Name: Kwantificeren van menselijke monocyt Chemotaxis In Vitro en lymfkliertest lymfocyt handel In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Leer hoe u monocyt-chemotaxis in vitro kwantificeert en lymfocytmigratie in vivo volgt met THP-1-cellen en fluorescente kleuring. Deze methoden bieden real-time, kwantitatieve inzichten voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het Bernard L. Schwartz programma voor arts-wetenschappers aan de Rockefeller University, het Ontwikkelingsfonds Robertson therapeutische aan de Rockefeller-universiteit en de Sackler Center voor biogeneeskunde en Nutrition Research op de Rockefeller University.

alle procedures werden goedgekeurd door Rockefeller University &#39; s institutionele Animal Care en gebruik Comité. Alle dieren waren ondergebracht onder de voorwaarden van specifieke pathogenen vrije.
 1. In Vitro Chemotaxis <ol><li>cultuur THP-1 cellen 6 in Roswell Park Memorial Instituut 1640 (RPMI 1640) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic zuur (HEPES; 25 mM) (compleet media), handhaven van de dichtheid tussen 0,5-1,0 x 10 6 cellen/mL.</li>
	<li>In een 35 mm celkweek schotel, label 3.5 x 10 5 THP-1 cellen per voorwaarde met calceïne acetoxymethyl (calceïne-AM; 2,5 µM) of andere geschikte fluorescente kleurstof in volledige media bij 37 ° C gedurende 30 minuten 
	Opmerking: Kleurstoffen moeten celmembraan-permeabele en compatibel met live-cel labeling.</li>
	<li>Pre warm een afleesapparaat tot 37 ° C. 
	Opmerking: Naast/nacht temperatuurregeling bodem-lezing functionaliteit is ook vereist. Zie stap 1.10.2 naar een alternatief voor een afleesapparaat voor kwantificering van het migreren cellen.</li>
	<li>Terwijl cellen zijn etikettering, bereiden de assay plaat en de tweede kamer.
	<ol><li>Gebruik een 24-well weefselkweek de plaat, met één voorwaarde per putje. Uitvoeren van elke voorwaarde in drievoud.</li>
		<li>Toevoegen 750 µL van Hank &#39; s Buffered zoutoplossing (HBSS) gebufferd met 25 mM HEPES en 0,1% bovien serumalbumine (BSA) naar de 24-well-plaat. Dit dient als de basale controle-voorwaarde.
		<ol><li>Gebruik andere putten voor Comparateur voorwaarden, altijd het onderhouden van het totale volume in de onderste kamer op 750 µL. 
			Opmerking: In dit voorbeeld fungeert menselijke monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) als de positieve controle voor chemotaxis 7.
			<ol><li>Assemble het reagens mengsel door het combineren van HBSS met 25 mM HEPES, BSA (0,1%) en MCP-1 (75 ng/mL). Gebruik van volwassen runderserum (2,7% v / v) met MCP-1 als een extra positieve controle. 
				Opmerking: Chemokine en chemokinereceptoren concentratie zal afhangen van de Chemotactische as bestudeerde. Gelyofiliseerd MCP-1 is geresuspendeerde in gedestilleerd water met BSA (0,1%) te maken van een stamoplossing waarvan een eindconcentratie van 50 μg/mL. Dit kan worden verdund in water om een werkoplossing van 10 μg/mL. 5.6 μL van deze oplossing toevoegen aan de tweede kamer.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>Nadat de samenstelling van de kamers van de bodem voltooid is, een poreuze invoegen in elk putje, ervoor te zorgen dat de tabs van het donormateriaal worden uitgelijnd met de inkepingen van de plaat plaatsen. 
		Opmerking: Kies de juiste poriegrootte voor de inserts. Voor monocyten en lymfocyten presteert een poriegrootte van 3 μm goed. Sommige celtypen en/of chemokine systemen mogelijk een matrix-gecoate oppervlak voor optimale migratie. Bijvoorbeeld, voor het meten van THP-1 monocyt chemotaxis naar MCP-1, worden fibronectine of collageen beklede inserts aanbevolen. Afleesapparaat voor kwantificatie, het invoegen moet een licht-impermeant coating, zoals polyethyleentereftalaat, om te voorkomen dat de detectie van niet-migreren cellen in de bovenste kamer 8.</li>
	</ol></li> <li>Na het broeden van cellen voor 30 min met calceïne-AM, overbrengen celsuspensie een conische tube van 15mL. Centrifuge cellen bij 1.000 x g gedurende 2 min. visueel inspecteren cellen om te bevestigen aanvaarding van calceïne-AM ( Figuur 1).</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof met behulp van een vacuüm aspirator. Wassen gelabelde cellen in serumvrij RPMI 1640 aangevuld met HEPES-25 mM. Centrifugeer cellen bij 1.000 x g gedurende 2 min en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer cellen in serumvrij RPMI 1640 aangevuld met HEPES-25 mM. Cellen tellen en het volume aanpassen, zodat de cellen op een eindconcentratie van 1.0-1.5 x 10 6 cellen/mL.</li>
	<li>250 afzien μL van de celsuspensie in de insert (Hogerhuis).</li>
	<li>Nadat alle bovenste holten zijn ingevuld, zachtjes de plaat op te heffen, en inspecteren de onderkant voor de aanwezigheid van luchtbellen die met migratie en opsporing interfereren kunnen. Als u wilt verwijderen een zeepbel, probeer eerst verwijderen vervolgens re-positionering het invoegen. Als dit niet lukt, kunt een 27 G naald punctie van de zeepbel en deze vervolgens opnieuw plaatsen de invoegen.</li>
	<li>Plaats van de plaat in de voorverwarmde 37 ° C-afleesapparaat.
	<ol><li>Ophaal fluorescentie lezingen van de bodem met 1-3 min. intervallen. Bij het gebruik van calceïne-AM, vastgesteldop de fluorescentie excitatie en emissie golflengten 485 nm en 520 nm, respectievelijk. Afhankelijk van de cel type en chemokinereceptoren systeem chemotaxis treedt meestal op meer dan 1-4 h ( figuur 2A).</li>
		<li>Als alternatief voor continumetingen met behulp van een plaat-lezer, het beeld van de putjes met behulp van een omgekeerde fluorescente microscoop ( figuur 2B) staat van excitatie en opsporing van licht op 485 nm en 520 nm, respectievelijk. Gebruik een lage vergroting te vangen van de meerderheid van de onderkant van het donormateriaal. Kwantificeren van cellen door het verwerken van de beelden met ImageJ of soortgelijke software 9.</li>
	</ol></li></ol> 2. Adoptief Transfer van lymfkliertest lymfocyten <ol><li>voorbereiding van donor cellen <ol><li>verdoving 8-12 weken-oude C57BL/6J mannelijke donor muizen met Isofluraan anesthesie (1-3%) met behulp van een vaporizer. Bevestigen van passende diepte van verdoving door teen-snuifje.</li>
		<li>Plaatst u de muisaanwijzer in de liggende positie. Maken met een scalpel een incisie van de middellijn en zoek de milt in het bovenste linker peritoneale ruimte. De hele milt accijnzen en leg in volledige media (RPMI aangevuld met 10% FBS en 25 mM HEPES; 1 mL/milt) op ijs. Narcose donordieren euthanaseren door onthoofding.</li>
		<li>Grind milt weefsel voorzichtig door 40 µm nylon gaas in volledige media (1 mL /spleen) met behulp van het einde van de zuiger van een injectiespuit te maken van een eencellige schorsing en overdracht aan een conische tube van 15 mL.</li>
		<li>Toevoegen 4 volumes van ammoniumchloride kalium (ACK) lysis buffer en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur lyse van erytrocyten.</li>
