Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren

Het algemene doel van dit methodenartikel is om de gedetailleerde protocollen te introduceren die in ons laboratorium worden gebruikt voor het bestuderen van de moleculaire herkenning van dubbelstrengs RNA's door chemisch gemodificeerde peptide-nucleïnezuren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de RNA-chemische biologie, zoals de detectie en het targeten van RNA-structuren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de ontwerpprincipes toepasbaar zijn op het targeten van elke RNA-duplexstructuur.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Desiree Toh, een onderzoeksmedewerker uit mijn laboratorium. Om met deze procedure te beginnen, voegt u vier microliter van een 35% glyceroloplossing toe aan eerder bereide RNA PNA-monsters en mengt u dit voorzichtig. Breng met een micropipet en gel-laadpunten voorzichtig 20 microliter van elk monster over naar een eerder bereide polyacrylamidegel, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen ontstaan.

laat de gel lopen bij een constante spanning van 250 volt gedurende vijf uur. Schakel na vijf uur de spanningsbron uit en verwijder de glasplaat uit de gelhouder. Verwijder vervolgens de gelafdichtingstape en demonteer de glasplaat.

Verwijder de gel voorzichtig van de glasplaat en plaats deze in een bak gevuld met 350 milliliters gedeïoniseerd water. Voeg voorzichtig 35 microliters ethidiumbromide toe aan de bak en plaats deze 30 minuten op een platformschudmachine op lage snelheid. Na het weggooien van de ethidiumbromide-oplossing spoelt u de gel af met 1,5 tot twee liters gedestilleerd water.

Scan vervolgens de gel met een imager met een groene laser van 532 nanometer en het emissiefilter ingesteld op 610 nanometer. Kwantificeer de intensiteiten van de gelbanden met behulp van gratis software. Draag de juiste hoeveelheid met 2-aminopurine gelabeld dubbelstrengs RNA over naar een schone buis van 1,5 milliliter.

Concentreer vervolgens de RNA-oplossingen met een vacuümconcentrator. Breng daarna de passende volumes van de doelpjut PNA voor diverse concentraties over van de eerder bereide hoofdvoorraad naar aparte buisjes van 1,5 milliliter. Concentreer de PNA-oplossingen met de vacuümconcentrator.

Voeg 975 µL incubatiebuffer toe aan de buis met het gedroogde RNA en meng grondig om er zeker van te zijn dat al het RNA is opgelost. Centrifugeer de RNA-oplossing kort en laat deze vervolgens annealen door de buis gedurende 10 minuten in een voorverwarmd warmteblok te plaatsen. Schakel na afloop het warmteblok uit en laat het monster afkoelen tot kamertemperatuur.

Voeg 75 µL RNA toe aan elk van de buisjes met gedroogde PNA en meng grondig. Nadat de monsters minimaal één uur bij kamertemperatuur hebben gestaan, worden ze overnacht geïncubeerd bij 4 °C. Draag vervolgens de juiste hoeveelheden met 2-aminopurine gelabeld enkelstrengs RNA over naar afzonderlijke buisjes van 1,5 mL.

Breng de juiste volumes van de specifieke PNA voor verschillende concentraties over van de hoofdvoorraad naar de respectievelijke buisjes met het enkelstrengs RNA. Voeg na het drogen van de monsters 75 µL incubatiebuffer toe aan elk van de buisjes en meng dit grondig. Onderwerp elk monster aan annealing door elk buisje gedurende 10 minuten in een voorverwarmd warmteblok te plaatsen.

Nadat de monsters zijn afgekoeld tot kamertemperatuur, worden deze overnacht geïncubeerd bij vier graden Celsius. Breng daarna 70 µL van elk monster over naar een cuvet van een centimeter vierkant. Plaats de cuvet in een fluorescentiespectrofotometer en meet de emissie over een golflengtebereik van 330 tot 550 nm.

Zodra de meting is voltooid, verwijdert u de buffer uit de cuvet. Spoel de cuvet met gedestilleerd water en droog deze met stikstofgas. Nadat de meting voor alle monsters is herhaald, draagt u de fluorescentie-intensiteit uit tegen de golflengte.

Breng de juiste hoeveelheden enkelstrengs RNA over naar afzonderlijke buisjes van 1,5 milliliter. Breng vervolgens de juiste volumes van het doelgerichte PNA vanuit de hoofdvoorraad over naar de betreffende buisjes die het enkelstrengs RNA bevatten. Voeg na het drogen van de monsters 130 microliters incubatiebuffer toe aan elk van de buisjes en meng dit grondig.

Onderwerp elke monster voor annealing door elke buis 10 minuten in een voorverwarmd warmteblok te plaatsen. Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur en incubeer ze vervolgens een nacht bij vier graden Celsius. Draag nu 130 µL van elk monster over naar een cuvette met acht microcellen, waarbij één cel incubatiebuffer bevat.

Meet met een UV-Vis-spectrofotometer de absorbantie van elk monster bij 260 nanometer. Meet bij een stijgende temperatuur van 15 tot 95 graden Celsius, gevolgd door een dalende temperatuur van 95 tot 15 graden Celsius met een opwarm- en afkoelsnelheid van 0,5 graden Celsius per minuut. PNA-oligomeren werden verkregen na twee reverse-phase HPLC-zuiveringen.

De identiteit van de PNA's kan worden bevestigd via MALDI/TOF-analyse. De niet-denaturerende PAGE-gegevens suggereren dat de Q- en L-gemodificeerde PNA alleen de dubbelstrengs RNA-regio met een C-G-paar kan herkennen. Deze specifieke en versterkte herkenning verloopt via de vorming van een tweebasige triple tussen de T-A-U-L-G-C en de Q-C-G PNA en het RNA.

Een fluorescentietitratie-studie met 2-aminopurine toonde aan dat een met Q en L gemodificeerde PNA bindt aan een doelwit dubbelstrengs RNA, maar niet aan enkelstrengs RNA. PNA's die Q-residuen bevatten, vertonen geen thermische smelt-overgangen, wat wijst op een afwezigheid van binding aan enkelstrengs RNA als gevolg van de sterische hindering in het Watson-Crick-achtige Q-G-paar. In vergelijking met de ongemodificeerde PNA P1, vertonen de PNA's P4 en P5 die L-residuen bevatten een lagere smelttemperatuur voor de overeenkomstige RNA-PNA-duplexen vanwege de sterische hindering in het Watson-Crick-achtige L-G-paar.

De gedetecteerde UV-absorptiegegevens van de thermische smelting zijn consistent met de fluorescentietitratiegegevens van 2-aminopurine, die eveneens aantonen dat een PNA met Q- en L-residuen niet sterk bindt aan enkelstrengs RNA. De incorporatie van een Q-base is destabiliserender dan die van een L-base, aangezien een Q-base een significantere sterische hindering veroorzaakt bij de vorming van een Watson-Crick-achtig Q-G-paar. Zodra de methode onder de knie is, kunnen de verschillende experimenten in een week worden voltooid mits ze correct worden uitgevoerd.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals het sonderen en targeten van RNA-structuren in cellen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of we RNA-structuren kunnen detecteren en RNA-functies kunnen reguleren met behulp van dubbelstrengs RNA-bindende PNA's. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van RNA-biologie en ziekten om de ontwikkeling van therapeutica gericht op de RNA-structuur te verkennen.