Techniek van minimaal invasieve dwarse aorta vernauwing in muizen voor inductie van links ventriculaire hypertrofie
25 september 2017
Het doel van dit protocol is te beschrijven stap voor stap de techniek van minimaal invasieve dwarse aorta vernauwing (TAC) in muizen. Door eliminatie van intubatie en ventilatie die verplicht is voor de gebruikte standaardprocedure zijn, minimaal invasieve TAC vereenvoudigt de operatieve procedure en vermindert de stam het dier op te zetten.
Het algemene doel van dit protocol is om minimaal invasieve transversale aortavernauwing bij muizen te realiseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over het implementeren van transversale aortavernauwing bij muizen, zoals hoe je een doorgang onder de aortaboog kunt maken. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze eenvoudig, gebruiksvriendelijk is en dat het de noodzaak elimineert om de muizen te intuberen en te beademen.
Ik zal de procedure demonstreren met onze postdoc Simona Nemska die de voorbereidende diervoorbereiding en postoperatieve surveillance zal uitvoeren. Op de dag van de procedure scheer je de nek en borst van een geanesthetiseerde muis en desinfecteer je de blootgestelde huid met 70%ethanol. Na bevestiging van de juiste sedatieniveau door een teenpriktjes, zet je het dier in de rugligging op een schone kurken werkpad vast.
Gebruik vervolgens een mesje nummer 11 om een longitudinale middenlijnsnede van 10 millimeter in de hals te maken vanaf de suprasternale inkeping tot het midden van de borst om het borstbeen bloot te leggen. Gebruik een Crile-Wood naaldhouder om een 4-0 monofilament polypropyleen verblijfsnaad door te voeren om de schildklier terug te trekken. En maak de naad vast aan het werkpad met tape.
Beweeg vervolgens het werkpad onder een operatiemicroscoop en gebruik microchirurgische pincetten om de pretracheale spieren op een stompe manier te scheiden om de luchtpijp bloot te leggen. Schuif voorzichtig de gesloten uiteinden van een paar gebogen microchirurgische pincetten over de luchtpijp en achter het borstbeen en open en sluit voorzichtig de gebogen pincetten om de pleura op een stompe manier te dissecteren. Gebruik de rechte microchirurgische pincetten om de rechter supraclaviculaire spieren vast te pakken en lichtjes aan het borstbeen te trekken.
Schuif het onderste uiteinde van de botknipper onder het borstbeen en voer een gedeeltelijke sternotomie van drie tot vier millimeter uit, waarbij de onderkant van de mini-sternotomie lichtjes naar links wordt geleid. Gebruik een microchirurgische naaldhouder om een 7-0 monofilament polypropyleen verblijfsnaad door te voeren van binnen naar buiten van de tweede intercostale ruimte aan elke kant van de mini-sternotomie. Gebruik 7-0 monofilament polypropyleen verblijfsnaden om de sternale randen aan elke kant uit elkaar te spreiden.
En gebruik de gebogen pincetten om de pretracheale spieren, mediastinale vet en thymus voorzichtig opzij te bewegen om de aortaboog onder lage vergroting zichtbaar te maken. Om het zachte weefsel onder de aortaboog bloot te leggen, steek je een bindingspincet onder de boog met de punten gesloten en open je voorzichtig de pincet. Gebruik een tweede bindpincet om een tunnel in het zachte weefsel onder de aortaboog te maken door de pincet voorzichtig open en dicht te doen in het zachte weefsel.
Ga vervolgens met een 6-0 zijden ligatuur door het oog van een ligatiehulpmiddel onder de aortaboog, gebruik een bindpincet om de naald terug te halen tussen de oorsprong van de rechter innominaat en de linker gemeenschappelijke halsslagader. De meest moeilijke stap van de procedure is het inbrengen van de naald onder de aortaboog. Voldoende zorgvuldigheid bij het maken van de tunnel onder de boog zal het plaatsen van de naald daarna makkelijker maken.
