Name: Het meten van de mRNA niveaus na verloop van tijd tijdens de gist S. cerevisiae hypoxische reactie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer een RNA-seq protocol om mRNA-niveaus te monitoren tijdens de hypoxische respons van S. cerevisiae. Deze methode helpt onderzoekers genexpressiedynamiek en celreacties op stress bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken het Lewis-Sigler Instituut voor integratieve Genomics Sequencing Core faciliteit aan de Princeton Universiteit voor technisch advies en voor RNA bibliotheek voorbereiding en rangschikken. Dit werk werd gesteund door subsidies van Rowan-universiteit en NIH NIGMS R15GM113187 aan M.J.H.

1. het induceren van hypoxie
<ol><li>Een dag of meer voor het tijdsverloop van hypoxie: bereiden de incubator, cel filteren systeem, vacuüm gastank, kolven, stoppers, glazen buizen en slangen, zoals in de Tabel van de materialen.</li>
	<li>Plaats de N2 tank, couveuse, vacuüm en filtering systeem in de nabijheid, om een snelle verwerking van cellen.</li>
	<li>Bereid steriele vloeibare YPD media (1% gist-Extract, 2% pepton, 2% glucose) door het mengen van de componenten in een glazen fles en autoclaaf.</li>
	<li>Plan de lay-out van de kolven in de incubator. Opmerking: Vanaf de N2 tank, de eerste kolf zullen een water-val zal, de tweede kolf het laatste punt van de tijd, de derde kolf zullen de tijd van de tweede-na-laatste punt en zo verder tot de laatste fles een definitieve water val is. Figuur 1 toont de volgorde en de verbindingen tussen de kolven.</li>
	<li>De dag vóór het tijdsverloop, enten een kolonie van de gist in een cultuur van 5 mL vloeistof YPD binnen een steriele reageerbuis. Specifiek, pick-up een volledige kolonie van een plaat met behulp van een steriele applicator stok. Plaats van de stick in de vloeibare YPD en schud de stok totdat allermeest naar de cellen in suspensie zitten.</li>
	<li>Draai de buizen bij 30 ° C's nachts (~ 16 h). Opmerking: Na 16u, wildtype cellen zullen bereiken verzadiging (~ 2 x 108 cellen/mL), aangegeven door een zwaar bewolkt cultuur. Andere spanningen kunnen langer duren om de verzadiging te bereiken en moeten worden getest door het meten van de concentratie van de cel met een spectrofotometer, zoals aangegeven in stap 1.9.4.</li>
	<li>Op de dag van het tijdsverloop, na 16 h van incubatie, Verdun de verzadigde cultuur overnachting 1:50 met behulp van een 5 mL-pipet te plaatsen van de 4 mL cultuur in 196 mL vloeibare YPD binnen een steriele 500 mL-kolf. Groeien met schudden bij ~ 200 omwentelingen per minuut gedurende 4 uur bij 30 ° C. Opmerking: Na 4 uur, een cultuur van wildtype zal bereiken een half log-concentratie ~ 1-2 x 107 cellen/ml.</li>
	<li>Tijdens de 4 uur incubatie, label de kolven (voor hypoxie en water vallen) en de 50 mL collectie buizen. Als de incubator in stap 1.7 hierboven niet voor het tijdsverloop van hypoxie gebruikt wordt, zet de andere incubator en selecteer tot 30 ° C.</li>
	<li>
Net voor het onderwerpen van cellen aan hypoxie:
	<ol>
<li>Voeg ~ 50 mL water tot twee van de steriele 250 mL kolven die als het water vallen dienen zal.</li>
		<li>Vul 1/3 van een ijs emmer met vloeibare stikstof en dompelen een piepschuim rek voor 50 mL centrifuge buizen.</li>
		<li>Instellen van het filtersysteem voor het verzamelen van cellen. Het toevoegen van een steriel filter-disc in de eenheid van de onderkant van het filtratiesysteem met steriel pincet, voorzichtig te raken alleen de randen van de filter-schijf. Plaats de filter top apparaat op de filter onder eenheid en veilig met de klemmen voorzien van het systeem. Ervoor zorgen dat de onder- en bovenkant eenheden zijn uitgelijnd, zodat er een goede afdichting en geen lekkage.</li>
		<li>De concentratie van de cel meten met een spectrofotometer. Verdun cellen, zodat ze kunnen worden gemeten in het lineaire bereik van de spectrofotometer valt – OD600 tussen ~0.2 - 0.6, afhankelijk van de spectrofotometer valt. Opmerking: Eén OD600 eenheid is ~ 3 x 107 cellen/mL, afhankelijk van cel morfologie en spectrofotometer. Een concentratie van ~ 1-2 x 107 cellen/mL wordt verwacht, overeenkomt met OD600 van ~0.33 - 0,66.</li>
		<li>
Snel verkrijgen het tijd 0-monster.
		<ol>
<li>Het filtersysteem verbinden met een sterke (~ 10 mbar) vacuüm via vacuüm buizen en een val van de maatkolf van 1000 mL. Schakel in het vacuüm. Giet de cultuur (meestal ~ 20 mL) in het bovenste toestel en wacht tot de vloeistof te worden getrokken door het filter (~ 10 s, afhankelijk van de sterkte van het vacuüm).</li>
			<li>Zorgvuldig Verwijder de filter-schijf met een schone pincet en leg in een centrifugebuis 50 mL. Onmiddellijk plaats de centrifugebuis in het rack ondergedompeld in vloeibare stikstof. Nog belangrijker is, niet vooraf chill de buizen voordat het filter wordt ingevoegd als de buizen zal ontploffen.</li>
