Een methode voor het verkrijgen van seriële uiterst dunne secties van micro-organismen in transmissie-elektronenmicroscopie

Het algemene doel van deze procedure is om veilig en eenvoudig seriële ultradunne secties te maken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celbiologie, door kwantitatieve en driedimensionale structurele informatie van een hele cel op elektronenmicroscopisch niveau te verschaffen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat seriële ultradunne secties kunnen worden gemaakt zonder een dure machine, en hoge resolutie beelden kunnen worden verkregen met deze methode.

Om deze procedure te beginnen, maak het oppervlak van een glazen plaat schoon. Dompel vervolgens de ene helft van de glazen plaat in 1,5% Formvar-oplossing in de bovenste kolom van het Formvar-ondersteuningsfilmtoestel door de oplossing met lucht door de driewegkraan te drukken met behulp van een rubberen bal. Laat de oplossing uit de kolom lopen door de driewegkraan te openen en lucht vrij te geven om de druk te verminderen.

Haal vervolgens de glazen plaat uit het apparaat en laat deze in de lucht drogen om een film op het oppervlak van de glazen plaat te vormen. Schraap de vier randen van de film op de glazen plaat af met een scheermes. Na het blazen op de plaat om de scheiding van de film van de plaat te vergemakkelijken, laat de film drijf door de glazen plaat langzaam onder een lage horizontale hoek in water te dompelen.

Neem vervolgens de Formvar-film uit het water op met een aluminium rek met gaten. Om het monsterblok te trimmen met een ultrasone trimmes en een scheermes onder een stereomicroscoop, zorg er eerst voor dat er cellen op het oppervlak van het blok zijn door de punt van het blok met een lichtmicroscoop te observeren. Monteer vervolgens het monsterblok in de klemklem en monteer de klemklem op een trimfase.

Trim de blokken tot een grootte van 0,7 bij 1,0 millimeter. Als de epoxyhars erg hard is, trim eerst de doos met een ultrasone trimmes en trim vervolgens het blok verder met een scheermes. Snijd een schouder om de snijdrichting te markeren.

Om het monsterblok met een diamantmes te trimmen met behulp van de microtoom, plaats de klemklem van het specimenblok in de klemklemhouder van de ultramicrotoom. Snijd het oppervlak van het blok met een diamant trimmes. Zet de diamantmesrand parallel aan het oppervlak van het specimenblok en snijd de minimale hoeveelheid monstersoppervlak om geen enkel monster te verliezen.

Snijd de linkerrand van het blok met het trimmes door de mesfase 30 graden naar links te draaien. Deze rand wordt de bovenzijde van het monster bij seriële secties. Snijd vervolgens het blokoppervlak op ongeveer 100 micron van de linkerrand van het monster door de mesfase 30 graden naar rechts te draaien.

Deze rand wordt de onderzijde van het monster bij seriële secties. Verwijder het trimmes en draai het monsterblok 90 graden met de klok mee. Zet een ultradun snijmes op de mesfase.

Stel het monstersoppervlak en de mesrand zo in dat ze parallel aan elkaar staan met behulp van het grote deel van het monstersoppervlak. Plak vervolgens tape op de klemklem en de klemklemhouder van de microtoom en snijd de tape bij de grens. Haal de monstersklemklem uit de microtoom en plaats deze onder de stereomicroscoop.

Snijd het grote deel van het monster af met een scheermes waarbij het slanke deel overblijft waaruit seriële secties zullen worden verkregen Maak de sectiezijden klevend door ongeveer één microliter 0,5% Neopreen-oplossing met een Pasteur-pipet op het monster te druppelen dat zal worden gebruikt voor seriële secties. Bedek vervolgens het hele monster met Neopreen-oplossing. Neem overtollig Neopreen-oplossing onmiddellijk op met een stuk filterpapier in de buurt van het monster.

Bereid vervolgens drie spleetroosters voor om seriële secties op te pakken. Om dit te doen, buig de hendel van de roosters tot 60 graden en behandel de roosters met 0,5% Neopreen-oplossing. Maak vervolgens de roosters hydrofiel door gloeischakeling.

Plaats de klemklem van het monsterblok terug in de microtoom op dezelfde positie door de getapete delen uit te lijnen. Dit houdt het blokoppervlak en de mesrand perfect parallel aan elkaar. Breng vervolgens het mes dicht bij het monster.

Nadat de mesboot met water is gevuld, bedek de microtoom met een plastic deksel om luchtstroom te voorkomen. Begin met het snijden van het monster op een sectiedikte van 200 nanometer. Nadat de eerste sectie is gesneden, stel de sectiedikte in op 70 nanometer.

Wanneer het aantal seriële secties 20 bereikt, stel de sectiedikte in op 10 nanometer. Omdat de microtoom geen secties van 10 nanometer dik kan snijden, verschijnt er geen nieuwe sectie en raken de eerder gesneden secties gescheiden van de mesrand. Stel vervolgens de sectiedikte in op 60 nanometer.

Dit zal 70 nanometer secties produceren omdat de machine de vorige dikte van 10 nanometer toevoegt. Stel tenslotte de sectiedikte terug in op 70 nanometer en blijf snijden totdat secties van 1,8 millimeter lang worden verkregen. Om de seriële secties op te pakken, plaats eerst de sectiehouderlus op de derde sectiegroep.

Plaats vervolgens de wateroppervlakteverhogend lus op de mesfase. Plaats de lus van de WSRL net boven de seriële secties door de schacht en het handvat te bewegen. Laat de lus van de WSRL op het wateroppervlak zakken zodat de lus de secties omcirkelt.

Duw de lus naar beneden door de schroef naar beneden te draaien, zodat het wateroppervlak door oppervlaktespanning wordt verhoogd. Verplaats de sectie naar het midden van de lus. Plaats het op de top van het water en pas de richting van de sectie aan door een haarlokaal te gebruiken.

Pak sectiegroepen op door het met een lege spleetrooster aan te raken, wat wordt geholpen door pincetten en parallel aan het wateroppervlak wordt gehouden. Plaats de roosters met secties samen met een kleine druppel water op de Formvar-ondersteuningsfilm. Verwijder overtollig water met filterpapier.

Nadat de secties