Name: Snap Chip voor cross-country-reactivity-gratis en Spotter-gratis Multiplexed Sandwich-immunoassay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Leer de snap chip-technologie voor kruisreactiviteitvrije multiplex sandwich-immunoassays zonder spotter. Deze methode maakt gelijktijdige kwantificering van meerdere eiwitten mogelijk voor biomarkeronderzoek in kanker.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Rob Sladek voor het gebruik van de inkjet-spotter. Wij erkennen de uiteindelijke steun van de Canadese instituten voor gezondheid onderzoek (CIHR), de natuurwetenschappen en Engineering onderzoek Raad van Canada (NSERC), de Canadese samenleving onderzoeksinstituut van kanker en de Stichting van Canada voor innovatie (CFI). D.J. dankzij steun van Canada Research Chair.

1. fabricage en opslag van snap chips <ol><li>interne overdrachtmethode ( Figuur 1a) <ol><li>Spot cAb oplossingen met 400 µg/mL antilichamen en 20% glycerol in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op een nitrocellulose (of een functionalized glas) assay dia met een inkjet microarray spotter 13 bij een relatieve vochtigheid van 60% (1.2 nL voor elke vlek) met 800 µm center-naar-midden afstand. Zorg ervoor dat de dia is vastgesteld op de spotter dek volgens een hoek (hier, de bodem verlaten hoek werd gebruikt).</li>
		<li>De gevlekte assay dia bij kamertemperatuur voor 1 h met een relatieve vochtigheid van 60% Incubeer.</li>
		<li>Klem een dia module pakking met 16 vakken op de assay dia te verdelen in 16 wells. Spoel de dia drie keer door het toevoegen van 80 µL van PBS met 0,1% Tween-20 (PBST) in elk goed en schudden op 450 rpm op een shaker, 5 min telkens.</li>
		<li>Toevoegen 80 µL van het blokkeren van oplossingen voor elk goed en laat gedurende 1 h op 450 rpm.</li>
		<li>Verwijderen van de pakking en droog de assay dia met een stikstofstroom.</li>
		<li>Een overdracht dia op het dek van de spotter fix en druk op de linkerbenedenhoek van de dia tegen de bodem verlaten hoek van het dek spotter. Inkjet spot een array van uitlijning merken (een oplossing van polystyreen micro-parels) met dezelfde indeling als die bij de cabines.</li>
		<li>Laat de uitlijning marks droog. Flip de overdracht dia en zet het terug op het dek van de spotter, vaststelling tegen de linker onderhoek.</li>
		<li>Bereiden de dAb spotten oplossingen met 20 µg Mo/mL antilichamen, 20% glycerol en 1% BSA.</li>
		<li>Met behulp van de spotter &#39; s camera, neem een foto van een uitlijning is ingeschakeld. Uitvoering van deze foto in het spotten programma als een fiducial en krijgen van het systeem van de erkenning van het beeld van de inkjet-spotter te identificeren van het meest bovenste linker merk. Gebruik de coördinaat als de eerste plek van de dAb-matrix. Plek 8 nL per druppel met een center-naar-midden afstand van 800 µm.</li>
	</ol></li> <li>Dubbele overzetmethode ( Figuur 1b) <ol><li>een overdracht van dia 1 plaats op het dek van de spotter inkjet tegen de bodem verlaten hoek. Ter plaatse cabines oplossingen met 400 µg/mL antilichamen, 20% glycerol en 1% BSA in PBS op de dia met een inkjet microarray spotter bij een relatieve vochtigheid van 60% (0,4 nL voor elke vlek en ~ 200 µm in diameter). De centrum-naar-midden afstand is 400 µm.</li>
		<li>Snap de overdracht dia met een nitrocellulose bekleed (of een functionalized glas) assay-dia met behulp van een apparaat module ( Figuur 2) overdracht van de cabine druppels op de dia die bepaling.
		<ol><li>Beurt alle zes knoppen aan de zijkant van het apparaat van de module door 90 graden te trekken en vergrendelen van alle plunjers in geopende toestand. De overdracht dia invoegen door de houder van de dia in het recipiënt met de afgekapte hoek tegenover de vaste pogo-Pins. De eerste set van drie knoppen voor het vrijgeven van de plunjers met de gouden pogo-Pins en zorg ervoor dat de dia's worden geduwd tegen de uitlijning pinnen.</li>
			Een nitrocellulose-gecoate dia invoegen <li>in de module apparaat ondersteboven zittend op de 4 pogo-pins. De tweede set van drie knoppen loslaat plunjers met de zilveren speld en ervoor te zorgen dat de dia's worden geduwd tegen de uitlijning pinnen.</li>