			<li>Na > 30 s, plaats de buis in een vriezer-80 ° C voor later RNA extractie. Na elke filtratie, schoon en monteer het filtersysteem. Spoelen van het systeem door te trekken water via voor 10 s zonder een filter schijf. Ten slotte veeg droog het systeem met een papieren handdoek.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verdun de 4 h cultuur in verschillende kolven voor de verschillende tijdstippen, zodat elke kolf halverwege log concentratie (~ 1-2 x 107 cellen/mL) op het aangegeven tijdstip van hypoxie bereikt. Opmerking: Tabel 1 toont verdunningen die werden gebruikt voor de wild-type S288C HAP1+ haploïde stam. Het is aanbevolen om test elke stam in deze hypoxische kweekomstandigheden en de verdunningen dienovereenkomstig aan te passen.</li>
		<li>Zodra cellen en media worden toegevoegd aan het kolven, vervangen de aluminiumfolie die betrekking hebben op de kolf openen met een stop met twee glazen buizen ingevoegd.</li>
		<li>Plaats de kolven in de incubator in de lay-out eerder bepaald.</li>
		<li>Veilig sluit de slang zoals afgebeeld in Figuur 1.</li>
		<li>Controleer dat alle de stoppers zich strak geduwd in de kolf openingen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Open de klep van de regelgever op moment 0. Vervolgens stelt u de debietmeter aan 3 L/min. Opmerking: Borrelen zal worden waargenomen in beide kolven van water, met vermelding van de juiste gasstroom. Als dit niet het geval, Controleer of alle stoppers strak zijn en leidingen goed is aangesloten.</li>
	<li>Sluit de incubator en zet de schudden snelheid naar ~ 200 rpm. Een timer te starten.</li>
	<li>Instellen voor elk punt van de tijd, het filtersysteem zoals hierboven beschreven in stap 1.9.3.</li>
	<li>
Op elk tijdstip (bijvoorbeeld5 min, 10 min, etc.), hebben twee mensen snel verwerken de cellen als volgt:
	<ol>
<li>First person: Verwijder de juiste kolf uit de houder en nemen uit de kurk (met glazen buis aangesloten). Opmerking: Dit zal niet breken de stroom van N2 op elk van de resterende cultuur kolven maar tijdelijk de stroom aan de laatste water val zal breken.</li>
		<li>Tweede persoon: Pipet 1 mL van de cultuur en afzien in een cuvet. Sluit de slang uit de cultuur-kolf die is nu aan het einde van de lijn naar de laatste water val (één buis en een stop zal worden verwijderd in het proces.). Vervolgens meten cel concentratie in de meetcel, zoals hierboven beschreven in stap 1.9.4.</li>
		<li>First person: giet het restant van de cultuur in de Vacuüm filtratie-systeem, en voer filtreren en blokkeren zoals hierboven beschreven in stap 1.9.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wanneer u klaar bent met alle punten van de tijd, uitschakelen het N2 gas. Sluit eerst de regelgever en wachten op de druk om vrij te geven, en schakel de flowmeter. Ten slotte het systeem demonteren en reinigen van alle materialen met water en vervolgens 70% ethanol.</li>
</ol>2. RNA extractie
<ol><li>RLT buffer voor te bereiden voor de zuivering van de kolom van RNA, zoals beschreven in de Tabel van de materialen.</li>
	<li>Bereid een werkende oplossing van DNase door 10 µL van de stockoplossing DNase aan 70 µL van buffer RDD per monster toe te voegen (Zie Materialen tabel).</li>
	<li>Verwijder de 50 mL tubes met filters en cellen uit de diepvries-80 ° C en plaats op ijs te ontdooien (~ 15 min). Voer de volgende stappen met buizen op ijs.</li>
	<li>Label 2 mL schroefdop buizen en plaats ze op het ijs, een buis voor elk monster. Voeg ~0.6 mL zuur gewassen kralen aan elke buis, met behulp van een 1,5 mL microcentrifuge buis te schep en meten van de kralen.</li>
	<li>0,6 mL koude RLT buffer toevoegen aan de 50 mL tubes.</li>
	<li>Pipetteer op en neer naar cellen verwijderen uit het filter en schorten in oplossing. Vermijd te laten van het filter blijven in de oplossing, zoals het filter van de oplossing opzuigen zal. Verwijder alle oplossing opgenomen in het filter met behulp van het uiteinde van de pipet te knijpen het filter tegen de wand van de buis.</li>
	<li>Overbrengen in alle van de vloeistof uit de tube 50 mL de schroefdop buizen met kralen.</li>
	<li>Plaats de schroefdop buizen in een kraal molen homogenizer en voor één min lopen. Onmiddellijk plaats de buizen op ijs gedurende drie minuten. Nogmaals, plaats de buizen in de homogenizer en voor één min lopen.</li>
	<li>Verwijder de buizen uit de homogenizer en de plaats op het ijs gedurende 5 minuten. De kralen zal regelen naar de onderkant van de buizen.</li>
	<li>Voer de rest van de stappen bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Breng met een pipet, alleen de lysate (~ 350 µL), het vermijden van de kralen, tot een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge koker.</li>
	<li>Microcentrifuge voor 2 min op max snelheid en vervolgens transfer het supernatant naar een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis.</li>
