Name: Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer hoe chemisch gemodificeerde peptide nucleïnezuren dubbelstrengige RNA's herkennen met elektroforese en fluorescentiespectrofotometrie. Deze methode ondersteunt RNA-doelwitonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door de Singapore ministerie van onderwijs (MOE) Tier 1 (RGT3/13 en RG42/15 tot G.C.) en MOE fase 2 (MOE2013-T2-2-024 en MOE2015-T2-1-028 aan G.C.).

Een octrooiaanvraag (PAT/179/14/15/pct's) gebaseerd op het werk hier gemeld is ingediend.

RNA duplex-bindende PNA oligomeren (bijv., 10-mers) zijn kleine en middelgrote moleculen en dus kan laten zien elektroforetische mobiliteit verschuiving op bindende aan RNAs met een vergelijkbaar of lichtjes grotere grootte (b.v., 50-mer of kleiner). Als een RNA aanzienlijk groter dan de PNA is, kan titratie van PNA in RNA niet werken als gevolg van een verschuiving van de mobiliteit beperkt gel. Zo kan de grote RNA voor de niet-denaturering pagina testen worden afgekapt. Titratie van een grote RNA in een fluorophore-geëtiketteerden PNA zorgt voor de monitoring van de triplex vorming door een niet-denaturering agarose gel met het monster dat is geladen in het midden van de gel-40.
Voor een titratie experiment door niet-denaturering pagina met een constante totale concentratie van RNA gebruiken we meestal een labelloze RNA concentratie 1 µm voor efficiënte post kleuring van de gratis RNA en triplex bands door ethidiumbromide. Een RNA concentratie zo laag als 0,2 µM volstaan ook afhankelijk van de RNA construct31. De concentratie van de labelloze RNA (0,2 µM) bepaalt dat de Kd waarden die nauwkeurig kunnen worden gemeten over 0,2 µM of groter moeten zijn. Andere kleuring kleurstoffen kunnen worden gebruikt om de kleuring efficiëntie te vergroten. U kunt ook suggereren onze niet-gepubliceerde gegevens dat Cy3 kleurstof-geëtiketteerden RNAs in niet-denaturering pagina experimenten kunnen worden gebruikt voor het meten van de strakke bindende gebeurtenissen.
Wijten aan het feit dat de 2-aminopurine is slechts matig TL, is 2-aminopurine fluorescentie titratie ook beperkt tot het meten van de binding met Kd waarden dicht bij of boven 0,2 µM31. Het RNA of de PNA kan worden aangeduid met een relatief lichte kleurstof voor het kwantificeren van een vrij krap bindend in oplossing door middel van fluorescentie titratie, als de binding in veranderingen in de fluorescentie signalen53,54, resulteert 55.
De strategie van gerichte RNA structuren door dsRNA-bindende PNAs is getest voor een beperkt aantal RNAs. Het is waarschijnlijk dat bindende eigenschappen voor dsRNAs met verschillende reeksen en basenpaar composities variëren kan. Men kan altijd kiezen voor de purine-rijke onderdeel van een duplex voor het ontwerp van TFPNAs. Het is van cruciaal belang om te begrijpen hoe opeenvolgende Q· C-G triples invloed kunnen zijn op de stabiliteit van een triplex. Meer uitgebreide reeks-afhankelijke studies zijn duidelijk nodig om te begrijpen van de reeks-afhankelijke bindende eigenschappen van TFPNAs.
De bindende affiniteit van TFPNAs kan verder worden verbeterd door verhoging van de lengte en/of verdere wijziging van de grondslagen en backbones56,,57 van TFPNAs. Echter kan een continu dubbelzijdig regio niet vaak bestaan uit meer dan 10 opeenvolgende basenparen zonder de verstoring door niet-Watson-Crick structuren. Een kan TFPNAs conjugaat met kleine molecules voor de erkenning van niet-Watson-Crick structuren aan dsRNA regio's grenzen. In principe een TFPNA-kleine molecule conjugaat verwachting bindende affiniteit en specificiteit ten opzichte van een TFPNA of een klein molecuul alleen hebben verbeterd. Echter, de chemische en fysische eigenschappen van de linker voor de vervoeging58,59,60,,61,62,,63,64 moet worden geoptimaliseerd.
Het feit dat TFPNAs selectief aan dsRNAs over ssRNAs en dsDNAs binden kunt vermoeden dat het mogelijk is te ontwikkelen TFPNAs als zeer nuttig chemische sondes en potentiële therapeutische liganden door middel van de verordening van RNA structurele dynamica en interacties met eiwitten en metabolieten. Cellulaire opname van TFPNAs kan worden vergemakkelijkt door de vervoeging met cel-penetrating wordt zoals kleine molecules, peptiden, en nanodeeltjes of complexvorming met supramoleculaire structuren zoals liposomen5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Verder kan functionalization van TFPNAs met bioimaging codes zoals fluorophores en radio-isotopen vergemakkelijken de detectie, imaging, en doelgerichtheid van functionele structuren van het RNA in levende organismen.