			<li>Sluit het apparaat module door het plaatsen van de bovenste schelp op de houder van de dia met behulp van de pijlers van de uitlijning en de gaten voor een nauwkeurige positionering.</li>
			<li>Het apparaat gesloten module invoegen in zijn kooi en duw de sluiting tab helemaal naar beneden om de microarrays face-to-face tijdens het toepassen van de juiste druk. Gesloten voor 1 min. houden</li>
		</ol></li> <li>Scheiden van de dia's. Incubeer de assay dia bij kamertemperatuur voor 1 h met een relatieve vochtigheid van 60%. Wassen, blokkeren en drogen van de assay dia, zoals beschreven in stappen 1.1.3 - 1.1.5.</li>
		<li>Plaats een andere overdracht dia op de inkjet spotter dek en duw tegen de bodem verlaten hoek. Ter plaatse schar oplossingen met 50 of 100 µg/mL van antilichamen (zie tabel 1), 20% glycerol, en 1% BSA in PBS. Ervoor zorgen dat elke vlek 0.8 nL en de centrum-naar-midden afstand tussen plekken is 400 µm.</li>
		<li>De bepaling en de overdracht dia opslaan. Zegel van zowel de test en de overdracht dia's in een luchtdichte zak met droogmiddel en zet in een vriezer van-20 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 2. Multiplexed immunoassay met module chips <ol><li>ophalen de assay dia uit de diepvries. Laat de zak verzegeld gedurende 30 minuten totdat de dia tot kamertemperatuur komt.</li>
	<li>Voorbereiden 7-punts seriële verdund monsteroplossingen door stekelige eiwitten in PBS met 0,05% Tween-20. 
	Opmerking: Hier, een 5-fold verdunningsfactor wordt gebruikt. De startende concentraties voor elke proteïne zijn vermeld in tabel 1.</li>
	<li>Voorbereiden monsteroplossingen zo nodig. Bijvoorbeeld, Verdun menselijk serum 4 keer in PBST buffer.</li>
	<li>Klem van een 16-vaks pakking op de dia assay.</li>
	<li>Vul één kolom met 8 putjes met de 7 eiwit verdunning oplossingen en een bufferoplossing PBST eiwit-gratis door pipetteren. Pipetteer van de monsteroplossingen in de andere 8 putten op dezelfde dia.. 
	Opmerking: 80 µL oplossingen worden past in elk goed. Meer dia's kunnen worden gebruikt om aanvullende monsters indien nodig meten.</li>
	<li>De monsters op een shaker op 450 rpm 1 uur bij kamertemperatuur of voor overnachting bij 4 ° C. wassen de dia drie keer met PBST in het roteerapparaat bij 450 rpm, 5 min telkens uit te broeden. Verwijder de pakking en drogen van de dia onder een stroom van stikstofgas.</li>
	<li>Halen de overdracht dia met wat schar betreft uit de vriezer. Houd de zak verzegeld gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens, Incubeer de dia in een gesloten kamer (b.v. leeg tips doos) bevattende 60% vochtigheid stabilisatie bolletjes voor 20 min voor rehydratie.</li>
	<li>Snap de overdracht dia met de assay-dia met behulp van een apparaat van de module ( Figuur 2) overdracht van de dAb-druppels. Zie punt 1.2.2 voor de werking van het apparaat module.</li>
	<li>Scheiden de dia's. Incubeer de assay dia in een gesloten kamer bevattende 60% vochtigheid stabilisatie bolletjes voor 1 h. klem de assay dia met een 16-vaks pakking en spoel de dia 4 keer met PBST op een shaker op 450 rpm, 5 min telkens.</li>
	<li>Pipetteer 80 µL van oplossingen met 2,5 µg Mo/mL streptavidine fluorophore in PBS in elk putje. Incubeer gedurende 20 min in een roteerapparaat bij 450 rpm.</li>
	<li>Spoel de dia 3 keer met PBST en eenmaal met gedestilleerd water in het roteerapparaat bij 450 rpm. Verwijder de pakking en drogen van de dia met behulp van stikstofgas.</li>
</ol> 3. Dia scannen en data analyse <ol><li>de assay dia scannen met een fluorescentie microarray scanner met behulp van de 635-nm-laser.</li>
	<li>Extract van de netto intensiteit van elke vlek met behulp van een analyse software (bijvoorbeeld matrix-pro analyzer) 16.</li>
	<li>Berekenen de limiet aantoonbaarheidsgrens (LOD) voor elke proteïne met behulp van een software van de statistieken en de eiwit-concentratie in de monsters. 
	Opmerking: De LOD wordt gedefinieerd als het Y-snijpunt van de standaard cuRvE verhoogd met drie maal de standaardafwijking van drie onafhankelijke tests.</li>
</ol>