	<li>Voeg 1 deel 70% ethanol (gemaakt van 200 bewijs moleculaire biologie-grade ethanol). Meng goed door pipetteren.</li>
	<li>Overdracht van de oplossing en een overhaaste naar een RNA-kolom die in een tube van 2 mL collectie heeft gebracht.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 15 s bij ≥12, 000 x g en negeren de doorstroming (de vloeistof in de buis).</li>
	<li>Voeg 350 µL van buffer RW1 toe aan de kolom. Centrifugeer gedurende 15 s bij ≥12, 000 x g en negeren de doorstroming.</li>
	<li>Voeg 80 µL DNase ik incubatie mix aan de kolom membraan (krijg niet op de zijden van de buis) en laat het zitten gedurende 15 minuten.</li>
	<li>350 µL van buffer RW1 aan kolom toevoegen. Microcentrifuge voor 15 s bij ≥12, 000 x g en negeren de doorstroming.</li>
	<li>Voeg toe 500 µL van buffer RPE aan de kolom. Microcentrifuge voor 15 s bij ≥12, 000 x g en negeren doorstroming.</li>
	<li>Voeg toe 500 µL van buffer RPE aan de kolom. Microcentrifuge voor 2 min op ≥12, 000 x g.</li>
	<li>Zorgvuldig de kolom verwijderen en leg in een nieuwe collectie-tube van 2 mL. Microcentrifuge op volle snelheid voor 1 min (om volledig droog het membraan).</li>
	<li>Negeren van de collectie buis en de plaats van de kolom in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. 30 ÂµL van RNase-vrij water aan het membraan van de kolom toevoegen.</li>
	<li>Elueer RNA van de kolom door de microcentrifuging voor 1 min op ≥12, 000 x g. Bij het laden van de kolommen in de microcentrifuge, Controleer of dat de deksels van de collectie buis staan in de richting van de centrifuge draait, om te voorkomen dat de deksels af te breken.</li>
	<li>Voeg een andere 30 µL RNase-gratis water naar de kolom membraan, met behoud van de kolom in de dezelfde microcentrifuge buis.</li>
	<li>Microcentrifuge voor 1 min op ≥12, 000 x g, zodat het uiteindelijke eluaat volume 60 µL is.</li>
	<li>Elke 1,5 mL-buis met 60 µL van RNA in de vriezer-80 ° C worden opgeslagen.</li>
</ol>3. bepaling van de concentratie van RNA en kwaliteit
<ol><li>Het meten van de concentratie van RNA en DNA in elk monster van RNA, met behulp van (a) een Fluorimeter, (b) DNA - en RNA-specifieke fluorescerende kleurstoffen en (c) bepaling buizen, zoals vermeld in de Tabel van de materialen. Volg de instructies van de Fluorimeter en de kleurstoffen.</li>
	<li>Als alternatief, het meten van de concentratie van de nucleïnezuur met een UV spectrofotometer vastgesteld op 260 nm. Opmerking: Een A-260 -lezing van 1.0 komt overeen met ~ 40 µg/mL single-stranded RNA.</li>
	<li>Testen van RNA kwaliteit door het uitvoeren van het RNA op een commerciële nucleic acid analyzer (Zie Materialen tabel) of op een standaard formaldehyde/agarose gel 26.</li>
</ol>4. RNA-seq analyse
<ol><li>Uit de totale voorraad van RNA, make-up 21 µL van 100 ng/µL RNA in RNase-gratis water. Gebruik 1 µL van deze 21 µL om te testen de RNA-concentratie als hierboven. De resterende 20 µL (2 µg) totaal RNA naar een externe sequencing center voor mRNA verrijking, strand-specifieke bibliotheek voorbereiding (met acht of meer barcodes voor multiplexing) indienen en sequencing (Zie Materialen tabel). Als alternatief, lokaal het uitvoeren van mRNA verrijking en bibliotheek voorbereiding, en dien de bibliotheek voor het rangschikken.</li>
	<li>Het zwembad van acht of meer multiplexed monsters en volgorde in één rijstrook van een volgende generatie sequencer.</li>
	<li>Download het FASTQ bestand met alle van de reeks luidt en de bijbehorende index leest. Ook het downloaden van het tekstbestand met de multiplex barcodes. Opmerking: De index leest kunnen aanwezig zijn in een apart FASTQ-bestand. Al deze bestanden in één map plaatsen.</li>
	<li>Plaats het shellscript verstrekt hier, "fastq_pipeline.sh", in de zelfde folder. Dit script als geschikt voor het experiment en de computer mappen bewerken. Opmerking: dit script bevat uitgebreide aantekeningen de stappen uit te leggen. Kortom, de kwaliteit van het script snijdt u het leest, kaarten van de leest aan het genoom en genereert u een tabgescheiden bestand met het aantal leesbewerkingen per gen voor elk monster.</li>
	<li>Stort de FASTQ bestanden en gegevens van de rauwe Lees graaf in de NCBI Gene Expression Omnibus vóór publicatie 27. Volg de instructies voor "Indienen high-throughput sequencedata aan GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.</li>
	<li>Importeer de gegevens Lees graaf in het R statistische milieu en het uitvoeren van statistische analyse, met behulp van het script dat wordt R geleverd hier, "time_course_script. R". Dit script als geschikt voor het experiment en de computer mappen bewerken. Opmerking: Dit script bevat uitgebreide aantekeningen de stappen uit te leggen. Kortom, dit script de gelezen gegevens worden geïmporteerd, normaliseert het luidt, identificeert genen die aanzienlijk veranderen in de tijdsverloop, PCA analyse uitgevoerd en grafieken van de expressie van geselecteerde genen.</li>
</ol>