RNAs zijn opkomst als belangrijke biomarkers en therapeutische doelen, vanwege de recente vooruitgang in de ontdekkingen van de RNAs rollen in de verordening en katalyse van uiteenlopende biologische processen1,2,3. Van oudsher, antisense strengen hebben gebruikt om te binden aan de ssRNAs t/m Watson-Crick dubbelzijdig vorming3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. onlangs, triplex-vormende peptide nucleïnezuren (TFPNAs) zijn ontworpen om aan dsRNAs via Hoogsteen waterstof binding (Figuur 1)3,28,29te binden. dsRNA regio's zijn aanwezig in de meerderheid van de traditionele antisense-gerichte RNAs, met inbegrip van pre-mRNAs en mRNAs, pre of pri-miRNAs3, en vele andere niet-coderende RNAs1,26,27. Gericht op dsRNAs door triple helix vorming met behulp van TFPNAs kan nuttig zijn, als gevolg van de specificiteit van haar structuur en is van groot potentieel voor gebruik bij het herstel van de normale functies van de RNAs, die dysregulated in ziekten, bijvoorbeeld zijn.
De onlangs gepubliceerde werken door Rozners et al., en ons3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,,37,38,39,40,41, meldde de inspanningen op het verbeteren van de selectieve binding van gemodificeerde TFPNAs naar dsRNAs met uitgebreide affiniteit. We hebben methodes van de synthese voor rationeel ontworpen PNA monomeren (Figuur 2) met inbegrip van thio-pseudoisocytosine (L) monomeer30 en31monomeer guanidine gemodificeerde 5-methyl cytosine (Q) ontwikkeld. Via verschillende biochemische en biofysische karakteriseringsmethoden, hebben wij aangetoond dat relatief korte PNAs (6-10 residuen) waarin L en Q residuen verbeterde erkenning van Watson-Crick G-C en C-G basenparen, respectievelijk, in dsRNAs tonen. Bovendien Toon in vergelijking met ongewijzigde PNAs, PNAs L en Q residuen bevatten meer selectieve binding naar dsRNA over ssRNA en dsDNA. De guanidine functionaliteit42 in de Q-base kunt PNAs HeLa cellen31invoeren.
In ons laboratorium, synthetiseren we PNAs door de handmatige Boc-chemie (Boc of t- Boc staat voor tert-butyloxycarbony (Zie Figuur 2) solid-phase peptide synthese methode4. De synthese van de PNA monomeer met Boc als de bescherming van de groep amine is handig als de Boc-groep sterically minder omvangrijk in vergelijking met fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) amine bescherming van de groep, die kan zinvol zijn tijdens PNA monomeer koppelingshelft is op de stevige steun. De Boc group is zuur-labiele en kan gemakkelijk worden verwijderd op de solide steun door trifluorazijnzuur 20-50% (TFA) in dichloormethaan (DCM) tijdens PNA synthese. Een geautomatiseerde peptide synthesizer kan worden gebruikt voor het synthetiseren van PNA oligomeren; 3-5-voudige overmaat van PNA monomeer is echter nodig voor een geautomatiseerde peptide synthesizer. Handmatige synthese vereist aanzienlijk minder PNA monomeer (2-3-voudige overschot), met elke koppeling gemakkelijk gecontroleerd door de Kaiser test43. Bovendien, vele geautomatiseerde synthesizers zijn niet compatibel met de Boc-strategie-synthese als gevolg van het gebruik van bijtende TFA tijdens de Boc verwijdering stap.
De PNA oligomeren kunnen worden gezuiverd door omgekeerde-fase krachtige vloeibare chromatografie (RP-HPLC) gevolgd door de karakterisering van het moleculair gewicht door MALDI-TOF (figuren 3 en 4)30, 31. we gebruiken niet-denaturering pagina triplex vorming volgen, te wijten aan het feit dat gratis RNA duplex construeert en PNA triplexes vaak gebonden tonen verschillende migratie tarieven (Figuur 5)30,31 . Geen etikettering nodig is als efficiënte na kleuring kan worden bereikt voor beiden het RNA dubbelzijdig en PNA· RNA2 triplex bands. Een relatief kleine hoeveelheid monster nodig is voor niet-denaturering pagina experimenten. Echter de buffers laden (incubatie) en de lopende buffers (pH 8.3) mogelijk niet hetzelfde, wat resulteert in de metingen wordt beperkt tot het kinetisch stabiele triplexes, omdat een relatief hoge pH van 8,3 kan een triplex aanzienlijk destabiliseren.
2-Aminopurine is een isomeer van adenine (6-aminopurine); de intensiteit van de fluorescentie 2-aminopurine (met een uitstoot piek op ongeveer 370 nm) is gevoelig voor plaatselijke structurele omgevingswijzigingen, en is geschikt voor de bewaking van triplex vorming met het residu gedroogd 2-aminopurine opgenomen in de buurt van de bindende site (PNA Figuur 6) 31. in tegenstelling tot vele andere kleurstoffen die fluorescentie emissie in het zichtbare bereik weergeven, 2-aminopurine-geëtiketteerden RNA kan worden blootgesteld aan licht kamer zonder foto bleken. In tegenstelling tot pagina experiment waarin een actieve buffer met pH 8.3 is vaak nodig, 2-aminopurine gebaseerd fluorescentie titratie maakt het meten van bindende in één oplossing met een pH van een opgegeven, en dus mogelijk de meet- en detectie van relatief zwak en kinetisch unstable inbinden in evenwicht.
UV-absorptie-gedetecteerd thermische smeltende experimenten toestaan de meting van de thermische stabiliteit van duplexen (Figuur 7)31 en trisamenstellingen30,32,44,45. Afhankelijk van de lengte en volgorde samenstelling, het smelten van triplexes kan of kan niet tonen een duidelijke overgang. Thermodynamische parameters kunnen worden verkregen als de warmte- en koelingsector bochten elkaar overlappen. Nauwkeurige thermodynamische parameters kunnen worden verkregen door isothermische titratie calorimetrie (ITC)32; relatief grote hoeveelheid monsters zijn echter in het algemeen vereist voor ITC.