		<li>Centrifugeren van de cellen bij 1.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en weggeworpen. Als erytrocyten in de pellet blijven, resuspendeer in ACK lysis-buffermengsel, Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, centrifugeer cellen bij 1.000 x g gedurende 2 min en weggeworpen.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in de volledige media bij een concentratie van 2-5 x 10 7 cellen/mL, dan stam van de celsuspensie via een 40 µm nylon gaas te verwijderen cel puin.</li>
		<li>Label 1 x 10 7 cellen/ontvanger muis met een fluorescente kleurstof compatibel met levende cellen en dat blijft behouden op latere fixatie, zoals 5-chloromethylfluorescein DIACETAAT (eindconcentratie 2 μM) 10 . Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten 
		Opmerking: Als u wilt bijhouden van meer dan één cel bevolking, gebruiken andere fluorescente kleurstoffen met extra-cel populaties. For example, een deel van de cellen van de donor kan worden aangeduid met 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoyl) amino) tetramethylrhodamine (eindconcentratie 2 μM) 11.</li>
		<li>Toevoegen 4 volumes HBSS aangevuld met 25 mM HEPES en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 2 min en negeren supernatant. Resuspendeer de pellet in HBSS aangevuld met HEPES 25 mM tot een eindconcentratie van 1 x 10 8 cellen/mL.
		<ol><li>Als u meer dan één fluorescente kleurstof, houden cel populaties gescheiden tot op het ogenblik injectie.</li>
			<li>Overbrengen van een kleine hoeveelheid (10 μL) van cellen van elke kleur naar een kleefpoeders oplossing (1 mL) voor latere cytometry stroomcompensatie.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Overdracht van lymfocyten <ol><li>verdoving 8-12 weken-oude C57BL/6J mannelijke ontvanger muizen met Isofluraan (1-3%) met behulp van een vaporizer; Bevestig diepte van verdoving door teen-snuifje. Veterinaire zalf toepassen dier &#39; s ogen om te voorkomen dat drogen.</li>
		<li>Kort vortex donor cellen (1 s) en transfer naar 1 mL injectiespuit met 27 G, 0,5 in naald, combineren van differentieel gelabelde cel populaties, indien van toepassing.
		<ol><li>Een kleine hoeveelheid (10 μL) van gemengde cellen overbrengen in een kleefpoeders oplossing (1 mL) voor latere stroom cytometry analyses.</li>
		</ol></li> <li>Donordieren in de vatbaar positie plaatsen. Milde caudal druk uitoefenen op de huid dorsale voor het oog, waardoor de oogbol naar iets uitsteken.</li>
		<li>Direct van de naald mediaal en injecteren 100 µL celsuspensie van donor retro-orbitally in elke ontvangende muis. Cellen kunnen ook worden geïnjecteerd via de staart ader.</li>
		<li>Geleidelijk trekt de injectie naald en plaatst van muis alleen in een kooi van herstel. Dier volgen totdat het heeft herwonnen bewustzijn; eenmaal volledig herstelde terugkeer het dier naar sociale huisvesting.</li>
	</ol></li> <li>Verzamelen en analyseren <ol><li>na 1 h, anesthetize ontvangende muizen met Isofluraan anesthesie (1-3%) met behulp van een vaporizer; Bevestig diepte van verdoving door teen-snuifje. Oogst de milt (of ander weefsel van belang) (stap 2.1.2.) van elke geadresseerde muis en de plaats in volledige media (1 mL/ontvanger). Narcose dieren door onthoofding euthanaseren. 
		Opmerking: Langere intervallen voorafgaand aan weefsel oogst zal toenemen weefsel accumulatie door middel van ten minste 24 h.</li>
		<li>Grind milt weefsel voorzichtig door 40 µm nylon gaas in volledige media met behulp van het einde van de zuiger van een injectiespuit een eencellige schorsing en overdracht maken met conische tube van 15 mL.</li>
		<li>Toevoegen 4 volumes van ACK lysis buffer en 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Centrifugeer de celsuspensie bij 1.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en weggeworpen.</li>
		<li>Resuspendeer cellen in kleuring buffer (met fosfaat gebufferde zoutoplossing aangevuld met 1% FBS). Cellen tellen en aan te passen aan een eindconcentratie van 3 x 10 7 cellen/mL. 100 µL celsuspensie overbrengen in een 96-Wells ronde bodemplaat.</li>
		<li>Vlek cellen voor gewenste markeringen (Zie de tabel van materialen) voor analyse door stroom cytometry. Fluorophore-geconjugeerde antilichamen (Zie de tabel van materialen) tegen de gewenste markeringen toevoegen en Incubeer bij 4 ° C gedurende 20 minuten in het donker. Voeg 100 µL kleuring buffer, centrifugeer cellen bij 1.000 x g gedurende 3 minuten en verwijder het supernatant.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in 200 µL kleuring buffer, centrifugeer cellen bij 1.000 x g gedurende 3 minuten en verwijder het supernatant.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in 125 µL kleuring buffer en het verwerven van de monsters met behulp van een cytometer van de stroom met behulp van standaardprocedures. 
		Opmerking: De groene kleurstof is enthousiast over een 488 nm laser en de uitstoot wordt gedetecteerd met 505 en 530/30 dichroïde filters. De oranje kleurstof is opgewekt door een 561 nm en de uitstoot wordt gedetecteerd door een 582/15 dichroïde filter.
		<ol><li>Gebruik behoed cellen 2.1.8.2 om te compenseren voor elke fluorescente kleurstof. 
			Opmerking: Gebruik kraal gebaseerde compensatie met fluorophores bijpassende de excitatie en emissie spectra van de labeling verfstoffen zal leiden tot suboptimaal compensatie.</li>
			<li>Kunt de opgeslagen invoercellen uit stap 2.2.2.1 nauwkeurig bepalen van de verhouding van differentieel invoercellen aangeduid als met behulp van meer dan één label bevolking ( Figuur 3). Berekenen van de specifieke migratie weefsel op basis van de verhouding van label naar labelloze cellen ( Figuur 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+chemokine+receptors%3A+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li>
<li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.protocol-online.org/protocols/4464.pdf">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li>
<li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2186747">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li>
<li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li>
<li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li>
<li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking%3A+chemokines+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Kwantificering van immuun cel migratie kan worden bereikt met behulp van eenvoudige en snelle testen zowel in vitro als in vivo. We tonen de chemotaxis in vitro van menselijke monocyten in reactie op een MCP-1 verloop en vergroting door serum. In vivo, donor lymfkliertest splenocytes differentieel waren gelabeld en na de overdracht van het adoptie, werden teruggevonden van geadresseerden dieren.
Het gebruik van een afleesapparaat heeft het voordeel van de ve...