<ol><li>Mor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+protein+markers+for+early+detection+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Serum protein markers for early detection of ovarian cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).</li>
<li>Nicolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+post-operative+follow-up+of+breast+cancer+patients+with+tumour+markers%3A+CEA%2C+TPA+or+CA15.3+vs+MCA+and+MCA-CA15.3+vs+CEA-TPA-CA15.3+panel+in+the+early+detection+of+distant+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases.</a> BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).</li>
<li>Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+to+improve+protein+detection+by+indirect+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).</li>
<li>Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+multiplexed+MRM-based+protein+biomarker+quantitation+toward+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility.</a> Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).</li>
<li>Ekins, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-analyte+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Multi-analyte immunoassay.</a> J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).</li>
<li>Mahlknecht, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+microarray+analysis+of+serum+cytokines+in+neurodegenerative+Parkinsonian+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes.</a> Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+microarray+profiling+of+human+prostate+cancer+sera%3A+Antibody+screening+and+identification+of+potential+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers.</a> Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).</li>
<li>Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+droplet+microarrays+with+trapped+antibody-functionalized+beads+for+multiplexed+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis.</a> Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).</li>
<li>Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactivity+in+antibody+microarrays+and+multiplexed+sandwich+assays%3A+shedding+light+on+the+dark+side+of+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).</li>
<li>Blank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-chip+protein+arrays%3A+force-based+multiplex+sandwich+immunoassays+with+increased+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity.</a> Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).</li>
<li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%3A+A+Programmable+Force+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA: A Programmable Force Sensor.</a> Science. 301 (5631), 367-370 (2003).</li>
<li>Pla-Roca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Colocalization+Microarray%3A+A+Scalable+Technology+for+Multiplex+Protein+Analysis+in+Complex+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples.</a> Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).</li>
<li>Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-to-Microarray+Transfer+of+Reagents+by+Snapping+of+Two+Chips+for+Cross-Reactivity-Free+Multiplex+Immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays.</a> Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).</li>
<li>Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+snap+chip+for+high-density+sub-nanoliter+chip-to-chip+reagent+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer.</a> Sci. Rep. 5, 11688(2015).</li>
<li>Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+analysis+of+38+proteins+during+the+progression+of+human+breast+tumor+in+mice+using+an+antibody+colocalization+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray.</a> Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).</li>
<li>Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+mixtures+of+14+hygroscopic+additives+to+improve+antibody+microarray+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).</li>
<li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Multiplexed+Analyte+Quantification+Using+Peptide+Immunoaffinity+Enrichment+Coupled+to+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Partitioned+Droplet+Array+on+Laser-Patterned+Superhydrophilic+Glass+Surface+for+Wall-less+Cell+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays.</a> Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).</li>
<li>Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolizing+enzyme+toxicology+assay+chip+%28MetaChip%29+for+high-throughput+microscale+toxicity+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).</li>
<li>Fernandes, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+microarray+for+high-throughput+studies+of+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).</li>
<li>Kwon, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-Eluting+Microarrays+for+Cell-Based+Screening+of+Chemical-Induced+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).</li>
<li>Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Microarray+Based+on+Superhydrophobic-Superhydrophilic+Patterns+for+Single+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis.</a> Microarrays. 5 (4), 28(2016).</li>
<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Monitoring+of+Gene+Expression+Patterns+with+a+Complementary+DNA+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray.</a> Science. 270 (5235), 467-470 (1995).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sandwiched+microarray+platform+for+benchtop+cell-based+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening.</a> Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).</li>
</ol>

McGill University heeft ingediend een octrooiaanvraag over sommige aspecten van dit werk met Huiyan Li en David Juncker als uitvinders.