<table><tbody><tr><td>Molecuulzeefzeven, 4A, 1-2 mm diameter pellets&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>87956</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&Yuml;HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>532444</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorofosfaat (PyBOP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25251</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur-anhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser Test Kit&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>Ongewijzigde PNA monomeren</td><td>ASM Research Chemicals GmbH</td><td>5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8389 / 47624</td><td></td></tr><tr><td>Tioanisol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14846</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethaandithiol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12865</td><td></td></tr><tr><td>Trifluormethylsulfonzuur</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10173</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosper&reg; 100 RP-18 endcapped (5 &micro;m) LiChroCART&reg; 250-4</td><td>Merck Millipore</td><td>150838</td><td></td></tr><tr><td>RNA Oligos&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Aangepast&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-cyano-4-hydroxycinnaminezuur (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39468</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J15694</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>N.N'-methyleenbisacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat (APS)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethyleendiamine (TEMED)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>10X Tris-boraat-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td><td>1st Base</td><td>BUF-3010-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>H5433</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromide (10 mg/mL)</td><td>Bio-rad&nbsp;</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>High Precision Cell (Kwarts Suprasil, 200-2500 nm)</td><td>Hellma Analytics&nbsp;</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr></tbody></table>

volgorde-specifieke en selectieve erkenning van double-stranded rnas over single-stranded rnas van chemisch gewijzigd peptide nucleïnezuren

