Een methode voor het verkrijgen van seriële uiterst dunne secties van micro-organismen in transmissie-elektronenmicroscopie

Het algemene doel van deze procedure is om op een veilige en eenvoudige manier seriële ultradunne coupes te maken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de celbiologie door kwantitatieve en driedimensionale structurele informatie van een hele cel op elektronnmicroscopisch niveau te verschaffen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat seriële ultradunne coupes kunnen worden gemaakt zonder een duur apparaat, waarbij met deze methode beelden met een hoge resolutie kunnen worden verkregen.

Om deze procedure te starten, reinigt u het oppervlak van een glazen objectglas. Doop vervolgens de helft van het objectglas in een 1,5% Formvar-oplossing in de bovenste kolom van het Formvar-ondersteuningsfilmapparaat door de oplossing met lucht door de driewegkraan te persen met behulp van een rubberen balletje. Laat de oplossing uit de kolom lopen door de driewegkraan te openen en lucht te laten ontsnappen om de druk te verlagen.

Haal vervolgens het glazen objectglas uit het apparaat en laat dit aan de lucht drogen zodat er een film op het oppervlak van het objectglas wordt gevormd. Schraap de vier randen van de film op het objectglas af met een scheermesje. Blaas vervolgens op het objectglas om de scheiding van de film van het glas te vergemakkelijken en laat de film lossnijden door het objectglas langzaam onder een lage horizontale hoek in water te dompelen.

Schep vervolgens de Formvar-film uit het water met een geperforeerd aluminium rek. Om het monsterblok te trimmen met een ultrasoon trimmes en een scheermes onder een stereomicroscoop, moet eerst met een lichtmicroscoop worden gecontroleerd of er cellen op het oppervlak van het blok aanwezig zijn door de punt van het blok te observeren. Monteer daarna het monsterblok in de houder en plaats de houder op een trimtafel.

Trim de blokjes tot een afmeting van 0,7 bij 1,0 millimeter. Als de epoxyhars zeer hard is, trim dan eerst het blok met een ultrasoon trimmes en trim het blok vervolgens verder met een scheermesje. Snijd één schouder om de snijrichting aan te geven.

Om het monsterblok met een diamantmes met behulp van de microtoom te trimmen, plaatst u de klem van het monsterblok in de monsterhouder van de ultramicrotoom. Snijd het oppervlak van het blok met een diamanttrimmes. Plaats de snijkant van het diamantmes parallel aan het vlak van het monsterblok en snijd een minimale hoeveelheid van het monsteroppervlak weg om te voorkomen dat er monster verloren gaat.

Snijd de linkerzijde van het blok met het trimmes door de messenhouder 30 graden naar links te draaien. Deze zijde wordt de bovenzijde van het monster tijdens het seriële snijden. Snijd vervolgens het blokoppervlak op ongeveer 100 microns vanaf de linkerzijde van het specimen door de messenhouder 30 graden naar rechts te draaien.

Deze rand vormt de onderzijde van het preparaat bij seriële sectieering. Verwijder het trimmes en draai het preparaatblok 90 graden met de klok mee. Plaats een ultramicrotoommes in de messenhouder.

Stel het oppervlak van het preparaat en de mesrand zo in dat ze parallel aan elkaar staan, gebruikmakend van het grote gedeelte van het preparaatoppervlak. Breng vervolgens tape aan op de houder en de houderklem van de microtoom en snijd de tape af bij de grens. Neem de preparaathouder uit de microtoom en plaats deze onder de stereomicroscoop.

Snijd het grote deel van het monster af met een scheermesje, zodat het smalle deel overblijft waaruit de seriesneden worden verkregen. Maak de zijden van het monster adhesief door met een Pasteurpipet ongeveer 1 µL van een 0,5% Neopreenoplossing op het monster te druppelen dat gebruikt zal worden voor de seriesneden. Bedek vervolgens het gehele monster met de Neopreenoplossing. Absorbeer overtollige Neopreenoplossing onmiddellijk met een stuk filterpapier dat dicht bij het monster wordt geplaatst.