Robuuste immuniteit vereist de complexe temporele en ruimtelijke coördinatie van een groot aantal celtypes om te reageren op verwonding, besmetting en genereren van self-tolerance. Verscheidene dozijn chemokine receptoren en hun overeenkomstige liganden zijn geconstateerd; gekarakteriseerd bieden moleculaire mechanismen door welke specifieke cellen in een specifieke weefsel kunnen worden gericht op een bepaald tijdstip. Studeren chemotaxis en migratie is dus een onmisbaar onderdeel van het onderzoek van de immunologie. Inderdaad, de beschreven in vitro -assay werd onlangs gebruikt als een instrument voor screening ter identificatie van een Chemotactische cofactor die chemotaxis van T-cellen naar C-C chemokines 19 en 213 versnelt. Het doel van de hier beschreven methoden zijn om vergunning van kwantitatieve analyses van immuun cel chemotaxis in vitro en in vivo.
De bepaling van de kamer Boyden (cel migratie en invasie) is een snelle, goedkope en reproduceerbare methode voor de beoordeling van de cel migratie4,5. In de standaard assay, het Hogerhuis is bezaaid met cellen, en is gescheiden door een poreuze invoegen uit een tweede kamer, waarin de cellen migreren. Op het gewenste tijdstip, kunnen cellen die aan de onderkant van het donormateriaal hebt gemigreerd worden vastgesteld en gekleurd voor de kwantificatie van de lichte microscopie. Echter, dergelijke metingen beperken het verzamelen van gegevens naar een enkel eindpunt, die zich verzet tegen dynamische gegevensverzameling en uitgebreide optimalisatie om het optimale tijdstip voor analyse kunnen vereisen. Hier worden verschillende aanpassingen beschreven waarmee multiplexed, real-time en kwantitatieve metingen van chemotaxis in vitro.
Voor in vivo studies, een functionele eindpunt wordt gebruikt, namelijk de specifieke accumulatie van cellen in een bepaald weefsel compartiment. Vooraf gelabelde donor cellen worden in ontvangende dieren door middel van adoptie overdracht binnengebracht. Deze cellen van de donor kunnen vervolgens worden geïdentificeerd door stroom cytometry na de oogst van de ontvangende weefsel. Ook gepresenteerd is een co labeling strategie die het mogelijk voor de bepaling maakt van de handel in verschillende soorten cellen binnen een enkele begunstigde dier. Deze methode elimineert de dieren variatie van cel injectie, en rekeningen voor fysiologische spreiding over de dieren.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flask</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>Corning</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td><td>Corning</td><td>CB354597</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant MCP-1</td><td>Peprotech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>Adult bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>HBSS with calcium and magnesium; no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2e plate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX71 inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein animal health</td><td>11695-6776-2</td><td>Isofluorane anesthesia</td></tr><tr><td>Cell strainer 40um nylon</td><td>Falcon Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2927</td><td>Excitation: 541nm, Emission: 565nm</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td></tr><tr><td>5ml syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1ml TB syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td>Excitation: 405nm, Emission: 421nm</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>115540</td><td>Excitation: 405nm, Emission: 603nm</td></tr><tr><td>96-well round bottom plate</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow cytometer</td></tr></tbody></table>