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs zijn opkomst als belangrijke biomarkers en therapeutische doelen. Er is dus groot potentieel bij de ontwikkeling van chemische sondes en therapeutische liganden voor de erkenning van RNA volgorde en structuur. Chemisch gewijzigd Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomeren onlangs hebben ontwikkeld die RNA duplexen op een reeks specifieke wijze kan worden herkend. PNAs zijn chemisch stabiel met een neutrale peptide-achtige backbone. PNAs kunnen gesynthetiseerd worden relatief gemakkelijk door de handmatige Boc-chemie solid-phase peptide synthese methode. PNAs zijn gezuiverd door omgekeerde-fase HPLC, gevolgd door de karakterisering van het molecuulgewicht van laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie-tijd van de vlucht (MALDI-TOF). Non-denaturering polyacrylamide-gel elektroforese (pagina) techniek vergemakkelijkt de beeldvorming van de triplex vorming, omdat zorgvuldig ontworpen gratis RNA dubbelzijdig construeert en PNA triplexes vaak gebonden Toon verschillende migratie tarieven. Non-denaturering pagina met ethidium bromide (en) bericht kleuring is vaak een eenvoudig en informatief techniek voor de karakterisering van de bindende affiniteiten en specifieke eigenschappen van PNA oligomeren. Meestal kunnen meerdere RNA haarspelden of duplexen met enkelvoudige basenpaar mutaties worden gebruikt om te karakteriseren PNA bindende eigenschappen, zoals de bindende affiniteiten en specifieke kenmerken. 2-Aminopurine is een isomeer van adenine (6-aminopurine); de intensiteit van de fluorescentie 2-aminopurine is gevoelig voor plaatselijke structurele omgevingswijzigingen, en is geschikt voor de monitoring van triplex vorming met het residu van de 2-aminopurine opgenomen in de buurt van de PNA bindende site. 2-Aminopurine fluorescentie titratie kan ook worden gebruikt ter bevestiging van de bindende selectiviteit van gemodificeerde PNAs naar gerichte double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorptie-gedetecteerd thermische smeltende experimenten toestaan de meting van de thermische stabiliteit van PNA-RNA duplexen en PNA· RNA2 triplexes. Hier beschrijven we de synthese en zuivering van PNA oligomeren opnemen gewijzigd van residuen, en beschrijven van de biochemische en Biofysische methoden voor karakterisering van de erkenning van RNA duplexen door de gewijzigde PNAs.