In dit werk, dat wij hebben ingediend een module-chiptechnologie waarmee de cross-country-reactivity-vrije multiplex immunoassay wijd-beschikbaar voor de onderzoekers met elementaire experimentele opzet. Anders dan de bestaande antilichaam microarrays, geen microarray spotter is nodig voor eindgebruikers. Zowel enkele als dubbele overdracht methoden worden gedemonstreerd, en dubbele overdracht biedt superieure uitlijning nauwkeurigheid neer aan ~ 40 μm voor 98% spots, met de grootste afwijking van 63 µm...

Een panel van biomarkers bestaande uit meerdere eiwitten kan bieden hogere gevoeligheid en specificiteit dan een enkele biomarker in de diagnose van complexe ziekten zoals kanker1,2. De enzym-verbonden immunosorbent analyse (ELISA) is de technologie van de gouden standaard in klinische laboratoria bereiken van een limiet van detectie bij lage pg/mL in plasma, maar grenzen aan één doel per assay3,4,5gebruikt. Antilichaam microarrays zijn ontwikkeld voor de opvang van duizenden verkleinde testen uitgevoerd gelijktijdig op een enkele Microscoop dia6,7,8. Echter het multiplexing vermogen van deze methode wordt beperkt door reagens gestuurde Kruisallergie, die voortvloeien uit de toepassing van een mengsel van wat schar betreft, en wordt het moeilijker met een toenemend aantal doelstellingen9,10 , 11. Pla et al. hebben verklaard dat de daaruit voortvloeiende kwetsbaarheid van een multiplex sandwich assay schalen als 4N(N-1) waarbij N het nummer van de streefcijfers12is.
Om af te zwakken Kruisallergie in antilichaam microarrays, microarray antilichaam-colocalization is (ACM) ontwikkeld in ons laboratorium voor multiplex sandwich assay12. Capture antilichamen (cabines) zijn bevlekt op een substraat met een microarray spotter. Nadat blokkerende monsters worden toegepast op het oppervlak, en vervolgens afzonderlijke wat schar betreft zijn gespot op de dezelfde plekken met de cAb-antigeen-complex. Alle Kruisallergie-scenario's tussen antilichamen en antigenen kunnen worden verlicht met ACM en detectiegrenzen op pg/mL zijn bereikt. Het test-protocol vereist echter voorbereiden en de wat schar betreft spotten tijdens de experimenten met behulp van een on-site microarray spotter met hoge precisie voor uitlijning doel, namelijk duur en tijdrovend, beperking van de ruime toepassing van deze technologie in andere laboratoria. Een handheld ACM, genaamd module chip is ontwikkeld voor cross-country-reactivity-vrije en spotter-vrije multiplex sandwich immunoassay13,14,15. Cabines en wat schar betreft worden vooraf bevlekt op een dia assay en een overdracht dia respectievelijk in microarray opmaken en opgeslagen. Tijdens de test, de dia's worden opgehaald en een microarray van wat schar betreft collectief zijn overgezet naar de assay dia door gewoon het uitlijnen van de twee chips samen. Een module-apparaat wordt gebruikt voor betrouwbare reagens overdracht. Nitrocellulose bedekt dia's met een relatief grote antilichaam bindingscapaciteit zijn gebruikt als de assay dia's op te vangen van de vloeibare druppeltjes en aldus een reagens overdracht vergemakkelijken, echter de dia's zijn duurder dan reguliere glas dia's en microarray scanners compatibel met niet-transparante dia's zijn nodig voor signaal overname.
In dit werk tonen wij het protocol van het uitvoeren van een multiplex sandwich-immunoassay met een module-chip. Een apparaat van de nieuwe module is ontwikkeld voor meer handige en betrouwbare reagens overdracht van microarray-naar-microarray. Nog belangrijker is, hebben hier we de overzetmethode reagens op regelmatige glas dia's met de module-chip opgericht. 1024 plekken werden met succes overgebracht en uitgelijnd op een glasplaatje, aanzienlijk uitbreiden van het gebruik van deze technologie in de meeste laboratoria.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline tablet</td><td>Fisher Scientific</td><td>5246501EA</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-geconjugeerd Cy5</td><td>Rockland</td><td>s000-06</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p1379</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Blockingoplossing: BSA-vrije StabilGuard Choice Microarray Stabilizer</td><td>SurModics, Inc</td><td>SG02</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose gecoate slides</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>305116</td><td></td></tr><tr><td>Aminosilane gecoate slides</td><td>Schott North America</td><td>1064875</td><td></td></tr><tr><td>Snap Device</td><td>Parallex BioAssays Inc.</td><td>PBA-SD01</td><td></td></tr><tr><td>Inkjet microarray spotter</td><td>GeSiM</td><td>Nanoplotter 2.0</td><td></td></tr><tr><td>Slide module gasket</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>204862</td><td></td></tr><tr><td>Humidity Stabilization Beads</td><td>Parallex BioAssays Inc.</td><td>PBA-HU60</td><td></td></tr><tr><td>Array-Pro Analyzer software</td><td>Media Cybernetics</td><td>Version 4.5</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie microarray scanner</td><td>Agilent</td><td>SureScan Microarray Scanner</td><td></td></tr><tr><td>Biostatistiek software</td><td>GraphPad Software</td><td>GraphPad Prism 6</td><td></td></tr><tr><td>Endoglin capture antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB10972</td><td></td></tr><tr><td>Endoglin proteïne</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1097-EN</td><td></td></tr><tr><td>Endoglin detectie antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BAF1097</td><td></td></tr><tr><td>IL-6a (zie Tabel 1)</td><td>R&amp;D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6b (zie Tabel 1)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

