Oprichting van een dichte Transposon invoeging bibliotheek met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw in de Enterobacterial stammen zoals Escherichia Coli of Shigella flexneri
23 september 2017
Hier is een eenvoudige methode voor het maken van een bibliotheek van high-density transposon invoeging in Escherichia coli of Shigella flexneri met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw. Dit protocol kan de oprichting van een verzameling van honderden duizenden van unieke mutanten in bacteriën door de willekeurige genomic invoeging van een transposon.
Het algemene doel van deze experimentele procedure is om een transposon-insertiebibliotheek met hoge dichtheid te creëren in Escherichia coli of Shigella flexneri met behulp van bacteriële conjugatie. Deze techniek maakt de creatie mogelijk van honderdduizenden unieke bacteriële mutanten door de willekeurige genomische insertie van een Tn10-transposon. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de overdracht van het plasma dat het transposon bevat, gebeurt via bacteriële conjugatie in plaats van andere minder efficiënte methoden, zoals elektroporatie.
Bovendien voegt de Tn10-transposon zichzelf in in het genoom met minder vooringenomenheid dan andere transposons. Gebruik steriele techniek om een milliliter overnachtelijke cultuur van de donorstammen toe te voegen aan een steriele eppendorfbuis. De buis moet bijvoorbeeld worden gelabeld met een D, voor donor.
Doe hetzelfde voor de ontvangende stam door een milliliter overnachtelijke cultuur van de ontvangende stam in een steriele eppendorfbuis te verwijderen. Opnieuw bijvoorbeeld, gelabeld met R, voor ontvanger. Centrifugeer beide buizen gedurende één minuut bij 14.000 keer G bij kamertemperatuur.
Dit kan worden gedaan in een tafelcentrifuge. Terwijl de centrifuge draait, bereid de filters voor voor conjugatie. Gebruik steriele pincetten om een nitrocellulosefilter op een gelabelde LB-agarplaat te plaatsen die geen antibiotica bevat.
Alternatief kan in plaats van nitrocellulosefilter, steriele veegpapier worden gebruikt. Plaats elk filter op een afzonderlijke LB-agarplaat om besmetting te minimaliseren. Zorg ervoor dat elk filter op een LB-agarplaat wordt geplaatst die op de juiste manier is gelabeld.
Maak drie platen, elk met een filter. Een voor de donor-stam, een voor de ontvangende stam en een voor de bibliotheek. Zodra de centrifuge klaar is, verwijder de overnachtelijke culturen.
Verwijder al het groeimedium dat antibiotica bevat uit de eppendorfbuis en gooi het weg. Zorg ervoor dat u de bacteriecelpallet niet verstoort of verstoort, maar probeer al het groeimedium te verwijderen. Zorg ervoor dat u asseptisch werkt en tips verwisselt tussen elke steekproef.
Voeg aan elke eppendorfbuis 110 microliter verse LB-media zonder antibiotica toe en pipet op en neer om de cultuur te resuspenderen. Zorg ervoor dat u asseptisch werkt. Door meerdere keren op en neer te pipetten om ervoor te zorgen dat er geen celklompjes achterblijven.
Deze stap wordt gedaan om de bacteriecultuur te concentreren en eventuele antibiotica die over zijn gebleven van de overnachtelijke cultuur te verwijderen. Gebruik een pipet om 50 microliter van de geconcentreerde donorcultuur op het filter te plaatsen dat is gelabeld Donor. Voeg de 50 microliter langzaam in druppels toe aan het filter.
Doe hetzelfde voor de ontvangende stam door 50 microliter van de resuspendeerde cultuur, de geconcentreerde resuspendeerde cultuur in druppels toe te voegen aan het ontvangende filter. Voor de conjugatie om te plaatsen, worden zowel de ontvangende stam als de donor-stam toegevoegd aan hetzelfde filterpapier, zodat ze in nauwe fysieke contact zijn. Om dit te doen, voeg 50 microliter van zowel de donor-stam als de ontvangende stam toe aan hetzelfde filter op de plaat gelabeld bibliotheek.
Plaats deze agarplaten met de filters bij 37 graden gedurende zes uur. Het proces van conjugatie vindt plaats over zes uur bij 37 graden Celsius. Tijdens de conjugatie beweegt het pJA1-plasmine naar de ontvangende stam.