Gebruik nu de rechte pincetten om een stompe 27 gauge naald naast de aortaboog te plaatsen en gebruik de twee bindpincetten om de naald stevig om de naald en de aorta tussen de rechter innominaat en de linker gemeenschappelijke halsslagader te binden. Wanneer de naald is vastgezet, verwijder je de naald snel maar voorzichtig om een vernauwing van 0,4 millimeter in diameter en een reproduceerbare transversale 65 tot 70% aortavernauwing te bereiken. Na bevestiging van hemostase, verwijder je de 7-0 monofilament polypropyleen verblijfsnaden die zijn gebruikt om de sternale randen uit elkaar te spreiden.
Gebruik een microchirurgische naaldhouder om een eenvoudige 6-0 monofilament polypropyleen naad door te voeren van buiten naar binnen van de linker tweede intercostale ruimte en van binnen naar buiten van de rechter tweede intercostale ruimte. Gebruik de Crile-Wood naaldhouder om de sternale randen samen te brengen met een 6-0 monofilament polypropyleen naad. En sluit de huid met een 5-0 monofilament polypropyleen loopnaad in één laag met een Crile-Wood naaldhouder.
Plaats vervolgens het dier terug in zijn kooi in rugligging onder opwarming met monitoring tot volledige herstel. De effectiviteit van de inductie van linkerventrikelhypertrofie kan worden gevalideerd door de verhoudingen hartgewicht tot lichaamsgewicht van de sham-dieren te vergelijken met die van de experimentele dieren op dag drie, zeven, 14 en 28 na de operatie. De verhouding neemt significant toe bij de gebandeerde dieren in vergelijking met de sham-groepen vanaf de zevende postoperatieve dag, en blijft significant hoger bij de beperkte dieren tot dag 28 na de operatie.
De waargenomen toename in de verhouding hartgewicht tot lichaamsgewicht is uitsluitend te wijten aan een stijging van de verhouding lichaamsgewicht van het linker ventrikel, aangezien de verhouding lichaamsgewicht van het rechter ventrikel vergelijkbaar blijft tussen de transversale aortavernauwing en de sham-behandelde dieren gedurende de gehele observatieperiode. Bovendien is de mRNA-expressie van het hersen-natriuretisch peptide, een positieve controle voor harthypertrofie in de linker ventrikels, significant hoger bij de gebandeerde aortadieren in vergelijking met de controle sham-behandelde dieren op dag 14, wat verder de efficiëntie van de techniek valideert. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 20 minuten worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.
Wanneer je deze procedure probeert, is het belangrijk om een ligatiehulpmiddel en bindpincetten te gebruiken die vergelijkbaar zijn met die welke in ons protocol worden gebruikt. Na de ontwikkeling ervan, bood deze techniek een betrouwbaar en vereenvoudigd model voor het onderzoeken van de mechanismen die betrokken zijn bij de ontstaanswijze van door drukoverbelasting geïnduceerde linkerventrikelhypertrofie. Na het bekijken van deze video, zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je minimaal invasieve transversale aortavernau
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een minimaal invasieve techniek voor het uitvoeren van transversale aortaconstrictie (TAC) bij muizen. Door intubatie en ventilatie te vermijden, vereenvoudigt deze methode de procedure en wordt de stress voor de dieren geminimaliseerd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Cardiovasculair onderzoek
- Diermodellen
- Minimaal invasieve chirurgische technieken
Achtergrond
- Transversale aortaconstrictie is een veelgebruikt model voor het bestuderen van hartaandoeningen.
- Traditionele methoden vereisen intubatie en ventilatie, wat stressvol kan zijn voor het dier.
- Minimaal invasieve benaderingen zijn erop gericht deze stress te verminderen terwijl de experimentele integriteit behouden blijft.
- Dit protocol biedt een vereenvoudigde benadering voor TAC bij muizen.
Doel van de studie
- Om een gebruiksvriendelijke methode vast te stellen voor het uitvoeren van TAC bij muizen.
- Om de noodzaak van intubatie en ventilatie tijdens de procedure weg te nemen.
- Om onderzoek naar cardiovasculaire aandoeningen op een minder invasieve manier te faciliteren.
Gebruikte methoden
- De voorbereiding van de muis omvat het scheren en desinfecteren van de nek en de borst.
- Bevestiging van de sedatieniveau door middel van een teenknijptest.