<ol><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensing%2C+homeostasis%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng.+J+Med%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensing, homeostasis, and disease.</a> New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).</li>
<li>Butler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+gene+expression+in+eukaryotic+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes.</a> Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).</li>
<li>Ratcliffe, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensing+and+hypoxia+signalling+pathways+in+animals%3A+the+implications+of+physiology+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer.</a> J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).</li>
<li>Rosenfeld, E., Beauvoit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+non-respiratory+pathways+in+the+utilization+of+molecular+oxygen+bySaccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).</li>
<li>Ter Linde, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+transcriptional+analysis+of+aerobic+and+anaerobic+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).</li>
<li>Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microarray-assisted+screen+for+potential+Hap1+and+Rox1+target+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).</li>
<li>Kwast, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analyses+of+anaerobically+induced+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+functional+roles+of+Rox1+and+other+factors+in+mediating+the+anoxic+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response.</a> J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).</li>
<li>Becerra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+transcriptome+in+aerobic+and+hypoxic+conditions%3A+effects+of+hap1%2C+rox1%2C+rox3+and+srb10+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions.</a> Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).</li>
<li>Lai, L. -C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamical+remodeling+of+the+transcriptome+during+short-term+anaerobiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+differential+response+and+role+of+Msn2+and%2For+Msn4+and+other+factors+in+galactose+and+glucose+media%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).</li>
<li>Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic-State-Dependent+Remodeling+of+the+Transcriptome+in+Response+to+Anoxia+and+Subsequent+Reoxygenation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Euk.+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).</li>
<li>Hickman, M. J., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+levels+switch+the+function+of+Hap1+of+Saccharomyces+cerevisiae+between+transcriptional+activator+and+transcriptional+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor.</a> Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).</li>
<li>Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase+mediates+a+hypoxic+response+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).</li>
<li>Bendjilali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Course+Analysis+of+Gene+Expression+During+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hypoxic+Response%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response.</a> G3. 7 (1), 221-231 (2017).</li>
<li>Chellappa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+proteins%2C+Spt23p+and+Mga2p%2C+play+distinct+roles+in+the+activation+of+Saccharomyces+cerevisiae+OLE1+gene+expression.+Fatty+acid-mediated+regulation+of+Mga2p+activity+is+independent+of+its+proteolytic+processing+into+a+soluble+transcription+activator%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator.</a> J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).</li>
<li>Abramova, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+controlling+expression+of+the+DAN%2FTIR+mannoprotein+genes+during+anaerobic+remodeling+of+the+cell+wall+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).</li>
<li>Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SREBP+Pathway+Responds+to+Sterols+and+Functions+as+an+Oxygen+Sensor+in+Fission+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast.</a> Cell. 120 (6), 831-842 (2005).</li>
<li>Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bnatural%26%2334%3B+mutation+in+Saccharomyces+cerevisiae+strains+derived+from+S288c+affects+the+complex+regulatory+gene+HAP1+%28CYP1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gen%22%5BJournal%5D)">A &#34;natural&#34; mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1).</a> Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gen%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Anders, S., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+analysis+for+sequence+count+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential expression analysis for sequence count data.</a> Genome Biol. 11 (10), R106(2010).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17 (1), 13(2016).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), R36(2013).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--A+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).</li>
<li>R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.R-project.org">https://www.R-project.org</a> (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Brown, T., Mackey, K., Du, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+RNA+by+Northern+and+Slot+Blot+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization.</a> Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).</li>
<li>Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Omnibus%3A+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).</li>
<li>Cherry, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+Genome+Database%3A+the+genomics+resource+of+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast.</a> Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).</li>
<li>Hothorn, T., Everitt, B. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHothorn%2C+T+%22A+Handbook+of+Statistical+Analyses+using+R%22">A Handbook of Statistical Analyses using R</a>. , 3rd ed, CRC Press: Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2014).</li>
<li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).</li>
<li>Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster+analysis+and+display+of+genome-wide+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).</li>
<li>Davies, B. S. J., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Role+for+Sterol+Levels+in+Oxygen+Sensing+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).</li>
<li>Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+Recombination+is+Activated+at+Early+Time+Points+Following+Exposure+to+Cobalt+Chloride+Induced+Hypoxic+Conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Ind.+J.+Microb%22%5BJournal%5D)">Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).</li>
<li>Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Snf7p+and+Rim101p+in+the+transcriptional+regulation+of+TIR1+and+other+anaerobically+upregulated+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).</li>
<li>Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chromatin+and+Transcriptional+Landscape+of+Native+Saccharomyces+cerevisiae+Telomeres+and+Subtelomeric+Domains%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains.</a> Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).</li>
<li>Collart, M. A., Oliviero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+yeast+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of yeast RNA.</a> Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).</li>
<li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+FASTQ+data+with+Galaxy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Manipulation of FASTQ data with Galaxy.</a> Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).</li>
<li>Martini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((timeClip%3A+pathway+analysis+for+time+course+data+without+replicates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">timeClip: pathway analysis for time course data without replicates.</a> BMC Bioinf. 15, Suppl 5. (2014).</li>
<li>Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+series+expression+analyses+using+RNA-seq%3A+a+statistical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach.</a> BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie werd de mRNA niveaus voor alle genen gemeten tijdens hypoxie in de gist S. cerevisiae. Het doel was om te analyseren hoe mondiale gen expressie veranderingen als gevolg van de groei in een gecontroleerde, in de buurt van zuurstofvrije omgeving. Verschillende stappen gezet om ervoor te zorgen dat de hier beschreven methode zorgvuldig gecontroleerde en reproduceerbaar was. Eerst, cellen werden blootgesteld aan een duidelijk omschreven hypoxische omgeving: 99,999% N2 in rijke media (YPD). ...

