Oprichting van een dichte Transposon invoeging bibliotheek met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw in de Enterobacterial stammen zoals Escherichia Coli of Shigella flexneri
September 23rd, 2017
Hier is een eenvoudige methode voor het maken van een bibliotheek van high-density transposon invoeging in Escherichia coli of Shigella flexneri met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw. Dit protocol kan de oprichting van een verzameling van honderden duizenden van unieke mutanten in bacteriën door de willekeurige genomic invoeging van een transposon.
Het algemene doel van deze experimentele procedure is om een transposon-insertiebibliotheek met hoge dichtheid te creëren in Escherichia coli of Shigella flexneri met behulp van bacteriële conjugatie. Deze techniek maakt de creatie mogelijk van honderdduizenden unieke bacteriële mutanten door de willekeurige genomische insertie van een Tn10-transposon. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de overdracht van het plasma dat het transposon bevat, gebeurt via bacteriële conjugatie in plaats van andere minder efficiënte methoden, zoals elektroporatie.
Bovendien voegt de Tn10-transposon zichzelf in in het genoom met minder vooringenomenheid dan andere transposons. Gebruik steriele techniek om een milliliter overnachtelijke cultuur van de donorstammen toe te voegen aan een steriele eppendorfbuis. De buis moet bijvoorbeeld worden gelabeld met een D, voor donor.
Doe hetzelfde voor de ontvangende stam door een milliliter overnachtelijke cultuur van de ontvangende stam in een steriele eppendorfbuis te verwijderen. Opnieuw bijvoorbeeld, gelabeld met R, voor ontvanger. Centrifugeer beide buizen gedurende één minuut bij 14.000 keer G bij kamertemperatuur.
Dit kan worden gedaan in een tafelcentrifuge. Terwijl de centrifuge draait, bereid de filters voor voor conjugatie. Gebruik steriele pincetten om een nitrocellulosefilter op een gelabelde LB-agarplaat te plaatsen die geen antibiotica bevat.
Alternatief kan in plaats van nitrocellulosefilter, steriele veegpapier worden gebruikt. Plaats elk filter op een afzonderlijke LB-agarplaat om besmetting te minimaliseren. Zorg ervoor dat elk filter op een LB-agarplaat wordt geplaatst die op de juiste manier is gelabeld.
Maak drie platen, elk met een filter. Een voor de donor-stam, een voor de ontvangende stam en een voor de bibliotheek. Zodra de centrifuge klaar is, verwijder de overnachtelijke culturen.
Verwijder al het groeimedium dat antibiotica bevat uit de eppendorfbuis en gooi het weg. Zorg ervoor dat u de bacteriecelpallet niet verstoort of verstoort, maar probeer al het groeimedium te verwijderen. Zorg ervoor dat u asseptisch werkt en tips verwisselt tussen elke steekproef.
Voeg aan elke eppendorfbuis 110 microliter verse LB-media zonder antibiotica toe en pipet op en neer om de cultuur te resuspenderen. Zorg ervoor dat u asseptisch werkt. Door meerdere keren op en neer te pipetten om ervoor te zorgen dat er geen celklompjes achterblijven.
Deze stap wordt gedaan om de bacteriecultuur te concentreren en eventuele antibiotica die over zijn gebleven van de overnachtelijke cultuur te verwijderen. Gebruik een pipet om 50 microliter van de geconcentreerde donorcultuur op het filter te plaatsen dat is gelabeld Donor. Voeg de 50 microliter langzaam in druppels toe aan het filter.
Doe hetzelfde voor de ontvangende stam door 50 microliter van de resuspendeerde cultuur, de geconcentreerde resuspendeerde cultuur in druppels toe te voegen aan het ontvangende filter. Voor de conjugatie om te plaatsen, worden zowel de ontvangende stam als de donor-stam toegevoegd aan hetzelfde filterpapier, zodat ze in nauwe fysieke contact zijn. Om dit te doen, voeg 50 microliter van zowel de donor-stam als de ontvangende stam toe aan hetzelfde filter op de plaat gelabeld bibliotheek.
Plaats deze agarplaten met de filters bij 37 graden gedurende zes uur. Het proces van conjugatie vindt plaats over zes uur bij 37 graden Celsius. Tijdens de conjugatie beweegt het pJA1-plasmine naar de ontvangende stam.
Na de conjugatie worden de bacteriën losgemaakt van het filter door te vortexen en geïnduceerd met één millimolair IPTG. IPTG induceert de transposase en het transposon dat het gen voor kanamycine-resistentie bevat, wordt willekeurig in het genoom van de ontvangende stam ingebracht. Bacteriën worden geplaatst op LB-agarplaten met kanamycine en een ander antibioticum om de ontvangende stam met het transposon te selecteren.
De ontvangende stam is Lambda pir negatief, dus het pJA1-plasmine gaat verloren. Na zes uur groei bij 37 graden Celsius is de conjugatie voltooid. Verwijder de platen met de filters uit de incubator.
Gebruik steriele pincetten om het filter met de negatieve donorcontrole van de LB-agarplaat te verwijderen. Tik op de buis om het filterpapier naar de bodem van de conische fles te laten zakken en zorg ervoor dat het filter volledig is ondergedompeld in het LB-medium. Deze buis bevat twee milliliter LB-medium met IPTG en een uiteindelijke concentratie van één millimolair.