Bereid vervolgens drie slit-grids voor om seriële coupes op te vangen. Buig hiervoor het handvat van de grids in een hoek van 60 graden en behandel de grids met een 0,5% Neopreen-oplossing. Maak de grids daarna hydrofiel middels glow discharge.

Plaats de specimenblokhouder terug in de microtoom op dezelfde positie door de gemarkeerde delen uit te lijnen. Dit zorgt ervoor dat het blokoppervlak en de snijrand van het mes perfect parallel aan elkaar blijven. Breng vervolgens het mes dicht bij het specimen.

Nadat het mesbootje met water is gevuld, wordt de ultramicrotoom afgedekt met een plastic kap om luchtstroom te voorkomen. Begin met het snijden van het monster bij een sectiedikte van 200 nanometers. Nadat de eerste sectie is gesneden, wordt de sectiedikte ingesteld op 70 nanometers.

Wanneer het aantal seriesneden 20 bereikt, stelt u de snededikte in op 10 nanometers. Aangezien de microtoom geen coupes van 10 nanometer dikte kan snijden, verschijnt er geen nieuwe coupe en raken de eerder gesneden coupes gescheiden van de mesrand. Stel vervolgens de snededikte in op 60 nanometers.

Dit zal coupes van 70 nanometer opleveren, omdat de machine de voorgaande dikte van 10 nanometer toevoegt. Stel ten slotte de coupedikte opnieuw in op 70 nanometers en ga door met snijden totdat coupes van 1,8 millimeter lang zijn verkregen. Om de seriële coupes op te vangen, plaatst u eerst de coupeslus op de derde coupesgroep.

Plaats vervolgens de lus voor het verhogen van het wateroppervlak op de messtage. Positioneer de lus van de WSRL vlak boven de seriesneden door de schacht en het handvat te bewegen. Laat de lus van de WSRL op het wateroppervlak zakken, zodat de lus de secties omsluit.

Duw de lus naar beneden door de schroef naar beneden te draaien, zodat het wateroppervlak door oppervlaktespanning stijgt. Verplaats het coupesnijvlak naar het midden van de lus. Positioneer het op de top van het water en pas de richting van het coupesnijvlak aan met behulp van een haarstreng.

Pak de sectiegroepen op door ze aan te raken met een onbedekt slit-grid, waarbij pincetten worden gebruikt en het grid parallel aan het wateroppervlak wordt gehouden. Plaats de grids met secties, samen met een kleine druppel water, op de Formvar-ondersteuningsfilm. Verwijder overtollig water met filterpapier.

Nadat de secties volledig zijn opgedroogd, scheurt u de Formvar-folie rondom de roosters en verwijdert u de roosters met de secties. Plaats de roosters in de juiste volgorde in de groef van de kleurbuis en kleur de secties met uranylacetaat en loodcitraat. Plaats de vijf roosters in de juiste volgorde in de multi-specimen houder, waarbij de lange as van de sleuf van het rooster loodrecht op de as van de specimen houder wordt georiënteerd.

Fixeer het raster met rasterfixeermiddelen en plaats de monsterhouder in de transmissie-elektronenmicroscoop. Neem vervolgens foto's van de doelcellen en alle celsecties bij hoge vergroting. Hier wordt een overzicht bij lage vergroting getoond van vijf rasters met seriële secties.

18-25 coupes werden op één raster gemonteerd. Let op dat de coupes aan elkaar vastzitten en dezelfde dikte hebben. Hier worden seriële coupes van de pericarion-myogenese getoond.

De figuur toont 12 van de 67 volledige doorsneden. Er werd vastgesteld dat deze cel een groot nucleoïde heeft dat bestaat uit naakte DNA-vezels met een enkel nucleoïdaal membraan en endosymbionten die lijken op bacteriën, maar geen mitochondriën. Bijgevolg lijkt dit organisme een tussenliggende levensvorm te zijn die evolueert van prokaryoot naar eukaryoot.

Hier worden seriële coupes van Escherichia coli getoond. De figuur toont 12 volledige coupes. Opvallend is dat werd vastgesteld dat deze cel 21 700 ribosomen bevatte.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u seriële ultradunne coupes maakt. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in drie uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.