Veel organismen reageren op hypoxie of lage O2, door gene expression 1,2,3te wijzigen. Dit antwoord helpt cellen omgaan met het ontbreken van een substraat kritisch voor aërobe ademhaling en voor verschillende biosynthetic reacties, maar ook met een veranderende redox staat 4. Verschillende microarray studies uitgevoerd in S. cerevisiae tonen aan dat de mRNA niveaus van honderden genen in reactie op hypoxie 5,6,7,8,9 wijzigen , 10 , 11 , 12. onlangs, RNA-seq gewend was gen expressie wijzigingen na verloop van tijd tijdens hypoxie 13karakteriseren. Hier, de experimentele gegevens worden gepresenteerd en besproken.
Hypoxie kan worden bereikt op verschillende manieren, elk produceren een ander niveau van O2. Hier, hypoxie werd opgericht door voortdurend stroomt ultra-hoge-zuiverheid N2 in kolven, die [O2 verlaagt] ontbonden onmiddellijk met reproduceerbare kinetiek 10. Het is mogelijk dat er sommige O2 moleculen aanwezig die aan metabolisme en gen-expressie bijdragen maar deze omgeving is zeer vlakbij anaërobe beschouwd. Bij gebrek aan O2, kunnen gistcellen niet biosynthesize Heem, ergosterol en onverzadigde vetzuren 4,12,14. Dus, vorige studies hebben opgenomen deze metabolieten bij het kweken van gist zonder zuurstof 5,10,15. Echter, vele hypoxische reacties zijn gemedieerd door uitputting van deze metabolieten en dus het aanvullen van hen keert de hypoxische gen expressie reacties 12,16. Om na te bootsen natuurlijke hypoxie, werden deze metabolieten niet toegevoegd aan de media. In de korte tijd dat cellen werden blootgesteld aan hypoxie zonder de aanwezigheid van deze essentiële metabolieten, was er geen merkbare toename van de dood van de cel (gegevens niet worden weergegeven), noch een langdurige stress reactie 13.
Het antwoord is ook afhankelijk van de spanning en de genotype. Bijzonder belangrijk zijn de allelen van het bekende regulatoren van hypoxische reacties 2. De achtergrond van de stam S288C is zeer gewenst, zodat de resultaten kunnen worden vergeleken met de andere genomic studies uitgevoerd met deze stam. S288C bevat echter een gedeeltelijke verlies-van-functie allel van de HAP1 gen 17, een transcriptionele regelgever die kritisch zijn voor de hypoxische reactie. Dit allel werd hersteld in S288C met behulp van een wildtype kopie van de Σ1278b stam achtergrond 11.
Genexpressie is sterk afhankelijk van de cellulaire omgeving. Dus, bij het uitvoeren van genoom-brede mRNA analyse, het is belangrijk om te handhaven van een constante omgeving terwijl variërend van een andere parameter zoals tijd, stimulans of genotype. Overweeg zeer reproduceerbaar om resultaten te bereiken, deze drie praktijken voor de studie en alle van haar biologische of technische wordt gerepliceerd. Eerst, de dezelfde experimenter(s) moet de studie uitvoeren, aangezien de technische praktijken onderzoekers kunnen verschillen. Ten tweede, dezelfde batch van ingrediënten moet worden gebruikt in de groei-media zoals elke partij heeft een iets andere samenstelling die genexpressie kan beïnvloeden. Ten derde, te minimaliseren celcyclus gevolgen, elk tijdstip moet bestaan uit asynchrone cellen in de mid log fase van groei (1-2 x 107 cellen/mL).
Wanneer karakterisering van een complexe reactie als de gen expressie reactie op hypoxie, is een tijd cursus gunstig voor het bepalen van de kinetiek van diverse evenementen. Specifieke tijdstippen moeten worden gekozen dat zal vangen de grote veranderingen van het antwoord. In deze studie werden tijdstippen tussen 0 en 4 h waargenomen, omdat afgelopen experimenten bleek grootschalige wijzigingen in genexpressie tijdens deze periode 13.
Voor het meten van globale genexpressie, was RNA-seq gebruikte 18,19. Deze methode maakt gebruik van volgende-generatie sequencing om te bepalen van de relatieve overvloed van elke genes transcript. Ten opzichte van DNA microarray analyse, vertoont RNA-seq hogere gevoeligheid (om te detecteren minder overvloedige afschriften), een groter dynamisch bereik (voor het meten van grotere veranderingen van de vouw) en superieure reproduceerbaarheid (te nauwkeurig volgen genexpressie na verloop van tijd). Meestal is de meest cellulaire RNA ribosomaal RNA die zoveel methoden zijn ontwikkeld om te verrijken voor specifieke RNA soorten 20. Hier, kunnen poly-T kralen werden gebruikt voor het zuiveren van poly-A-bevattende mRNA afschriften, hoewel de verschillende commercieel - beschikbare rRNA uitputting kits ook effectief in het mRNA verrijking.
Hier, werd de S. cerevisiae gen expressie reactie op hypoxie gekenmerkt. Cellen werden blootgesteld aan hypoxie en vervolgens bemonsterd op acht tijdstippen (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 en 240 min). Te bevestigen van de reproduceerbaarheid en statistisch gewijzigde afschriften, werden drie biologische replicatieonderzoeken uitgevoerd. RNA was gewonnen door verstoring van de mechanische en zuivering van de kolom en vervolgens verwerkt voor RNA-seq analyse. De pijpleiding na sequencing wordt beschreven en programmering scripts worden verstrekt waarmee exacte replicatie van de analyses uitgevoerd. Specifiek, werden Trimmomatic 21, TopHat2 22HTseq 23, de R statistische milieu 24en de DESeq2 pakket 25 gebruikt om de RNA-seq-gegevens te verwerken en te identificeren 607 genen die aanzienlijk tijdens veranderen Hypoxie. Belangrijkste componenten analyse (PCA) en de expressie van genen voor de duplo's aangegeven de reproduceerbaarheid van de techniek. Clustering en heatmaps bleek brede expressie kinetiek, terwijl gen ontologie (GO) analyse toonde aan dat vele cellulaire processen, zoals aërobe ademhaling, in de reeks van zuurstof-gereglementeerde genen zijn verrijkt.