kwantificeren van menselijke monocyt chemotaxis in vitro en lymfkliertest lymfocyt handel in vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migratie langs een specifieke chemische kleurovergang1. Chemokines zijn Chemotactische cytokines die bevordering van cellulaire mensenhandel met anatomische en temporele specificiteit2. Chemotaxis is een kritische functie van lymfocyten en andere immune cellen die kwantitatief kunnen worden beoordeeld in vitro. Dit manuscript worden methoden beschreven die de evaluatie van de chemotaxis, zowel in vitro en in vivo, voor diverse celtypen, met inbegrip van de cellijnen en inheemse cellen. De in vitro, plaat gebaseerde indeling toelaat de vergelijking van verschillende voorwaarden gelijktijdig in real-time, en kan worden afgerond binnen 1-4 h. In vitro assay voorwaarden kunnen worden gemanipuleerd om het introduceren van agonisten en antagonisten, als goed als onderscheiden chemotaxis van chemokinesis, die willekeurige beweging is. Voor in vivo mensenhandel evaluaties, kunnen immuuncellen worden aangeduid met meerdere fluorescente kleurstoffen en gebruikt voor de overdracht van de adoptie. De differentiële etikettering van cellen zorgt voor gemengde cel populaties worden ingevoerd in hetzelfde dier, daardoor dalende afwijking en de vermindering van het aantal dieren dat nodig is voor een adequaat aangedreven experiment. Migratie naar lymfoïde weefsel optreedt in zo weinig als 1 h en meerdere compartimenten van het weefsel kunnen worden bemonsterd. Stroom cytometry weefsel oogst na zorgt voor een snelle en kwantitatieve analyse van de migratiepatronen van meerdere celtypen.

