Kwantificeren van menselijke monocyt Chemotaxis In Vitro en lymfkliertest lymfocyt handel In Vivo

De algemene doelen van deze tests zijn om monocyten chemotaxis in vitro in realtime te kwantificeren en lymfocytenmigratie in vivo te volgen. De in vitro methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie, zoals wat de effecten zijn van serumfactoren op immuuncellen chemotaxis. Het grote voordeel van de in vitro techniek is dat het kwantitatieve en multiplex metingen in realtime mogelijk maakt.

De in vivo methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van immunologie over hoe specifieke celtypen migreren binnen een ontvangende dier. De in vivo techniek is bijzonder nuttig voor de kwantitatieve beoordeling van de migratie van meerdere celtypen binnen hetzelfde dier. Voordat u met het experiment begint, labelt u THP-1-cellen met een fluorescerende kleurstof in een 35 millimeter celcultuurschaal in compleet medium bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Terwijl de cellen incuberen, voegt u 750 microliter HBSS-buffer met 25 millimolair HEPES en 0,1% BSA toe aan de achtergrond- en positieve controleputjes van een 24-welplate. Voeg de juiste concentratie MCP-1 in water aangevuld met BSA toe aan de experimentele en positieve controleputjes. En plaats poreuze inserts in elk putje, zorg ervoor dat de tabbladen van de inserts uitlijnen met de inkepingen van de plaat.

Het is van cruciaal belang om eventuele luchtbellen uit de onderste putjes te verwijderen na het plaatsen van de inserts, omdat luchtbellen interfereren met fluorescentiemetingen. Aan het einde van de incubatie, brengt u de gelabelde cellen over naar een 15 milliliter conische buis voor hun verzameling door centrifugatie. En inspecteer visueel het resulterende pellet om de opname van de kleurstof te bevestigen.

Vervolgens aspireert u voorzichtig het supernatant en wast u de cellen in serum-vrij RPMI-1640-medium aangevuld met 25 millimolair HEPES onder dezelfde centrifugatiecondities. Resuspendeer het pellet in vers serum-vrij medium met HEPES voor telling. En pas het volume aan tot een eindconcentratie van een tot 1,5 maal 10 tot de zesde cellen per milliliter.

Voeg 250 microliter cellen toe aan de bovenste kamer van elk putje en plaats de plaat in een 37 graden Celsius plate reader. Verkrijg vervolgens fluorescentiemetingen van de onderste kamers met tussenpozen van één tot drie minuten op de juiste fluorescentie-excitatie- en emissiegolflengten voor de kleurstof. Om donorcellen voor hun adoptieve overdracht voor te bereiden, oogst u eerst de hele milt van een geanestheseerde mannelijke acht tot 12 weken oude C57 zwarte zes muis in een 40 micrometer nylon gaasfilter in een celcultuurschaal met compleet medium op ijs.

Gebruik het uiteinde van een spuitplunger om voorzichtig het milt door het gaas te macereren. Wanneer een enkele celsuspensie is verkregen, brengt u de cellen over in een 15 milliliter conische buis en voegt u vier volumes ammoniumchloride-kalium-lyseringsbuffer toe om de rode bloedcellen uit te putten. Na vijf minuten bij kamertemperatuur, verzamelt u de cellen door centrifugatie en resuspendeert u het pellet in compleet medium met een concentratie van twee tot vijf keer 10 tot de zevende cellen per milliliter.

Zeef de cellen door een nieuw 40 micrometer nylon gaas om het celdebris te verwijderen. En label een keer 10 tot de zevende cellen per ontvangende muis met een levendcel-compatibele fluorescerende kleurstof die zal worden behouden na opeenvolgende fixatie gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, wast u de cellen in vier volumes HBSS aangevuld met HEPES.

En resuspendeer het pellet in vers HBSS plus HEPES tot een eenmaal 10 tot de achtste cellen per milliliter concentratie. Vervolgens, verticaal korte tijd de donorcellen en laadt u ze in een één milliliter spuit uitgerust met een 27 gauge 0,5 inch naald. Plaats de geanestheseerde acht tot 12 weken oude C57 zwarte zes ontvangende muizen in de buikligging en oefent u milde caudale druk uit op de huid dorsaal van het oog van het eerste dier, waardoor het oogbol licht uitsteekt.

Richt de naald mediaal voor de retro-orbitale injectie van 100 microliter donorcellen. Trek vervolgens geleidelijk de naald terug en plaats de muis in een individuele herstelkooi met monitoring tot volledig herstel. Het is van cruciaal belang dat de dieren op de juiste manier worden geanesthetiseerd en dat de injectieprocedure goed is beoefend om een consistente celbezorging tussen de dieren en tussen experimenten te garanderen.

Tot 24 uur na de adoptieve overdracht, oogst u de milten in één milliliter compleet medium per ontvanger. En genereer een roodbloedcel-vrije enkele celsuspensie zoals zojuist is aangetoond. Na het tellen, past u de celsuspensie aan tot een drie keer 10 tot de zevende cellen per milliliter concentratie in kleurstofbuffer.

En breng 100 microliter cellen over in individuele putjes van een 96-wel ronde bodemplaat. Kleur de cellen voor de markers van belang volgens de standaard flowcytometrische analyseprotocollen. Na 20 minuten op ijs beschermd tegen licht, wast u de cellen in 100 microliter kleurstofbuffer en resuspendeert u de pellets in 200 microliter vers kleurstofbuffer voor een tweede centrifugatie.

Vervolgens resuspendeert u het pellet in 125 microliter vers kleurstofbuffer en analyseert u de celmonsters op een flowcytometer volgens standaardprotocollen. Geautomatiseerde fluorescentiemetingen om migratie te volgen, tonen duidelijk een inductie van celmigratie naar MCP-1 die is versterkt in de aanwezigheid van serum. Afhankelijk van de sterkte van de migratiestimulering, is er een vertraging van ten minste 15 minuten voorafgaand aan een toename van het fluorescentiesignaal dat kan pieken en geleidelijk afneemt naarmate de cellen in oplossing overgaan in de onderste kamer vanaf de onderkant van de invoer met een snellere snelheid dan die van de cellen die uit de bovenste kamer migreren.

Als meer dan één fluorescerend gelabelde celpopulatie adoptief wordt overgedragen, is het belangrijk om de relatieve verhouding van celpopulaties binnen het invoermateriaal te kwantificeren om rekening te houden met