- Het vastzetten van de muis in rugligging op een schone onderlegger.
- Demonstratie van de chirurgische procedure door getraind personeel.
Belangrijkste resultaten
- De techniek vermindert met succes de stress die gepaard gaat met traditionele TAC-methoden.
- De postoperatieve bewaking is vereenvoudigd, wat het dierenwelzijn verbetert.
- Aangetoond gebruiksgemak voor onderzoekers.
- Faciliteert verdere studies naar cardiovasculaire aandoeningen.
Conclusies
- Minimaal invasieve TAC is een levensvatbaar alternatief voor traditionele methoden.
- Deze benadering kan de kwaliteit van het onderzoek verbeteren en tegelijkertijd het dierenwelzijn waarborgen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze techniek om diverse cardiovasculaire aandoeningen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol biedt een vereenvoudigde, minimaal invasieve methode voor het induceren van linkerventrikele hypertrofie bij muizen, wat tegemoetkomt aan de behoefte aan efficiënte en stressarme preklinische modellen voor de ontdekking van cardiovasculaire geneesmiddelen. Door het elimineren van intubatie en ventilatie vermindert de techniek de procedurele complexiteit en de belasting voor het dier, wat een hogere doorvoer en een verbeterd welzijn bij validatiestudies van targets ondersteunt. Het model maakt een betrouwbare beoordeling mogelijk van therapeutische kandidaten die gericht zijn op cardiale remodellering geïnduceerd door drukoverbelasting, waardoor vroege mechanistische risicoreductie in de discovery-pipeline wordt gefaciliteerd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken in modellen van linkerventrikeelhypertrofie geïnduceerd door drukoverbelasting.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door middel van reproduceerbare inductie van cardiale hypertrofie met een lage mortaliteit.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in targets door het valideren van moleculaire markers, zoals de upregulatie van BNP als reactie op aortaconstrictie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound screening door het vestigen van consistente LVH-fenotypes.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays door middel van een gestandaardiseerde chirurgische techniek en kwantificeerbare hart-lichaamsgewichtverhoudingen.
- Schaalbaarheid: Maakt hergebruik van het platform mogelijk vanwege de korte proceduretijd (20 minuten) en minimale vereisten aan apparatuur.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers via een significante opregulatie van BNP mRNA bij geconstringeerde dieren.
- Operationele waarde: Garandeert continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie met aanhoudende LVH van dag 7 tot dag 28 na de operatie.
- Risicobeperking: Informeert beslissingen over risico-gecorrigeerde voortgang door het modelleren van ziekteprogressie die relevant is voor menselijk hartfalen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode integreert in het continuüm van ontdekkingen, van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische werkzaamheidstests, en biedt een ziekterellevant systeem voor mechanistische studies naar cardiale hypertrofie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van signaalpaden bij cardiovasculaire mechanismen van drukoverbelasting.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via reproduceerbare LVH-inductie en kwantificeerbare fenotypische read-outs.
- Analytica: Maakt kwantitatieve vergelijking mogelijk via de hart-lichaamsgewichtratio en moleculaire biomarkers tussen experimentele groepen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door middel van een aanhoudende hypertrofische respons en biomarker-validatie.
- Bedrijfsmatige hergebruikbaarheid: Fungeert als een herbruikbaar model voor cardiovasculaire pathologie vanwege de eenvoud, lage kosten en hoge efficiëntie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in pathways voor cardiale hypertrofie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van chirurgische inductie over verschillende onderzoekslocaties.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium binnen cardiovasculaire programma's.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van de prestaties van gevalideerde ziektemodellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist microsurgische expertise en bekendheid met ligatuurhulpmiddelen en knoop tangen.
- Maakt stereomicroscopie en microsurgische instrumentatie noodzakelijk voor nauwkeurige manipulatie van de aortaboog.
- Vereist standaardisatie tussen teams wat betreft de plaatsing van hechtingen en de verificatie van de constrictie.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij verschillende muizenstammen of leeftijden buiten het gespecificeerde C57BL/6-model.
- Beperkt door de technische uitdaging om een betrouwbare passage onder de aortaboog te creëren, wat essentieel is voor de reproduceerbaarheid.