Na de conjugatie worden de bacteriën losgemaakt van het filter door te vortexen en geïnduceerd met één millimolair IPTG. IPTG induceert de transposase en het transposon dat het gen voor kanamycine-resistentie bevat, wordt willekeurig in het genoom van de ontvangende stam ingebracht. Bacteriën worden geplaatst op LB-agarplaten met kanamycine en een ander antibioticum om de ontvangende stam met het transposon te selecteren.
De ontvangende stam is Lambda pir negatief, dus het pJA1-plasmine gaat verloren. Na zes uur groei bij 37 graden Celsius is de conjugatie voltooid. Verwijder de platen met de filters uit de incubator.
Gebruik steriele pincetten om het filter met de negatieve donorcontrole van de LB-agarplaat te verwijderen. Tik op de buis om het filterpapier naar de bodem van de conische fles te laten zakken en zorg ervoor dat het filter volledig is ondergedompeld in het LB-medium. Deze buis bevat twee milliliter LB-medium met IPTG en een uiteindelijke concentratie van één millimolair.
Vortex de buis gedurende één minuut om de bacteriën los te maken van het nitrocellulosefilter. Het LB-medium zou troebel moeten worden met bacteriecellen. Herhaal dit ook voor de ontvangende controle en de bibliotheek.
Nadat de filters met de bacteriecellen grondig zijn gevormd om de bacteriën los te maken van het filter, worden de bacteriecellen op geselecteerde media geplaatst. Bij deze stap worden bacteriën geplaatst op LB-agarplaten met kanamycine en een ander antibioticum zoals nalidixinezuur. Kanamycine wordt gebruikt om ontvangende cellen te selecteren die het transposon met het kanamycineresistentiemarkeringsgen met succes in het genoom zijn geïntegreerd.
Ontvangende cellen waarin de markering niet in het genoom is geïntegreerd, worden tegengeselecteerd. Een ander antibioticum zoals nalidixinezuur wordt gebruikt om tegen de donor-stam te selecteren. De donor-stam die hier wordt gebruikt, is gevoelig voor nalidixinezuur, terwijl de ontvangende stam resistent is tegen nalidixinezuur.
Met behulp van dit tweede antibioticum is het mogelijk om de donor-stam te verwijderen. Bij deze stap moeten verschillende verdunningsgradiënten worden geplaatst om een verdunning van de bibliotheek te bepalen die veel kolonies oplevert die voldoende zijn uitgerust. Na het tellen en vastleggen van het aantal kolonies op alle platen met de transposonbibliotheek, willen sommige gebruikers de bibliotheek poolen of combineren in één buis.
Dit kan worden gedaan met behulp van een steriele verspreider. Voeg een milliliter LB-medium toe aan de LB-agarplaat met de transposonbibliotheek. Zodra het medium
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het genereren van transposon-insertiebibliotheken met een hoge dichtheid in Escherichia coli of Shigella flexneri met behulp van bacteriële conjugatie. De methode maakt de willekeurige genomische insertie mogelijk van een Tn10-transposon dat een kanamycin-resistentiemarker draagt, wat de creatie van honderdduizenden unieke bacteriële mutanten faciliteert. De aanpak is efficiënt, kosteneffectief en geschikt voor daaropvolgende genetische analyses.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Microbiologie
- Bacteriële genetica
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- Transposonmutagenese is een veelgebruikte techniek voor het uitschakelen van genen en het bestuderen van genfuncties in bacteriën.
- Traditionele methoden voor het introduceren van transposonen, zoals elektroporatie of chemische transformatie, zijn minder efficiënt voor het genereren van grote mutantenbibliotheken.
- Bacteriële conjugatie maakt een efficiënte plasmidoverdracht tussen stammen mogelijk.
- Dichte transposonbibliotheken zijn waardevol voor functionele genomica, waaronder mutationele screens en studies naar genetische interacties.
Doel van het onderzoek
- Het ontwikkelen van een hoogefficiënt protocol voor het creëren van dichte transposon-insertiebibliotheken in enterobacteriële stammen.
- Het gebruik van bacteriële conjugatie voor plasmidoverdracht, om de omvang en diversiteit van de bibliotheek te verbeteren.
- Het mogelijk maken van downstream-applicaties zoals Tn-Seq en genetische screenings.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van donor- en recipientbacteriestammen met overnight-culturen.