Bij het gebruik van calceïne-AM kleurstof, zal visueel onderzoek van de cellen bevestigen label opname (Figuur 1). Geautomatiseerde fluorescerende lezingen houdt migratie als de overdracht van de cellen op de onderkant van het donormateriaal na verloop van tijd. Deze gegevens tonen duidelijk een inductie van cel migratie naar MCP-1, evenals een vergroting van deze reactie door serum (figuur 2A). Afhankelijk van de sterkte van de ...

Protocollen voor kwantitatieve beoordeling van lymfocyt chemotaxis en migratie zijn belangrijke hulpmiddelen voor onderzoek van de immunologie. Hier, wordt een in vitro -protocol beschreven dat vergunningen real-time, multiplexed evaluatie van cel migratie, alsmede een complementaire in vivo techniek waardoor tracking van inheemse cellen met milt.

Kwantificeren van menselijke monocyt Chemotaxis In Vitro en lymfkliertest lymfocyt handel In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

De algemene doelen van deze assays zijn het in real-time kwantificeren van monocytenchemotaxis in vitro en het volgen van lymfocytenmigratie in vivo. De in vitro methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de immunologie, zoals wat de effecten van serumfactoren zijn op de chemotaxis van immuuncellen. Het belangrijkste voordeel van de in vitro techniek is dat deze kwantitatieve en multiplex metingen in real-time mogelijk maakt.De in vivo methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de immunologie over hoe specifieke celtypen migreren binnen een ontvangend dier. De in vivo techniek is bijzonder nuttig voor de kwantitatieve beoordeling van de migratie van meerdere celtypen binnen hetzelfde dier. Voordat u met het experiment begint, labelt u THP-1 cellen met een fluorescerende kleurstof in een 35 millimeter celkweekschaal in compleet medium bij 37 °C gedurende 30 minuten.Terwijl de cellen incuberen, voegt u 750 µL HBSS gebufferd met 25 mM HEPES en 0,1% BSA toe aan de achtergrond- en positieve controleputjes van een 24-wells plaat. Voeg de juiste concentratie MCP-1 in water aangevuld met BSA toe aan de experimentele putjes en de positieve controleputje

quantifying-human-monocyte-chemotaxis-vitro-murine-lymphocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Beschrijven we een protocol van helderveld intravitale microscopie voor het meten van dynamische neutrofiel-endotheliale cel interacties tijdens neutrofielen werving in reactie op de bron van een neutrofiel chemoattractant in vivo. Neutrofiele intraluminale kruipen, transendotheliale migratie en chemotaxis in de muis cremaster spierweefsel worden gevisualiseerd met een time-vervallen video fotografie en gevolgd met ImageJ.

