyseren. Dit protocol beschrijft de procedures voor embryo-anesthesie, inbedding in agarose bij lage smelttemperatuur, suspensie in de beeldvormingskamer, het instellen van de beeldvormingsparameters en ten slotte het analyseren van de beeldvormingsgegevens met behulp van...

Oculaire morfogenese visualiseren door Lightsheet Microscopie met behulp van rx3:GFP Transgene Zebravis

We demonstreren een methode die gebruik maakt van snelle confocale scanscopie om live beeldvorming uit te voeren van microgliacellen in het zich ontwikkelende optische tectum van zebravissen, waardoor de dynamiek van deze cellen in vivo kan worden geanalyseerd.

Live beeldvorming en karakterisering van de dynamiek van microglia in het zebravisembryo

Leer multi-foton time-lapse imaging om neurale kamcelmigratie in zebrafishembryo's te visualiseren. Deze techniek biedt diepere weefselpenetratie en minder fototoxiciteit dan confocale microscopie.

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryos (Video) | JoVE Journal

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

Meer video's verkennen