Omgekeerde-fase HPLC staat de zuivering van PNA oligomeren. We kunnen het verkrijgen van zuivere PNA oligomeren met twee rondes van HPLC zuivering (Figuur 3). De identiteit van de PNAs kan worden bevestigd door de analyse van de MALDI-TOF (Figuur 4).
Non-denaturering pagina is een eenvoudige en informatieve techniek voor de karakterisering van de bindende affiniteiten en specifieke eigenschappen van PNA oligomeren. Wij gebruiken meestal meerdere RNA haarspelden of duplexen met enkelvoudige basenpaar mutaties om karakteriseren bindende eigenschappen (Figuur 5). De niet-denaturering paginagegevens afgebeeld in Figuur 5 duidelijk blijkt dat de Q en L-gemodificeerde PNA een dsRNA-regio met een C-G paar (Figuur 5B, onderste paneel herkent) maar niet zonder een paar van de C-G (Figuur 5B, top deelvenster). Deze specifieke en verbeterde erkenning is door middel van de T· A-U, L· G-C en Q· C-G PNA· De vorming van RNA2 basis triple (Figuur 1A, C, D). Verschillende PNAs met enkelvoudige of meervoudige mutaties kunnen ook worden gebruikt om aan te tonen van de verbeterde bindende eigenschappen van een gemodificeerde PNA. We hebben aangetoond dat het toevoegen van 2 mM Mg2 + in het incubatie-buffer heeft geen invloed op de binding aanzienlijk31.
We hebben aangetoond door 2-aminopurine fluorescentie titratie die een Q en L-gemodificeerde PNA aan een gerichte dsRNA regio (Figuur 6A, 6 C, 6 D) maar niet ssRNA (Figuur 6B, 6E, 6F bindt). PNA P3 bindt aan de 2-aminopurine-geëtiketteerden dsRNA met een K-d -waarde van 0,8 ± 0.1 µM. De intensiteit van de fluorescentie op 370 nm voor de ssRNA 2-aminopurine-label blijft relatief constant met gevarieerde P3 concentratie, die aangeeft het gebrek aan binding van PNA P3 aan de ssRNA.
PNAs met Q residuen (P2 en P3) Toon geen thermische smelten overgangen (Figuur 7), suggereren geen binding met de ssRNA. Dit is te wijten aan de sterische botsing aanwezig in Watson-Crick, zoals Q-G paar. Vergeleken met ongewijzigde PNA P1, PNAs P4 en P5 met gemodificeerde L residuen maar geen Q-residuen, Toon daalde smeltende temperaturen voor de overeenkomstige RNA-PNA duplexen als gevolg van de sterische botsing aanwezig in Watson-Crick, zoals L-G paar. De UV-absorptie-gedetecteerd thermische smeltende gegevens in overeenstemming zijn met de 2-aminopurine fluorescentie titratie gegevens, waaruit ook blijkt dat een PNA Q en L residuen bevatten niet aan de ssRNA aanzienlijk bindt (Figuur 6B, 6E, 6F). Opnemen van een Q-base is meer destabiliserende dan de boekwaarde van een L, zoals een Q-base een belangrijkere sterische botsing in de vorming van een paar met Watson-Crick-achtige Q-G (Figuur 1F is) vergeleken met een paar Watson-Crick-achtige L-G (Figuur 1E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
Figuur 1 : Chemische structuren van stabiele basis triple en onstabiele basenpaar structuren. (A-D) Majoor-groef PNA· RNA2 basis triples van T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C), en Q· C-G (D). (E, F) Unstable Watson-Crick zoals PNA-RNA basenparen van L-G (E) en Q-G (F). De letter R vertegenwoordigt de suiker-fosfaat ruggegraat van RNA. Waterstofbruggen worden aangegeven door zwarte onderbroken lijnen. De afbeelding is gereproduceerd verwijzing €31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
Figuur 2 : Chemische structuren van PNA monomeren. Vier PNA monomeren (T, C, L en Q) worden weergegeven. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
Figuur 3 : Chemische structuur van een PNA oligomeren en zuivering door RP-HPLC. (A) chemische structuur van de PNA reeks P3. (B, C) RP-HPLC-gegevens van ruwe PNA P3 (B) en opnieuw gezuiverd PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
Figuur 4 : MALDI-TOF spectrum van gezuiverde PNA P3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
Figuur 5 : RNA haarspeld en PNA sequenties en bindende karakterisering door niet-denaturering pagina. (A) RNA haarspelden (rHP1 en rHP2), PNA P3, en een PNA· RNA2 triplex gevormd tussen PNA P3 en rHP2. (B) niet-denaturering pagina (12%) resultaten voor rHP1 en rHP2 binding aan PNA P3. De incubatie-buffer is 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5. De geladen RNA haarspelden (rHP1 en rHP2) zijn op 1 µM in 20 µL. De concentraties van de PNA in banen van links naar rechts zijn 0, 0.2, 0.4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, en 50 µM. PNA P3 bindt niet aan rHP1 (bovenzijde) maar bindt aan rHP2 (onderste paneel). (C) Kd bepaling over P3 binding aan rHP2. De Fractie van triplex vorming (Y) was uitgezet tegen de concentratie van PNA. De figuur wordt aangepast van referentie31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
Figuur 6 : Fluorescentie titratie studie van PNA P3 bindendetot 2-aminopurine-geëtiketteerden RNAs. Het 2-aminopurine-residu is aangewezen als '2' in de opeenvolging van RNA. De incubatie-buffer is 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5. (A) een PNA· RNA2 triplex gevormd tussen P3 en een 2-aminopurine-geëtiketteerden dsRNA (dsRNA2-2AP). (B) een hypothetische PNA-RNA duplex gevormd tussen P3 en een ssRNA van 2-aminopurine-label (ssRNA2-2AP). (C, E) Fluorescentie emissie spectra voor de 2-aminopurine-geëtiketteerden RNA dubbelzijdig (1 µM) en ssRNA (1 µM), respectievelijk met gevarieerd P3 concentratie bij pH 7.5. De piek op ongeveer 475 nm is te wijten aan de zwakke fluorescentie-emissie van de L-basis in de PNA. (D, F) K d bepaling op basis van de percelen van 2-aminopurine fluorescentie intensiteit (op 370 nm) van het RNA duplex- en ssRNA, respectievelijk versus PNA P3 concentratie. De figuur wordt aangepast van referentie31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
Figuur 7 : Thermische smelten resultaten voor RNA-PNA duplexen. De incubatie-buffer is 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7.5. Alle monsters bevatten 5 µM van PNA in 130 µL. (A) Single-stranded RNA (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 en P5) single-stranded RNA (ssRNA1) en een hypothetische PNA-RNA duplex gevormd tussen PNA P3 en ssRNA1 in een parallelle oriëntatie. De sterische botsing is geïndiceerd voor de Watson-Crick zoals Q-G en L-G paren. (B) Melting buigt voor verschillende PNAs binden aan ssRNA1. De smeltende temperaturen worden weergegeven voor de krommen met het smelten van overgangen. De figuur wordt aangepast van referentie31.