Vortex de buis gedurende één minuut om de bacteriën los te maken van het nitrocellulosefilter. Het LB-medium zou troebel moeten worden met bacteriecellen. Herhaal dit ook voor de ontvangende controle en de bibliotheek.
Nadat de filters met de bacteriecellen grondig zijn gevormd om de bacteriën los te maken van het filter, worden de bacteriecellen op geselecteerde media geplaatst. Bij deze stap worden bacteriën geplaatst op LB-agarplaten met kanamycine en een ander antibioticum zoals nalidixinezuur. Kanamycine wordt gebruikt om ontvangende cellen te selecteren die het transposon met het kanamycineresistentiemarkeringsgen met succes in het genoom zijn geïntegreerd.
Ontvangende cellen waarin de markering niet in het genoom is geïntegreerd, worden tegengeselecteerd. Een ander antibioticum zoals nalidixinezuur wordt gebruikt om tegen de donor-stam te selecteren. De donor-stam die hier wordt gebruikt, is gevoelig voor nalidixinezuur, terwijl de ontvangende stam resistent is tegen nalidixinezuur.
Met behulp van dit tweede antibioticum is het mogelijk om de donor-stam te verwijderen. Bij deze stap moeten verschillende verdunningsgradiënten worden geplaatst om een verdunning van de bibliotheek te bepalen die veel kolonies oplevert die voldoende zijn uitgerust. Na het tellen en vastleggen van het aantal kolonies op alle platen met de transposonbibliotheek, willen sommige gebruikers de bibliotheek poolen of combineren in één buis.
Dit kan worden gedaan met behulp van een steriele verspreider. Voeg een milliliter LB-medium toe aan de LB-agarplaat met de transposonbibliotheek. Zodra het medium
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het creëren van een transposon-insertiebibliotheek met hoge dichtheid in Escherichia coli of Shigella flexneri via bacteriële conjugatie. Het protocol maakt de generatie van honderdduizenden unieke bacteriële mutanten mogelijk via willekeurige genomische insertie van een transposon.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Genetica
- Transposonbiologie
Achtergrond
- Transposon-insertiebibliotheken zijn waardevol voor het bestuderen van genfunctie.
- Bacteriële conjugatie is een efficiëntere methode voor het overbrengen van genetisch materiaal vergeleken met elektroporatie.
- De Tn10 transposon heeft een lagere insertiebias dan andere transposons.
- Deze methode maakt de creatie van een diverse mutantenbibliotheek mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor het genereren van een transposon-insertiebibliotheek.
- Om de efficiëntie van mutantengeneratie in bacteriestammen te verbeteren.
- Om genetisch onderzoek in Escherichia coli en Shigella flexneri te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van donor- en receptorbacterieculturen.
- Gebruik van nitrocellulosefilters voor bacteriële conjugatie.
- Inductie van transposase met IPTG voor transposon-insertie.
- Selectie van mutanten met behulp van antibiotica voor resistentiemarkers.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle creatie van een transposon-insertiebibliotheek met hoge dichtheid.
- Identificatie van unieke bacteriële mutanten met kanamycine-resistentie.
- Demonstratie van de efficiëntie van bacteriële conjugatie voor genetische overdracht.
- Validatie van de methode door kolonietelling en selectie.
Conclusies
- Het protocol genereert effectief een diverse bibliotheek van mutanten.
- Bacteriële conjugatie is een superieure methode voor transposon-insertie.
- Deze aanpak kan worden toegepast op verschillende studies in microbiële genetica.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Dense transposon insertion libraries generated via bacterial conjugation enable systematic gene disruption and high-throughput functional genomics in enterobacterial strains. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by providing comprehensive mutant resources for pathway interrogation. The approach enhances predictive confidence and portfolio triage in antimicrobial and bacterial pathogenesis research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables genome-wide interrogation of gene function through random mutagenesis.
- Supports identification of essential genes and genetic interaction networks.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing non-essential and fitness-related loci.
- Provides a scalable platform for hypothesis-driven target validation.
Screening & Assay Development
- Generates validated mutant libraries for robust forward genetic screens.
- Delivers reproducible and quantitative outputs for downstream Tn-Seq analysis.
- Standardizes mutant resource preparation for cross-study comparability.
- Enables high-throughput screening of compound or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant bacterial models for translational biomarker discovery.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation of antimicrobial targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on genetic essentiality data.
- Provides predictive insights into bacterial fitness and virulence determinants.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational mutant resources for functional genomics and target prioritization workflows.
- Discovery Biology: Systematically disrupts genes to clarify pathways and de-risk biological mechanisms.
- Screening: Supplies high-density, reproducible mutant libraries for scalable screening platforms.
- Analytics: Enables quantitative mapping of gene essentiality and interaction networks via Tn-Seq.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical bacterial models for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable mutant resource for ongoing and future R&D initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and cost-effective mutant library generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by enabling robust genetic screens.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antimicrobial and bacterial pathogenesis programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial genetics and sterile technique.
- Needs access to standard microbiology instrumentation and selective media.
- Demands cross-team standardization for library pooling and downstream analytics.
- Adaptation may be necessary for non-enterobacterial strains or alternative model systems.
- Library density and insertional randomness should be validated for each application.