snap chip voor cross-country-reactivity-gratis en spotter-gratis multiplexed sandwich-immunoassay

Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays

Multiplexed eiwit analyse blijkt superieur diagnostische gevoeligheid en nauwkeurigheid in vergelijking met enkele eiwitten. Het antilichaam microarrays is voorzien van duizenden micro-schaal immunoassay gelijktijdig uitgevoerd op een enkele chip. Sandwich assay formaat assay specificiteit verbetert door het detecteren van elke doelstelling met twee antilichamen, maar lijdt aan Kruisallergie tussen reagentia dus beperken hun multiplexing vermogens. Colocalization microarray (ACM) van de antilichaam is ontwikkeld voor cross-country-reactivity-vrije multiplexed eiwit detectie, maar vereist een dure spotter on-site voor microarray fabrikatie tijdens testen. In dit werk tonen we een module-chiptechnologie die reagens van microarray overbrengt-naar-microarray door eenvoudig uitlijnen twee chips samen, dat dus geen spotter is nodig tijdens de incubatie van de steekproef en de verdere toepassing van detectie van antistoffen (wat schar betreft) op opslag van vooraf gevlekte dia's, het prepareren van objectglaasjes uit assay uitvoering distantiëren. Beide een- en tweepersoonskamers overdracht methoden worden voorgesteld om nauwkeurige uitlijning tussen de twee microarrays en de fabricage van de dia voor beide methoden worden beschreven. Resultaten tonen aan dat &#60; 40 μm uitlijning is bereikt met dubbele overdracht, een dichtheid van de matrix van 625 vlekken/cm2te bereiken. Een 50-plexed-immunoassay verricht om aan te tonen van de bruikbaarheid van de chip module in multiplexed eiwit analyse. Detectiegrenzen van 35 eiwitten zijn in het bereik van pg/mL.

De test procedure voor zowel enkele als dubbele overdracht methoden is afgebeeld in Figuur 1. De cabines zijn bevlekt rechtstreeks op de dia assay in één overdracht, en de wat schar betreft zijn overgezet naar de dia assay van gebruik in een spiegel patroon van de cab-bestanden (Figuur 1a). Slechts één overdrachtprocedure is vereist, maar deze methode lijdt aan afwijking tussen de twee microarrays, voornamelijk veroorzaakt door d...

We tonen een module chiptechnologie voor het uitvoeren van cross-country-reactivity-vrije multiplexed sandwich-immunoassay door simpelweg twee dia's uitlijnen. Een apparaat module wordt gebruikt voor het op betrouwbare wijze overbrengen van reagentia van microarray-naar-microarray. De module-chip kan worden gebruikt voor alle biochemische reacties vereisen colocalization van verschillende reagentia zonder kruisbesmetting.

