Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren
September 21st, 2017
We melden de protocollen voor de synthese en zuivering van Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomeren opnemen gewijzigd residuen. De biochemische en Biofysische methoden voor de karakterisatie van de erkenning van RNA duplexen door de gewijzigde PNAs worden beschreven.
Het algemene doel van dit methodenartikel is om de gedetailleerde protocollen te introduceren die door ons laboratorium worden gebruikt voor het bestuderen van de moleculaire herkenning van dubbelstrengs RNA's door chemisch gemodificeerde peptide nucleïnezuren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van RNA chemische biologie, zoals detectie en targeting van RNA structuren. Het grote voordeel van deze techniek is dat de ontwerpprincipes toepasbaar kunnen zijn op het targeten van elke RNA-duplex structuur.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Desiree Toh, een onderzoeksmedewerker uit mijn laboratorium. Om deze procedure te beginnen, voeg je vier microliter van een 35% glyceroloplossing toe aan eerder bereide RNA PNA-monsters en meng je voorzichtig. Gebruik een micropipet en gel-loading tips om voorzichtig 20 microliter van elk monster in een eerder bereid polyacrylamidegel te doen en zorg ervoor dat je geen luchtbellen introduceert.
Laat de gel vijf uur lang draaien op een constante spanning van 250 volt. Na vijf uur zet je de stroomtoevoer uit en verwijder je de glazen plaat uit de gelstandaard. Verwijder vervolgens de gelverzegeling en haal de glazen plaat uit elkaar.
Verwijder voorzichtig de gel van de glazen plaat en plaats hem in een container gevuld met 350 milliliter gedeïoniseerd water. Voeg voorzichtig 35 microliter etidiumbromide toe aan de container en plaats deze op de platform shaker op lage snelheid gedurende 30 minuten. Na het weggooien van de etidiumbromideoplossing, spoel je de gel met 1,5 tot twee liter gedistilleerd water.
Scan vervolgens de gel met een imager met een groene laser van 532 nanometer en de emissiefilter ingesteld op 610 nanometer. Kwantificeer de gelbandintensiteiten met behulp van gratis software. Breng de juiste hoeveelheid 2-aminopurine gelabeld dubbelstrengs RNA over in een schone 1,5 milliliter buis.
Concentreer vervolgens de RNA-oplossingen met behulp van een vacuüm concentrator. Breng vervolgens de juiste volumes van de getargetteerde PNA voor verschillende concentraties over vanaf de eerder bereide hoofdstock naar afzonderlijke 1,5 milliliter buizen. Concentreer de PNA-oplossingen met behulp van de vacuüm concentrator.
Voeg 975 microliter incubatiebuffer toe aan de buis met het gedroogde RNA en meng grondig om ervoor te zorgen dat al het RNA is opgelost. Na kort centrifugeren van de RNA-oplossing, onderwerp je deze aan annealing door de buis 10 minuten in een voorverwarmde hitteblok te plaatsen. Als je klaar bent, zet je de hitteblok uit en laat je het monster afkoelen tot kamertemperatuur.
Voeg 75 microliter RNA toe aan elk van de buizen met het gedroogd PNA en meng grondig. Laat de monsters minimaal een uur op kamertemperatuur staan, en incubeer ze daarna een nacht bij vier graden Celsius. Breng nu de juiste hoeveelheden 2-aminopurine gelabeld enkelstrengs RNA over naar afzonderlijke 1,5 milliliter buizen.
Breng de juiste volumes van de getargetteerde PNA voor verschillende concentraties over vanaf de hoofdstock naar de respectieve buizen met het enkelstrengs RNA. Nadat je de monsters hebt gedroogd, voeg je 75 microliter incubatiebuffer toe aan elk van de buizen en meng grondig. Onderwerp elk monster aan annealing door elk buisje 10 minuten in een voorverwarmde hitteblok te plaatsen.
Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur en incubeer ze daarna een nacht bij vier graden Celsius. Breng vervolgens 70 microliter van elk monster over in een vierkante cuvet van één centimeter. Plaats de cuvet in een fluorescentiespectrofotometer en meet de emissie over het golflengtebereik van 330 tot 550 nanometer.
Zodra de meting voltooid is, verwijder je de buffer uit de cuvet. Spoel de cuvet af met gedistilleerd water en droog af met stikstofgas. Na het herhalen van de meting voor alle monsters, plot je de fluorescentie-intensiteit tegen de golflengte.
Breng de juiste hoeveelheden enkelstrengs RNA over naar afzonderlijke 1,5 milliliter buizen. Breng vervolgens de juiste volumes van de getargetteerde PNA over vanaf de hoofdstock naar de respectieve buizen met het enkelstrengs RNA. Nadat je de monsters hebt gedroogd, voeg je 130 microliter incubatiebuffer toe aan elk van de buizen en meng grondig.
Onderwerp elk monster aan annealing door elk buisje 10 minuten in een voorverwarmde hitteblok te plaatsen. Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur en incubeer ze daarna een nacht bij vier graden Celsius. Breng nu 130 microliter van elk monster over naar een acht-cel cuvet met één cel die incubatiebuffer bevat.
Meet de absorptie van elk monster bij 260 nanometer met behulp van een UV-Vis spectrofotometer. Meet bij toenemende temperatuur van 15 tot 95 graden Celsius gevolgd door afnemende temperatuur van 95 tot 15 graden Celsius bij een ramp snelheid van 0,5 graden Celsius per minuut. PNA oligomeren werden verkregen na twee omgekeerde fase HPLC-zuiveringen.
De identiteit van de PNAs kan worden bevestigd door MALDI/TOF-analyse. De non-denaturing PAGE-gegevens suggereren dat de Q en L gemodificeerde PNA alleen de dubbelstrengs RNA-regio met een C-G paar kan herkennen. Deze specifieke en verbeterde herkenning vindt plaats door de T-A-U-L-G-C en de Q-C-G PNA RNA twee basen triple formatie.
Een 2-aminopurine fluorescentie titratiestudie toonde aan dat een Q en L gemodificeerde PNA bindt aan een getargetteerde dubbelstrengs RNA maar niet aan enkelstrengs RNA. PNAs die Q residuen bevatten, vertonen geen thermische smeltovergangen, wat wijst op een afwezigheid van binding aan enkelstrengs RNA vanwege de sterieke botsing in het Watson Watson-Crick-achtige Q-G paar. In vergelijking met ongemodificeerde PNA P1, tonen PNAs P4 en P5 die L residuen bevatten, een lagere smelttemperatuur voor de corresponderende RNA PNA-duplexen vanwege de sterieke botsing in het Watson-Crick-achtige L-G paar.
De UV-absorptie gedetecteerde thermische smeltgegevens zijn consistent met de 2-aminopurine fluorescentie titratiegegevens, die ook aantonen dat een PNA met Q en L residuen niet ster
Overzicht
Dit artikel presenteert protocollen voor het synthetiseren en zuiveren van Peptid-nucleïnezuur (PNA) oligomeren met gemodificeerde residuen. Het beschrijft biochemische en biofysische methoden voor het karakteriseren van de herkenning van RNA-duplexen door deze gemodificeerde PNAs.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- RNA chemische biologie
- Peptid-nucleïnezuren
- Moleculair herkenning
Achtergrond
- PNA oligomeren kunnen chemisch worden gemodificeerd om hun bindingseigenschappen te verbeteren.
- Het begrijpen van RNA structuurherkenning is cruciaal voor verschillende toepassingen in de moleculaire biologie.
- Gemodificeerde PNAs kunnen specifieke RNA-duplex structuren targeten.
- Karakteriseringsmethoden omvatten fluoresceine en UV-Vis spectroscopie.