We melden de protocollen voor de synthese en zuivering van Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomeren opnemen gewijzigd residuen. De biochemische en Biofysische methoden voor de karakterisatie van de erkenning van RNA duplexen door de gewijzigde PNAs worden beschreven.

Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Het algemene doel van dit methodenartikel is om de gedetailleerde protocollen te introduceren die in ons laboratorium worden gebruikt voor het bestuderen van de moleculaire herkenning van dubbelstrengs RNA's door chemisch gemodificeerde peptide-nucleïnezuren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de RNA-chemische biologie, zoals de detectie en het targeten van RNA-structuren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de ontwerpprincipes toepasbaar zijn op het targeten van elke RNA-duplexstructuur.De procedure zal worden gedemonstreerd door Desiree Toh, een onderzoeksmedewerker uit mijn laboratorium. Om met deze procedure te beginnen, voegt u vier microliter van een 35% glyceroloplossing toe aan eerder bereide RNA PNA-monsters en mengt u dit voorzichtig. Breng met een micropipet en gel-laadpunten voorzichtig 20 microliter van elk monster over naar een eerder bereide polyacrylamidegel, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen ontstaan. laat de gel lopen bij een constante spanning van 250 volt gedurende vijf uur. Schakel na vijf uur de spanningsbron uit en verwijder de glasplaat uit de gelhouder. Verwijder vervolgens de gelafdichtingstape en demonteer de glasplaat.Verwijder de gel voorzichtig van de glasplaat en plaats deze in een bak gevuld met 350 milliliters gedeïoniseerd water. Voeg voorzichtig 35 microliters ethidiumbromide toe aan de bak en plaats deze 30 minuten op een platformschudmachine op lage snelheid. Na het weggooien van de ethidiumbromide-oplossing spoelt u de gel af met 1,5 tot twee liters gedestilleerd water.Scan vervolgens de gel met een imager met een groene laser van 532 nanometer en het emissiefilter ingesteld op 610 nanometer. Kwantificeer de intensiteiten van de gelbanden met behulp van gratis software. Draag de juiste hoeveelheid met 2-aminopurine gelabeld dubbelstrengs RNA over naar een schone buis van 1,5 milliliter.Concentreer vervolgens de RNA-oplossingen met een vacuümconcentrator. Breng daarna de passende volumes van de doelpjut PNA voor diverse concentraties over van de eerder bereide hoofdvoorraad naar aparte buisjes van 1,5 milliliter. Concentreer de PNA-oplossingen met de vacuümconcentrator.Voeg 975 µL incubatiebuffer toe aan de buis met het gedroogde RNA en meng grondig om er zeker van te zijn dat al het RNA is opgelost. Centrifugeer de RNA-oplossing kort en laat deze vervolgens annealen door de buis gedurende 10 minuten in een voorverwarmd warmteblok te plaatsen. Schakel na afloop het warmteblok uit en laat het monster afkoelen tot kamertemperatuur.Voeg 75 µL RNA toe aan elk van de buisjes met gedroogde PNA en meng grondig. Nadat de monsters minimaal één uur bij kamertemperatuur hebben gestaan, worden ze overnacht geïncubeerd bij 4 °C. Draag vervolgens de juiste hoeveelheden met 2-aminopurine gelabeld enkelstrengs RNA over naar afzonderlijke buisjes van 1,5 mL.Breng de juiste volumes van de specifieke PNA voor verschillende concentraties over van de hoofdvoorraad naar de respectievelijke buisjes met het enkelstrengs RNA. Voeg na het drogen van de monsters 75 µL incubatiebuffer toe aan elk van de buisjes en meng dit grondig. Onderwerp elk monster aan annealing door elk buisje gedurende 10 minuten in een voorverwarmd warmteblok te plaatsen.Nadat de monsters zijn afgekoeld tot kamertemperatuur, worden deze overnacht geïncubeerd bij vier graden Celsius. Breng daarna 70 µL van elk monster over naar een cuvet van een centimeter vierkant. Plaats de cuvet in een fluorescentiespectrofotometer