Snap Chip voor cross-country-reactivity-gratis en Spotter-gratis Multiplexed Sandwich-immunoassay

Multiplexed protein analysis has shown superior diagnostic sensitivity and accuracy compared to single proteins. Antibody microarrays allow for thousands ...

Het algemene doel van deze procedure is om meerdere eiwitten gelijktijdig op de chip te kwantificeren met behulp van sandwich-immunoassays op een manier zonder spotter, zonder kruisreactiviteit tussen reagentia. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de kwantitatieve proteomics, zoals de ontdekking en validatie van kandidaat-eiwitbiomarkers bij kanker. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat er geen kruisreactiviteit is tussen antilichamen en antigenen in gemultiplexte sandwich-assays en dat gebruikers geen complexe microarray-spotter nodig hebben.Heidi Larkin, wetenschappelijk directeur bij Parallex BioAssays, zal de procedure demonstreren. Om te beginnen met het prepareren van slides voor de single-transfer methode, fixeert u een nieuwe transferslide op het dek van de inkjet microarray spotter. Breng met behulp van een polystyreen microbead-oplossing, of 30% glycerol, een array van uitlijningsmarkeringen aan op de rand van de slide.Maak met de software van het instrument en de spottercamera een foto van de uitlijningsmarkeringen voor kwaliteitscontrole. Bevestig vervolgens een nitrocellulose- of gefunctionaliseerde glazen assay-dia links van de transferdia op het deck van een inkjet-microarray-spotter. Spot met behulp van de uitlijningsmarkeringen 24 arrays van capture-antilichaamoplossingen met een hart-op-hartafstand van 400 micrometer.Incubeer de assay-slide gedurende één uur bij kamertemperatuur in een atmosfeer met 60% relatieve vochtigheid. Bevestig vervolgens een 24-well siliconen gasket op de slide, uitgelijnd met de arrays. Pipetteer 80 µL van een 0,1% oplossing van polysorbate 20 in PBS in elke well.Schud de slide 5 minuten lang op 450 rpm en gooi de oplossing weg. Was de slide op deze manier drie keer. Breng vervolgens 80 µL BSA-vrije blokkeringsoplossing aan in elke gespoelde put.Schud de slide gedurende één uur op 450 rpm. Gooi vervolgens de oplossing weg, verwijder de siliconen pakking en droog de assay-slide met stikstofgas of in een centrifuge. Verzegel de assay-slide in een luchtdichte zak met silicagel of een ander droogmiddel en bewaar deze bij min 20 graden Celsius.Gebruik dezelfde uitlijningsmarkeringen om 24 arrays van detectieantilichaamoplossingen te spotten, met 3,2 nanoliters per spot en een hart-op-hartafstand van 400 micrometer. Bewaar de transferslide bij minus 20 graden Celsius in een verzegelde zak met een droogmiddel. Om te beginnen met het voorbereiden van slides voor de double-transfer methode, fixeer een transferslide op het deck van een ink jet microarray spotter.Spot 24 arrays van capture-antilichaamoplossingen met een hart-op-hartafstand van 400 micrometers. Draai vervolgens de zuigeronderbrekers van het snap-apparaat 90 graden om de zuigers in de open positie te vergrendelen. Plaats de capture-transferslide in het apparaat met de afgeknipt hoek tegen de vaste pogo-pin.Zet de pogo-pinnen vrij door de bijbehorende plunjer-schakelaars 90 graden terug te draaien. Controleer of de transferslide stevig door de pogo-pinnen wordt vastgehouden en vlak aansluit op de vaste uitlijnpennetjes. Plaats vervolgens een nieuwe nitrocellulose- of gefunctionaliseerde glazen slide op de pogo-pinnen met de gecoate zijde naar beneden.Zet de overige drie schakelaars om om de rechte pinnen vrij te geven. Controleer of beide schuiven op hun plaats tegen de vaste uitlijn pinnen worden gehouden. Plaats vervolgens de bovenste behuizing op de schuifhouder, zodanig dat de zuil in de uitlijngaten rust.Plaats het gesloten apparaat in de snap-kooi en druk de sluitflap volledig in. Laat het apparaat één minuut gesloten blijven. Trek vervolgens aan de sluitflap om het apparaat uit de kooi te halen.Verwijder de bovenste schaal en scheid de assay- en transfersdia's. Incubeer de assay-dia gedurende één uur. Bevestig vervolgens een silicone pakking voor 24 putjes aan de dia en