Tracking neutrofielen intraluminale Crawling, transendotheliale migratie en chemotaxis in weefsel door intravitale Video Microscopie

This video demonstrates an experimental investigation of lymphocyte transmigration across a blood-brain barrier (BBB) endothelium model. A monolayer of human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) is generated in vitro, and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) containing lymphocytes are added to the monolayer. The cells are then incubated to allow lymphocyte transmigration, and the migrated cells are quantified using flow cytometry.

Studying Lymphocyte Transmigration Across a Microvascular Endothelial Cell Monolayer

Beschrijven we een protocol voor het meten van transmigratie door monocyten over menselijke endothelial monolayers en hun daaropvolgende rijping in schuim cellen. Dit biedt een veelzijdige methode te beoordelen van de atherogene eigenschappen van monocyten geïsoleerd uit mensen met verschillende ziekten en te evalueren van factoren in het bloed die deze neiging kunnen versterken.

Kwantificering van monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming van personen met chronische inflammatoire aandoeningen

Leukocyten interactie gretig met vasculaire cellen en trombocyten na vaartuig muur letsel of tijdens ontsteking. Hier beschrijven we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde assay karakteriseren de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners.

Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes

Hier presenteren we een geïntegreerde protocol die maatregelen monocyt subpopulatie mensenhandel onder stroom in vitro door gebruik van specifieke oppervlakte markers en confocal fluorescentie microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt om te verkennen sequentiële werving stappen ook over andere subtypen van de leukocyten met behulp van andere specifieke oppervlakte markers profile.

Gelijktijdige studie van de aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom In Vitro

Hier tonen we de methoden voor in vivo kwantificering van leukocyten egress van naïef, ontstoken, en kwaadaardige lymfkliertest huid. Wij voeren een head-to-head vergelijking van twee modellen: transdermaal FITC toepassing en in situ photoconversion. Bovendien tonen wij het nut van photoconversion voor het bijhouden van leukocyten egress van cutane tumoren.

Kwantificeren van de leukocyten Egress via de lymfevaten van lymfkliertest huid en tumoren

De hier ingevoerde protocol kunnen karakterisering van de homing longcapaciteit van primaire menselijke lymfocyten in vivo inflammatoire voorwaarden. Pulmonaire infiltratie van adoptively overgedragen menselijke immune cellen in een muismodel van allergische ontsteking kan worden beeld en gekwantificeerd door licht vel fluorescentie microscopie van chemisch gewiste longweefsel.

Geavanceerde Imaging van longkanker Homing menselijke lymfocyten in een experimenteel In Vivo Model van allergische ontsteking op basis van licht vel microscopie

Hier presenteren we een protocol om de Chemotactische activiteit van bloed monocyten in muizen modellen te kwantificeren, om de effecten van nutritionele, farmacologische en genetische interventies op bloed monocyten te beoordelen en om de in het bloed geafgeleide macrofagen te karakteriseren in Muismodellen met behulp van monocyte-chemoaantretant proteïne-1 (MCP-1)-geladen in de kelder membraan-afgeleide gel stekkers.

Kwantificering van monocyten Chemotactische activiteit in vivo en karakterisering van bloed monocyten afgeleide macrofagen

In dit protocol worden lymfocyten in de bovenste kamer van een transmigratiesysteem geplaatst, gescheiden van de onderste kamer door een poreus membraan. Chemokine wordt toegevoegd aan de onderste kamer, die actieve migratie langs een Chemokine gradiënt induceert. Na 48 h worden lymfocyten in beide kamers geteld tot transmigratiegekwantata.

Beoordeling van de lymfocyten migratie in een ex vivo-Transmigratiesysteem

Hier beschrijven we methoden met behulp van time-lapse, fase-contrast microscopie om de muis ingezetene peritoneale macrofagen beeld in een chemotactische aanvulling C5a gradiënt. De protocollen kunnen worden uitgebreid naar andere immuuncellen.

Time-lapse Beeldvorming van muis macrofaag Chemotaxis

Dit protocol biedt een methode voor primaire muizen T-celisolatie en time-lapse-microscopie van T-celmigratie onder specifieke omgevingsomstandigheden met kwantitatieve analyse.

Real-time in-vitromigratietest voor primaire muizen CD8+ T-cellen

Leer hoe u monocyt-chemotaxis in vitro kwantificeert en lymfocytmigratie in vivo volgt met THP-1-cellen en fluorescente kleuring. Deze methoden bieden real-time, kwantitatieve inzichten voor immunologisch onderzoek.

Kwantificeren van menselijke monocyt Chemotaxis In Vitro en lymfkliertest lymfocyt handel In Vivo

Meer video's verkennen