<table><tbody><tr><td>Gesloten droge incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4000</td><td>Stel in op 30 &deg;C. Pas de deur aan om toegang toe te staan voor één Tygon-buis. Gebruik alternatief de New Brunswick G25-incubator, die een buispoort bevat. Gebruik geen open waterschudder, omdat condensatie zich zal verzamelen in de buizen tussen de kolven, mogelijk culturen kruisbesmettend.</td></tr><tr><td>Micro-analyse Filterhouder</td><td>Millipore</td><td>XX1002530</td><td>25mm diameter, roestvrij stalen ondersteuning, nr. 5 geperforeerde siliconen stoppen monteert in standaard 125 mL filterkolf</td></tr><tr><td>Sterk vacuüm</td><td>Edwards</td><td>E-LAB 2</td><td>Het &ldquo;huis&rdquo; vacuüm kan te zwak zijn. Gebruik alternatief een elektrische draagbare vacuümpomp zoals hier vermeld.</td></tr><tr><td>1.000 mL kolf</td><td></td><td></td><td>Om te fungeren als vacuümval.</td></tr><tr><td>~2 voet lengte van Heavy Wall Vacuum Buizen, binnendiameter 3/8 in, buitendiameter 7/8 in</td><td>Tygon</td><td>38TT</td><td>Twee stukken: de eerste verbindt vacuüm met val, en de tweede verbindt val met filtersysteem.</td></tr><tr><td>Hogedruk N2 gastank</td><td></td><td></td><td>99,999% zuiverheid, >1.000 psi, met een regelaar en gasstroomsturing</td></tr><tr><td>Geautoclaveerde 500 mL kolf</td><td></td><td></td><td>Opening bedekt met aluminiumfolie. Een voor elke giststam.</td></tr><tr><td>Geautoclaveerde 250 mL kolven</td><td></td><td></td><td>Openingen bedekt met aluminiumfolie. Een voor elk tijdstip plus twee voor watervallen.</td></tr><tr><td>Kolfstoppen (maat 6, twee gaten met 5 mm diameter)</td><td></td><td></td><td>Gesteriliseerd met 70% ethanol. Een voor elke kolf.</td></tr><tr><td>Glazen buis, lengte 9 cm of 17 cm, binnendiameter 2 mm, buitendiameter 5 mm</td><td></td><td></td><td>Gesteriliseerd met 70% ethanol. Twee buizen voor elke kolf. Plaats in de gaten van elke stop. Zie Figuur 1 voor plaatsing van 9- vs 17- cm buizen.</td></tr><tr><td>~25 cm lengte van kunststof buis, binnendiameter 5 mm</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>Eén stuk voor elke kolf. Gesteriliseerd met 70% ethanol.</td></tr><tr><td>Steriele filterschijven</td><td>Millipore</td><td>HAWP02500</td><td>25 mm diameter, 0,45 &micro;m poriegrootte, één voor elk tijdstip</td></tr><tr><td>Steriele dH2O (~100 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL cuvettes</td><td></td><td></td><td>Voor het meten van OD600 (dwz. celconcentratie)</td></tr><tr><td>50 mL steriele centrifugeerbuizen</td><td></td><td></td><td>Een voor elk tijdstip</td></tr><tr><td>Schoon en steriel pincet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td>Voor het bevriezen van cellen</td></tr><tr><td>zuur gewassen kralen</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C voor het lyseren van cellen</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Voor RNA kolomzuivering</td></tr><tr><td>Qiagen RLT buffer</td><td></td><td></td><td>Bereid door 10 &micro;L van &beta;-Mercaptoethanol per 1 mL van RLT buffer toe te voegen, bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>2 mL opvangbuizen</td><td>Qiagen</td><td></td><td>opgenomen in de Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RPE</td><td>Qiagen</td><td></td><td>opgenomen in de Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RW1</td><td>Qiagen</td><td></td><td>opgenomen in de Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>DNase I voorraad en werkoplossingen</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>Het DNase I enzym wordt geleverd als gelyofiliseerd poeder in een glazen flesje. Injecteer met een steriele naald en spuit 550 &micro;L RNA-vrij water (meegeleverd in Qiagen kit) in het flesje. Meng door voorzichtig de fles om te draaien. Om het enzym niet te denatureren, geen vortex. Gebruik een pijpje om deze voorraadoplossing uit het flesje te verwijderen en bewaar in de vriezer (-20 &deg;C) in gebruiksklare aliquoten (80 &micro;L elk). De voorraadoplossing mag niet worden ontdooid en opnieuw bevroren.</td></tr><tr><td>Buffer RDD</td><td>Qiagen</td><td></td><td>opgenomen in de Qiagen DNase Kit</td></tr><tr><td>IJskoude 2 mL schroefdopkleufels</td><td></td><td></td><td>Voor het lyseren van cellen tijdens RNA extractie</td></tr><tr><td>bead mill homogenisator</td><td>Biospec Mini-Beadbeater-24</td><td>112011</td><td>Bewaar in koude ruimte</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>DF0118</td><td>voor vloeibaar YPD medium</td></tr><tr><td>Bacto Gist Extract</td><td>BD</td><td>DF0886</td><td>voor vloeibaar YPD medium</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Fisher</td><td>D16</td><td>voor vloeibaar YPD medium</td></tr><tr><td>Qubit assay buizen</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32856</td><td>voor het meten van nucleïnezuurconcentratie</td></tr><tr><td>Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32853</td><td>voor het meten van nucleïnezuurconcentratie</td></tr><tr><td>Quant-iTTM RNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32855</td><td>voor het meten van nucleïnezuurconcentratie</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>voor het meten van nucleïnezuurconcentratie</td></tr><tr><td>Commercieel elektroforese systeem</td><td>Agilent</td><td>Bioanalyzer 2100</td><td>voor het meten van nucleïnezuurkwaliteit</td></tr><tr><td>Next-generation sequencer</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500</td><td>voor sequencing bibliotheken</td></tr><tr><td>geautomatiseerd vloeistof afhandelingssysteem</td><td>Wafergen</td><td>Apollo 324</td><td>voor het creëren van sequencing bibliotheken</td></tr><tr><td>PrepX PolyA mRNA Isolatiekit</td><td>Wafergen</td><td>400047</td><td>voor het isoleren van mRNA uit totaal RNA</td></tr><tr><td>PrepX RNA SEQ voor Illumina Bibliotheek Kit</td><td>Wafergen</td><td>400039</td><td>voor het creëren van streng-specifieke sequencing bibliotheken uit totaal RNA</td></tr><tr><td>Barcode Splitter</td><td></td><td></td><td>https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&amp;changeset_revision=e7b7cdc1834d</td></tr><tr><td>Samtools, inclusief de gzip-opdracht</td><td></td><td></td><td>http://www.hts