en meet de emissie over een golflengtebereik van 330 tot 550 nm.Zodra de meting is voltooid, verwijdert u de buffer uit de cuvet. Spoel de cuvet met gedestilleerd water en droog deze met stikstofgas. Nadat de meting voor alle monsters is herhaald, draagt u de fluorescentie-intensiteit uit tegen de golflengte.Breng de juiste hoeveelheden enkelstrengs RNA over naar afzonderlijke buisjes van 1,5 milliliter. Breng vervolgens de juiste volumes van het doelgerichte PNA vanuit de hoofdvoorraad over naar de betreffende buisjes die het enkelstrengs RNA bevatten. Voeg na het drogen van de monsters 130 microliters incubatiebuffer toe aan elk van de buisjes en meng dit grondig.Onderwerp elke monster voor annealing door elke buis 10 minuten in een voorverwarmd warmteblok te plaatsen. Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur en incubeer ze vervolgens een nacht bij vier graden Celsius. Draag nu 130 µL van elk monster over naar een cuvette met acht microcellen, waarbij één cel incubatiebuffer bevat.Meet met een UV-Vis-spectrofotometer de absorbantie van elk monster bij 260 nanometer. Meet bij een stijgende temperatuur van 15 tot 95 graden Celsius, gevolgd door een dalende temperatuur van 95 tot 15 graden Celsius met een opwarm- en afkoelsnelheid van 0,5 graden Celsius per minuut. PNA-oligomeren werden verkregen na twee reverse-phase HPLC-zuiveringen.De identiteit van de PNA's kan worden bevestigd via MALDI/TOF-analyse. De niet-denaturerende PAGE-gegevens suggereren dat de Q- en L-gemodificeerde PNA alleen de dubbelstrengs RNA-regio met een C-G-paar kan herkennen. Deze specifieke en versterkte herkenning verloopt via de vorming van een tweebasige triple tussen de T-A-U-L-G-C en de Q-C-G PNA en het RNA.Een fluorescentietitratie-studie met 2-aminopurine toonde aan dat een met Q en L gemodificeerde PNA bindt aan een doelwit dubbelstrengs RNA, maar niet aan enkelstrengs RNA. PNA's die Q-residuen bevatten, vertonen geen thermische smelt-overgangen, wat wijst op een afwezigheid van binding aan enkelstrengs RNA als gevolg van de sterische hindering in het Watson-Crick-achtige Q-G-paar. In vergelijking met de ongemodificeerde PNA P1, vertonen de PNA's P4 en P5 die L-residuen bevatten een lagere smelttemperatuur voor de overeenkomstige RNA-PNA-duplexen vanwege de sterische hindering in het Watson-Crick-achtige L-G-paar.De gedetecteerde UV-absorptiegegevens van de thermische smelting zijn consistent met de fluorescentietitratiegegevens van 2-aminopurine, die eveneens aantonen dat een PNA met Q- en L-residuen niet sterk bindt aan enkelstrengs RNA. De incorporatie van een Q-base is destabiliserender dan die van een L-base, aangezien een Q-base een significantere sterische hindering veroorzaakt bij de vorming van een Watson-Crick-achtig Q-G-paar. Zodra de methode onder de knie is, kunnen de verschillende experimenten in een week worden voltooid mits ze correct worden uitgevoerd.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals het sonderen en targeten van RNA-structuren in cellen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of we RNA-structuren kunnen detecteren en RNA-functies kunnen reguleren met behulp van dubbelstrengs RNA-bindende PNA's. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van RNA-biologie en ziekten om de ontwikkeling van therapeutica gericht op de RNA-structuur te verkennen.

sequence-specific-selective-recognition-double-stranded-rnas-over

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

High-throughput selectieve 2-hydroxyl acylering geanalyseerd door primerverlenging (SHAPE) gebruikt een nieuwe chemische indringende techniek, reverse transcriptie, capillaire elektroforese en secundaire structuur predictie software om de structuren van RNA bepalen van enkele honderden tot enkele duizenden nucleotiden aan nucleotide resolutie.