was de dia drie keer.Schud de slide vervolgens gedurende één uur met BSA-vrije blokkeringsoplossing. Verwijder de pakking en droog de assay-slide onder een stroom stikstofgas of in een centrifuge. Bevestig daarna een andere transferslide op het deck van de inkjet spotter.Spot 24 arrays van detectieantilichaamoplossingen op de slide met 3,2 nanoliters per spot en een hart-op-hart afstand van 400 micrometers om de transferslide te maken. Bewaar de detectie-transferslide bij minus 20 graden Celsius. Om de immunoassay te starten, haal je de voorbereide assay-slide uit de vriezer en laat je deze 30 minuten lang opkamertemperatuur komen in de verzegelde zak.Bereid zeven serieel verdunde oplossingen van eiwitten in PBS met 0,05% polysorbate 20. Bereid passend verdunde monsteroplossingen in dezelfde buffer. Klem een siliconen pakking voor 24 putjes op de assay-dia op kamertemperatuur.Laad de zeven eiwitverdunningen in zeven van de acht putjes in een kolom. Laad eiwitvrije PBS met 0,05% polysorbate 20 in het laatste putje van die kolom. Laad de monsteroplossingen in de overige putjes.Schud de objectglaasjes gedurende één uur bij 450 rpm op kamertemperatuur of gedurende de nacht bij 4 graden Celsius. Was het objectglas vervolgens drie keer. Verwijder de pakking en droog het objectglas onder een stroom nitrogengas.Laat vervolgens de transferdia van het detectieantilichaam 30 minuten lang in de verzegelde zak opwarmen tot kamertemperatuur. Incubeer de dia's daarna 20 minuten in een gesloten kamer met een relatieve luchtvochtigheid van 60% om de arrays te rehydrateren. Gebruik de pogo-pinnen om de transferdia van de detectie met de voorkant naar boven in het snap-apparaat vast te zetten.Plaats de assay-dia met de voorkant naar beneden op de pogo-pinnen en richt de dia uit met de rechte pinnen. Sluit het apparaat en transfer de detectieantilichamen via een snap-transfer naar de assay-dia. Verwijder de dia's uit het apparaat en incubeer de assay-dia gedurende één uur.Klem een siliconen pakking met 24 putjes op het objectglas en was het objectglas drie keer. Voeg vervolgens in elk putje 80 µL toe van een 2,5 µg/mL oplossing van streptavidine fluoro-4 in PBS. Schud het objectglas gedurende 20 minuten bij 450 rpm.Was de objectglas drie keer met een 0,1% oplossing van polysorbate 20 in PBS en één keer met gedestilleerd water. Verwijder vervolgens de pakking en droog het objectglas. Scan het objectglas met een fluorescentiescanner en meet de intensiteiten van de spots.Bepaal de detectielimieten in de eiwitconcentraties. Twee fluorescerende eiwitten werden sequentieel gepatroneerd op een nitrocellulose-gecoate slide met behulp van de dubbele-transfermethode met een template van 16 putjes. Er werd geen kruiscontaminatie waargenomen bij de overdracht van het tweede fluorescerende eiwit.Kleinere spots met een verkorte spot-tot-spotafstand kunnen worden overgebracht naar een glasplaat met een sterk hydrofoob oppervlak. De double-transfermethode resulteerde in een minimale hoekafwijking van de arrays. De double-transfermethode werd gebruikt om een 50-plex immunoassay van borstkanker-gerelateerde eiwitten uit te voeren in het sandwich-assayformaat.Er werd geen kruisreactiviteit waargenomen, waardoor elk antilichaarpair onafhankelijk geoptimaliseerd kon worden. Standaardcurven berekend uit de assays gaven aan dat 35 van de 50 eiwitten detectielimieten in picogram per milliliter hadden. Eenmaal beheerst kan deze techniek in ongeveer drie uur worden voltooid.Deze techniek stelt wetenschappers in staat om microarray-gebaseerde assays uit te voeren en reagentia als nanodruppels toe te dienen. Denk er tijdens deze procedure aan om de slides correct te bevestigen op het spotting-dek en in het snap-apparaat. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in het gebruik van het snap-apparaat voor gemultiplexte sandwich-immunoassays zonder kruisreactiviteit.

snap-chip-for-cross-reactivity-free-spotter-free-multiplexed-sandwich

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Kwantitatieve, high-throughput, real-time, en label-free biomoleculaire detectie (DNA, eiwitten, enz.) op...