het meten van de mrna niveaus na verloop van tijd tijdens de gist s. cerevisiae hypoxische reactie

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complexe veranderingen in genexpressie bemiddelen doorgaans een groot deel van een cellulaire respons. Elk gen kan expressie met unieke kinetiek veranderen als het gen wordt geregeld door de bijzondere timing van één van de vele prikkels, signalering trajecten of secundaire effecten. Om te vangen van het hele gen werd expressie reactie op hypoxie in de gist S. cerevisiae, RNA-seq analyse gebruikt voor het controleren van de mRNA niveaus van alle genen op specifieke tijdstippen na blootstelling aan hypoxie. Hypoxie werd opgericht door de groeiende cellen in ~ 100% N2 gas. Nog belangrijker is, in tegenstelling tot andere hypoxische studies, zijn ergosterol en onverzadigde vetzuren niet toegevoegd aan de media omdat deze metabolieten genexpressie beïnvloeden. Tijdstippen werden gekozen in de range van 0 - 4 uur na hypoxie omdat die periode de grote wijzigingen in genexpressie vangt. Op elk tijdstip, halverwege log hypoxische cellen werden snel gefilterd en bevroren, beperking van de blootstelling aan O2 en daarmee gepaard gaande wijzigingen in genexpressie. Totaal RNA werd gewonnen uit cellen en gebruikt om te verrijken voor mRNA, die vervolgens werd omgebouwd tot cDNA. Dit cDNA, multiplex bibliotheken zijn gemaakt en acht of meer monsters werden sequenced in één rijstrook van een volgende generatie sequencer. Een pijpleiding na sequencing wordt beschreven, waaronder kwaliteit basis trimmen, lezen toewijzen en het bepalen van het aantal leesbewerkingen per gen. DESeq2 binnen de statistische R-omgeving werd gebruikt om genen die aanzienlijk in één van de hypoxische tijdstippen veranderen te identificeren. Analyse van drie biologische replicatieonderzoeken geopenbaard hoge reproduceerbaarheid, genen van uiteenlopende kinetiek en een groot aantal verwacht O2-genen gereguleerd. Deze methoden kunnen worden gebruikt om te bestuderen hoe de cellen van verschillende organismen reageren op hypoxie na verloop van tijd en aangepast om te bestuderen van genexpressie tijdens andere cellulaire reacties.

Het tijdsverloop van hypoxie en de RNA-seq analyse werden onafhankelijk driemaal uitgevoerd. Om te onderzoeken de reproduceerbaarheid van de drie wordt gerepliceerd, was gen expressie gegevens voor alle genen geanalyseerd met behulp van de belangrijkste componenten analyse (PCA). Figuur 2 toont hoe de monsters veranderen over de eerste twee belangrijkste onderdelen, die samen 58,9% van de variabiliteit vertegenwoordigen. Deze analyse wordt aangegeven dat elke...