Doel van Studie
- Om gedetailleerde protocollen te bieden voor het bestuderen van RNA herkenning door gemodificeerde PNAs.
- Om de bindingsefficiëntie van PNAs naar dubbelstrengs versus enkelstrengs RNA te onderzoeken.
- Om een methodologie te vestigen die toepasbaar is op verschillende RNA structuren.
Gebruikte Methoden
- Synthese en zuivering van PNA oligomeren.
- Elektroforese voor het analyseren van RNA-PNA interacties.
- Fluorescerende spectrofotometrie voor het meten van bindingsaffiniteiten.
- UV-Vis spectrofotometrie voor thermische smeltanalyse.
Belangrijkste Resultaten
- Gemodificeerde PNAs vertoonden verbeterde herkenning van specifieke RNA-duplexen.
- Q en L gemodificeerde PNAs binden selectief aan dubbelstrengs RNA.
- Thermische smeltgegevens gaven verschillen in bindingsstabiliteit aan.
- Q residuen werden gevonden om binding te destabiliseren vanwege sterieke botsingen.
Conclusies
- De vastgestelde protocollen kunnen verder onderzoek in RNA targeting vergemakkelijken.
- Het begrijpen van PNA modificaties kan leiden tot verbeterde RNA detectiemethoden.
- Deze bevindingen dragen bij aan het bredere veld van RNA chemische biologie.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Chemically modified peptide nucleic acids (PNAs) enable sequence-specific recognition of double-stranded RNA (dsRNA) over single-stranded RNA (ssRNA), providing a selective probe for RNA structural targets. This selectivity supports target validation in RNA chemical biology by distinguishing functional duplexes from transient ssRNA species. The method contributes to mechanistic de-risking in early discovery by confirming binding specificity before downstream investment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by confirming PNA binding to specific dsRNA sequences with C-G pairs.
- Operational Value: Uses non-denaturing PAGE and 2-aminopurine fluorescence to quantify binding affinities and selectivity.
- Predictive Value: Distinguishes dsRNA-selective binding from non-specific ssRNA interactions, reducing false positives in target identification.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative fluorescence and thermal melting data for dose-response and selectivity profiling.
- Reproducibility: Standardized gel electrophoresis and spectrophotometry enable cross-laboratory validation of PNA-RNA interactions.
- Scalability: Supports testing of multiple RNA hairpins or duplexes with single-base mutations to map binding specificity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Validated dsRNA recognition supports progression to cellular probing of RNA structures.
- Biomarker Alignment: Selective binding to structured RNA enables detection of disease-associated RNA conformations.
- Risk Mitigation: Lack of ssRNA binding reduces off-target risk in therapeutic ligand design.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, where selective dsRNA recognition informs prioritization of RNA-targeted modalities.
- Discovery Biology: Tests target engagement by measuring PNA binding to defined dsRNA constructs versus ssRNA controls.
- Screening: Enables assay development for selectivity screening using fluorescence titration and thermal shift assays.
- Analytics: Provides quantitative outputs including binding affinity (Kd), thermal stability (Tm), and selectivity ratios.
- Translational Research: Confirms structural selectivity necessary for cellular target engagement studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating PNA modifications across diverse RNA targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking through selective dsRNA recognition over ssRNA.
- Operational Value: Standardized workflows for synthesis, purification, and biophysical characterization.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions based on binding selectivity and thermal stability profiles.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of PNA leads with demonstrated dsRNA specificity.
Implementation Considerations
- Expertise in peptide nucleic acid synthesis via Boc-chemistry solid-phase methods.
- Access to reverse-phase HPLC, MALDI-TOF, and non-denaturing PAGE systems.
- Fluorescence and UV-Vis spectrophotometry for binding and thermal analysis.
- Standardization of incubation buffers, annealing protocols, and gel staining procedures.
- Adaptation considerations for varying RNA length, structure, and modification compatibility.