Biomoleculaire Detectie gebruik de interferometrische reflectie Imaging Sensor (IRIS)

Een ELISA kan gemakkelijk worden omgezet Luminex xMAP assay en door de voordelen van multiplexing verschillende antilichamen tegelijkertijd worden gescreend voor een optimale antilichaam paar identificeren resulteert in een verhoogde gevoeligheid en dynamisch bereik, met minder kosten assay.

Omzetting van een Capture ELISA aan een Luminex xMAP test met behulp van een Multiplex Antilichaam screeningsmethode

The video showcases the implementation of snap chip technology for cross-reactivity-free multiplexed sandwich immunoassays. The simple action of snapping two microarray slides, each containing different reagents, ensures reagent transfer without cross-contamination and helps to detect multiple proteins using sandwich immunoassay.

A Snap Chip Technology for a Cross-Reactivity-Free Multiplexed Sandwich Immunoassay

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

In het huidige klimaat van schaarse middelen, ontstaan er nieuwe technologieën die het onderzoekers mogelijk maken om studies goedkoper, sneller en met meer precisie uit te voeren. Hier beschrijven we de ontwikkeling van een kralen-gebaseerde speekselantilichaam multiplex immunoassay om de blootstelling van mensen aan meerdere omgevingspathogenen gelijktijdig te meten.

Het ontwikkelen van een Speeksel Antibody Multiplex Immunoassay menselijke blootstelling aan Environmental Pathogens Meet

De aanwezigheid van cyanobacteriëntoxines in zoetwaterreservoirs voor menselijke consumptie is een grote zorg voor waterbeheerautoriteiten. Om het risico van waterverontreiniging te evalueren, beschrijft dit artikel een protocol voor de detectie op locatie van cyanobacteriënstammen in vloeibare en vaste monsters door gebruik te maken van een antilichaam-microarray-chip.

Experimenteel protocol voor het opsporen Cyanobacteriën In vloeibare en vaste monsters met een antilichaam Microarray Chip

Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Een stroomanalysesysteem voor op kralen gebaseerde multiplexed-assays dat een twee-reporter-uitlezing biedt, werd gebruikt voor de ontwikkeling van multiplex serologische en antilichaamneutralisatietests die tegelijkertijd neutraliserende IgG- en IgM-antilichamen voor SARS-CoV-2 kunnen meten.

Een Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG en IgM SARS-CoV-2 Neutralisatie assay voor een Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Dit artikel stelt een nieuwe generatie multiparametrische analytische platforms voor met een verhoogde doorvoer voor de karakterisering van extracellulaire vesikelsubsets. De methode is gebaseerd op een combinatie van multiplexed biosensing-methoden met metrologische en morfomechanische analyses door atomaire krachtmicroscopie, gekoppeld aan Raman-spectroscopie, om vesiculaire doelen te kwalificeren die vastzitten op een microarray-biochip.

Multimodaal analytisch platform op een multiplexed surface plasmon resonance imaging chip voor de analyse van extracellulaire vesikel subsets

Multiplexed barcoding beeldanalyse heeft onlangs de karakterisering van de tumormicro-omgeving verbeterd, waardoor uitgebreide studies van celsamenstelling, functionele toestand en cel-celinteracties mogelijk zijn. Hierin beschrijven we een kleurings- en beeldvormingsprotocol met behulp van de barcodering van oligonucleotide-geconjugeerde antilichamen en cyclusbeeldvorming, waardoor het gebruik van een hoogdimensionale beeldanalysetechniek mogelijk is.

Multiplexed Barcoding beeldanalyse voor immunoprofiling en ruimtelijke kartering in de eencellige analyse van paraffineweefselmonsters

Leer de snap chip-technologie voor kruisreactiviteitvrije multiplex sandwich-immunoassays zonder spotter. Deze methode maakt gelijktijdige kwantificering van meerdere eiwitten mogelijk voor biomarkeronderzoek in kanker.

Snap Chip voor cross-country-reactivity-gratis en Spotter-gratis Multiplexed Sandwich-immunoassay

Meer video's verkennen