- Concentreren en wassen van cellen om antibiotica te verwijderen.
- Aanbrengen van donor- en recipientcellen op nitrocellulosefilters die op LB-agarplaten zijn geplaatst.
- Bacteriële conjugatie bij 37°C gedurende zes uur voor overdracht van het plasmide dat het transposon bevat.
- Inductie van transposase-expressie met IPTG om willekeurige insertie van het transposon te faciliteren.
- Selectie van mutanten op LB-agarplaten die kanamycin en een tweede antibioticum (bijv. nalidixinezuur) bevatten om recipientmutanten te onderscheiden van donorcellen.
- Samenvoegen en opslag van de resulterende mutantenbibliotheek.
Belangrijkste resultaten
- Generatie van transposon-insertiebibliotheken met een hoge dichtheid met honderdduizenden unieke mutanten.
- Efficiënte selectie van recipiënte stammen met een succesvolle transposon-integratie met behulp van antibiotica-markers.
- Lage insertiebias door het gebruik van een Tn10-transposonvariant.
- Mutantbibliotheken die geschikt zijn voor diverse downstream genetische analyses.
Conclusies
- Het beschreven protocol biedt een eenvoudige, snelle en goedkope methode voor het construeren van dichte transposonbibliotheken in E. coli en S. flexneri.
- Bacteriële conjugatie verhoogt de efficiëntie en diversiteit van mutantbibliotheken aanzienlijk in vergelijking met andere methoden.
- De resulterende bibliotheken zijn waardevolle bronnen voor functionele genomica en studies naar genetische interacties.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Dichte transposon-insertiebibliotheken, gegenereerd via bacteriële conjugatie, maken systematische gendisruptie en high-throughput functionele genomica in enterobacteriële stammen mogelijk. Deze mogelijkheid ondersteunt vroege targetvalidatie en mechanistische risicoreductie door uitgebreide mutantbronnen te bieden voor het onderzoeken van signaalpaden. De aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen en de portfoliotriage in onderzoekspijplijnen voor antimicrobialia en bacteriële pathogenese.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt genoombrede ondervraging van genfuncties mogelijk via willekeurige mutagenese.
- Ondersteunt de identificatie van essentiële genen en genetische interactienetwerken.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door het onthullen van niet-essentiële en fitness-gerelateerde loci.
- Biedt een schaalbaar platform voor hypothese-gestuurde targetvalidatie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Genereert gevalideerde mutantbibliotheken voor robuuste forward genetische screens.
- Levert reproduceerbare en kwantitatieve output voor downstream Tn-Seq-analyse.
- Standaardiseert de preparatie van mutantbronnen voor vergelijkbaarheid tussen studies.
- Maakt high-throughput screening van verbindingen of genetische perturbaties mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante bacteriële modellen voor de ontdekking van translationele biomarkers.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie van antimicrobiële targets.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van gegevens over genetische essentialiteit.
- Biedt voorspellende inzichten in bacteriële fitness en virulentiedeterminanten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert op het snijvlak van vroege ontdekking en lead-identificatie en biedt fundamentele mutantbronnen voor workflows voor functionele genomica en target-prioritisering.
- Ontdekkingsbiologie: Genen systematisch verstoren om signaalpaden te verduidelijken en biologische mechanismen te ontrisken.
- Screening: Levert reproduceerbare mutantenbibliotheken met een hoge dichtheid voor schaalbare screeningsplatforms.
- Analytiek: Maakt kwantitatieve mapping van gen-essentialiteit en interactienetwerken mogelijk via Tn-Seq.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische bacteriële modellen voor biomarker-afstemming.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Vestigt een herbruikbare mutantenbron voor lopende en toekomstige R&D-initiatieven.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de selectie van targets.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en kosteneffectieve generatie van mutantbibliotheken.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalallocatie door het mogelijk maken van robuuste genetische screens.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van programma's voor antimicrobialia en bacteriële pathogenese.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in bacteriële genetica en steriele technieken.
- Toegang tot standaard microbiologische instrumentatie en selectieve media is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor het poolen van bibliotheken en downstream analytics.
- Aanpassing kan noodzakelijk zijn voor niet-enterobacteriële stammen of alternatieve modelsystemen.
- De bibliotheekdichtheid en insertionele willekeur moeten voor elke toepassing worden gevalideerd.