Hier presenteren we een protocol met behulp van RNA-seq mRNA niveaus volgen na verloop van tijd tijdens de hypoxische reactie van S. cerevisiae cellen. Deze methode kan worden aangepast aan het analyseren van genexpressie tijdens elke cellulaire reactie.

Het meten van de mRNA niveaus na verloop van tijd tijdens de gist S. cerevisiae hypoxische reactie

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Het algemene doel van dit experiment is om de mRNA-niveaus van alle genen in de loop van de tijd te monitoren terwijl S.Cerevisiae-cellen worden blootgesteld aan hypoxie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van cel-signalering, zoals wat de kinetiek is van veranderingen in genexpressie tijdens een cellulaire respons. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat mRNA-niveaus over een tijdsverloop worden gemeten, in tegenstelling tot metingen op één enkel tijdstip tijdens de cellulaire respons. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de hypoxische respons van gist, kan deze ook worden toegepast op andere microbiële soorten die in vloeibare cultuur kunnen worden gekweekt. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel om de gedetailleerde opstelling van de kolven en slangverbindingen en de snelle collectie van cellen uit hypoxie over te brengen. Bereid één of meer dagen voor de hypoxie-tijdreeks de benodigde materialen voor. Plaats de stikstoftank, incubator, vacuümpomp en het filtratiesysteem dicht bij elkaar om een snelle verwerking van de cellen mogelijk te maken. Bereid steriel vloeibaar YPD-medium door glucose, gistextract en

measuring-mrna-levels-over-time-during-yeast-s-cerevisiae-hypoxic

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Gendeletie en eiwit overexpressie zijn gemeenschappelijke methoden voor het bestuderen van functies van eiwitten. In dit artikel beschrijven we een protocol voor de analyse van fenotype ontwikkeling als een functie van de proteïne concentratie op de bevolking en de single-cell niveau...

Analyse van de ontwikkeling van een morfologische fenotype als een functie van de eiwitconcentratie in gist

Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae</em

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het uitvoeren...

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

We presenteren een eenvoudig protocol voor fluorescentie microscopie films van groeiende gistcellen, en een GUI-gebaseerde software pakket om eencellige tijdreeks gegevens te extraheren verkrijgen. De analyse omvat geautomatiseerde afstamming en verdeeldheid tijd opdracht geïntegreerd met visuele inspectie en handmatige curatie van bijgehouden gegevens.

Het verwerven Fluorescentie Time-lapse films van Budding gist en analyseren van Single-cell Dynamics behulp enten

Twee aanvullende methoden op basis van flowcytometrie en microscopie gepresenteerd die de kwantificering van de enkele cel, de dynamiek van genexpressie geïnduceerd door de activering van MAPK route in gist mogelijk.

Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen

Het steady state niveau van specifieke mRNA's wordt bepaald door de snelheid van synthese en afbraak van het mRNA. Genoom-brede mRNA degradatie tarieven of de vervalsnelheid van specifieke mRNA's kan worden gemeten door het bepalen van mRNA halfwaardetijden. Dit protocol richt zich op het meten van mRNA vervalsnelheden in Saccharomyces cerevisiae.

Meting van mRNA Decay tarieven in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Het gebruik van<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Stammen

Translationeel verordening speelt een belangrijke rol in de controle van eiwitten overvloed. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor de kwantitatieve analyse van vertaling in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae.

Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Het protocol hier beschreven is gebaseerd op het genoom-brede kwantificeren van nieuw samengestelde mRNA gezuiverd van gistcellen aangeduid met 4-thiouracil. Deze methode maakt het mogelijk om het meten van de mRNA-synthese rekken van mRNA verval en biedt dus een nauwkeurige meting van RNA polymerase II transcriptie.

Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit

Dit protocol beschrijft een toepassing van fluorescentie met één molecuul in situ hybridisatie (smFISH) om de in vivo kinetiek van mRNA-synthese en -afbraak te meten.

Indringende mRNA Kinetics in ruimte en tijd in Escherichia coli met behulp van Two-Color Single-Molecule Fluorescentie in Situ Hybridisatie

We presenteren een techniek om translationele (eiwitbiosynthese) complexen snel te stabiliseren met formaldehyde crosslinking in levende gist- en zoogdiercellen. De aanpak maakt het mogelijk om transiënte tussenproducten en dynamische RNA:eiwitinteracties te ontleden. De crosslinked complexen kunnen worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals in op diepe sequencing gebaseerde profileringsmethoden, microscopie en massaspectrometrie.

Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen

Dit protocol maakt gebruik van een bioluminescente reporter, waardoor metingen van transcriptionele activiteit in Saccharomyces eubayanus mogelijk zijn om de overgang van glucose naar maltose te volgen, waardoor real-time analyse van metabole aanpassingen mogelijk is en stamoptimalisatie voor industriële fermentatie onder diverse omstandigheden wordt ondersteund.

In vivo Monitoring van transcriptionele activiteit tijdens metabole overgang met behulp van een bioluminescente reporter in gist

Leer een RNA-seq protocol om mRNA-niveaus te monitoren tijdens de hypoxische respons van S. cerevisiae. Deze methode helpt onderzoekers genexpressiedynamiek en celreacties op stress bestuderen.

Het meten van de mRNA niveaus na verloop van tijd tijdens de gist S. cerevisiae hypoxische reactie

Meer video's verkennen