RNA secundaire structuur Voorspelling behulp van High-throughput SHAPE

RNA-eiwitinteracties liggen aan de basis van veel cellulaire processen. Hier beschrijven we een in vivo methode om specifiek RNA te isoleren en nieuwe eiwitten te identificeren die ermee geassocieerd zijn. Dit kan nieuw licht werpen op hoe RNA's in de cel worden gereguleerd.

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

We beschrijven een protocol te identificeren van RNA-bindende proteÃ¯nen en kaart van de regio's hun RNA-bindende in levende cellen met behulp van UV-gemedieerde photocrosslinking en massaspectrometrie.

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Deze RNA pull-down methode kunt identificeren van de RNA-doelstellingen van een lang niet-coderende RNA (lncRNA). Gebaseerd op de kruising van zelfgemaakte, ontworpen anti-zin DNA oligonucleotide sondes specifiek voor deze lncRNA in een passende vaste weefsel of cellijn, hierdoor efficiënt de opname van alle RNA doelen met de lncRNA.

RNA Pull-down te identificeren van RNA doelen van een lang niet-coderende RNA Procedure

Double-stranded RNA geproduceerd tijdens de replicatie van RNA-virus kan worden herkend door patroon erkenning receptoren voor het opwekken van een aangeboren immuunrespons. Voor negatieve-gevoel van RNA-virussen blijft de interactie tussen de low-level dsRNA en PRRs onduidelijk. We hebben een confocale microscopie methode ontwikkeld om visualiseren Arenavirussen dsRNA en PRR in afzonderlijke cellen.

Confocale beeldvorming van Double-Stranded RNA en patroon erkenning receptoren in negatief-Sense RNA-virusinfectie

Sequentie specificiteit is essentieel voor genregulatie. Regelgevende eiwitten die specifieke sequenties herkennen zijn belangrijk voor genregulatie. Het definiëren van functionele binding sites voor dergelijke eiwitten is een uitdagend biologisch probleem. Een iteratieve benadering voor de identificatie van een bindingsplaats voor een RNA-bindend eiwit wordt hier beschreven en is toepasbaar op alle RNA-bindende eiwitten.

Sequentie ruimte verkennen om bindende sites te identificeren voor regulatoire RNA-bindende eiwitten

MALDI-TOF werd gebruikt om fragmenten te karakteriseren die werden verkregen uit de reactiviteit tussen geoxideerd RNA en het exoribonuclease Xrn-1. Dit protocol beschrijft een methodiek die toepasbaar is op andere processen waarbij RNA en/of DNA betrokken is.

Identificatie van RNA-fragmenten als gevolg van enzymatische degradatie met behulp van MALDI-TOF-massaspectrometrie

Oligonucleotide 5′-trifosfaten zijn alomtegenwoordige componenten in essentiële biologische routes en worden steeds vaker gebruikt in biotechnologische toepassingen. Hier beschrijven we technieken voor de routinematige synthese en zuivering van oligonucleotide-5′-trifosfaten, uitgaande van oligonucleotiden bereid door standaard geautomatiseerde synthesetechnieken.

Chemische trifosforylering van oligonucleotiden

Het huidige protocol demonstreert het gebruik van een snelle, 3-traps, aptamer-gebaseerde exponentiële versterkingstest om doelen te detecteren. Monstervoorbereiding, signaalversterking en kleurontwikkeling worden behandeld om dit systeem te implementeren om de aanwezigheid van theofylline te herkennen boven die van cafeïne.

Aptamer-gebaseerde doeldetectie mogelijk gemaakt door een 3-traps G-Quadruplex isothermische exponentiële versterkingsreactie

De op DNAzyme gebaseerde nanomachines kunnen worden gebruikt voor zeer selectieve en gevoelige detectie van nucleïnezuren. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het ontwerp van op DNA gebaseerde nanomachines met een 10-23-kern met behulp van gratis software en hun toepassing bij de detectie van een Epstein-Barr-virusfragment als voorbeeld.

DNAzyme 10-23 - Op basis van nanomachines voor nucleïnezuurherkenning

Leer hoe chemisch gemodificeerde peptide nucleïnezuren dubbelstrengige RNA's herkennen met elektroforese en fluorescentiespectrofotometrie. Deze methode ondersteunt RNA-doelwitonderzoek.

Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren (Video) | JoVE Journal

Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren

Meer video's verkennen