Mitochondriale Ca2 + retentie capaciteit Assay en Ca2 +-mitochondriale zwelling Assay geactiveerd
1 mei 2018
Dit protocol is gericht op het beschrijven van een methode om te onderzoeken of het Ca2 + retentie capaciteit en Ca2 +- geactiveerd mitochondriale zwelling van geïsoleerde mitochondria van SH-SY5Y cellen stapsgewijze.
Het algemene doel van dit experiment is om de mitochondriale calciumretentiecapaciteit te bepalen bij calcium-geïnduceerde mitochondriale zwelling. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in de studie van mitochondriale disfunctie, zoals abnormale energiemetabolisme. Het grote voordeel van deze techniek is dat het erg eenvoudig en effectief is.
Om te beginnen, zaai ongeveer drie miljoen SH-SY5Y-cellen per 10 centimeter celcultuurschaal. Verwijder het medium en was de cellen met ongeveer één milliliter ijskoud PBS in een 10 centimeter celcultuurschaal drie keer. Voeg één milliliter ijskoud PBS toe aan de 10 centimeter celcultuurschaal en schraap de aderente cellen in een nieuwe 1,5 milliliter buisje.
Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 800 keer G op vier graden Celsius. Tijdens de centrifugatie, bereid vijf milliliter mitochondriale isolatiebuffer voor, aangevuld met 50 microliter proteaseremmer stockoplossing. Verwijder de supernatant en suspendeer de pellet met één milliliter mitochondriale isolatiebuffer.
Incubeer het 1,5 milliliter buisje op ijs gedurende 30 minuten. Lyse vervolgens de gesuspendeerde cellen met een glazen homogenisator, handmatig op en neer op ijs. Breng het homogenaat over in een 1,5 milliliter buisje.
Centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 1.000 keer G op vier graden Celsius om het puin te verwijderen. Na de centrifugatie, breng het supernatant over in een nieuw 1,5 milliliter buisje voordat het opnieuw wordt gecentrifugeerd zoals eerder. Na het overbrengen van het supernatant naar een nieuw buisje, centrifugeer gedurende 15 minuten bij 14.000 keer G op vier graden Celsius.
Verwijder de supernatant en suspendeer de pellet met mitochondriën met één milliliter mitochondriale isolatiebuffer. Centrifugeer vervolgens de oplossing gedurende 15 minuten bij 14.000 keer G en vier graden Celsius om de mitochondriën te precipiteren. De resulterende mitochondriale pellet moet op ijs worden bewaard en gesuspendeerd in 50 tot 100 microliter kaliumchloride media, volgens het pelletvolume voordat enige assay wordt uitgevoerd.
Gebruik ten slotte vijf microliter mitochondriale oplossing om de mitochondriale eiwitconcentratie te meten door middel van een standaard BCA-assay, waarbij OD562 wordt gemeten met behulp van een plate reader. Bereid het kaliumchloride media voor en voeg de calciumbindende groenfluorescente kleurstof toe tot een eindconcentratie van 0,5 micromolar voor het experiment. Om de mitochondriale calciumretentiecapaciteit te bepalen, breng eerst één milliliter geïsoleerde mitochondriën in kaliumchloride media met 0,5 micromolar calciumbindende groenfluorescente kleurstof over naar elke put van een zesputtenplaat.
Incubeer de mitochondriën en de calciumbindende groenfluorescente kleurstof in de zesputtenplaat op kamertemperatuur, beschermd tegen omgevingslicht gedurende één minuut. Voeg na incubatie vier microliter aliquots van de 20 millimolar calciumchloride-oplossing toe aan elke put van de zesputtenplaat met behulp van de automatische doseerinstelling om 200 nanomolen calcium per milligram mitochondriale eiwit te introduceren. Gebruik de fluorescentiespectrometer om de fluorescentie veranderingen elke drie seconden gedurende twee minuten te monitoren met een excitatiegolflengte van 506 nanometer en een emissiegolflengte van 531 nanometer.
De plaat is uitgerust met schudden bij 600 rpm gedurende drie seconden tussen de metingen, gecontroleerd door software. Voeg een extra vier microliter aliquot van 20 millimolar calciumchloride-oplossing toe aan elke put, en monitor vervolgens de fluorescentie veranderingen elke drie seconden gedurende twee minuten. Om calcium-geïnduceerde mitochondriale zwelling te bepalen, breng één milliliter geïsoleerde mitochondriën in kaliumchloride media over naar elke put van een zesputtenplaat.
Voeg vervolgens 10 microliter 20 millimolar calciumchloride waterige oplossing toe aan het mitochondriale eiwit om mitochondriale zwelling te veroorzaken. Gebruik een microplaatlezer gecontroleerd door software om de afname in absorbantie elke drie seconden gedurende 10 minuten bij 540 nanometer te registreren. Representatieve resultaten van mitochondriale calciumretentiecapaciteit van bongkrekic, een remmer van de calcium-geïnduceerde mitochondriale permeabiliteitstransitiepoort, of MPTP, opening atractyloside, een activator van de calcium-geïnduceerde MPTP opening en een lege controle, worden hier getoond.
De capaciteit bij de bongkrekic behandeling is veel hoger dan de atractyloside groep, zoals verwacht. Representatieve resultaten van calcium-geïnduceerde mitochondriale zwelling van bongkrekic, atractyloside en de controle zonder behandeling worden hier getoond. De verminderde absorbantie die bij 540 nanometer wordt gemonitord, geeft de mitochondriale zwellingen aan.
De resultaten suggereren dat BKA de MPTP opening kan remmen, terwijl ATR de MPTP opening kan vergemakkelijken. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in vijf uur worden uitgevoerd als het goed wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om alle oplossingen op ijs te houden.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beschrijft een methode voor het onderzoeken van het Ca2+-retentievermogen en Ca2+-geïnduceerde mitochondriale zwelling in geïsoleerde mitochondriën van SH-SY5Y-cellen. Het protocol is gericht op het onderzoeken van mitochondriale dysfunctie en een abnormaal energiemetabolisme, wat cruciaal is voor het begrijpen van de cellulaire energetica.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Mitochondriale fysiologie
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- Mitochondriën spelen een cruciale rol in het cellulaire energiemetabolisme.
- Het begrijpen van de mitochondriale calciumretentie is essentieel voor het bestuderen van mitochondriale dysfunctie.
- Calcium-geïnduceerde mitochondriale zwelling kan de overleving en functie van cellen beïnvloeden.
- SH-SY5Y-cellen dienen als een nuttig model voor neuronale studies vanwege hun dopaminerge eigenschappen.
Doel van de studie
- Om de mitochondriale calciumretentiecapaciteit te beoordelen.
- Om de effecten van calcium op mitochondriale zwelling te evalueren.
- Om een eenvoudige methode te bieden voor het onderzoeken van de mitochondriale functionaliteit.
Gebruikte methoden
- Celcultuurmethodiek met SH-SY5Y-cellen.
- Isolatie van mitochondriën via centrifugatieprotocollen.
- Meting van de mitochondriale proteïneconcentratie met behulp van een BCA-assay.
- Fluorescentiespectroscopie om calciumretentie te monitoren en absorbentieveranderingen voor de beoordeling van zwelling.
- De geschatte duur van het experiment is vijf uur.
Belangrijkste resultaten
- De techniek onthulde differentiële calciumretentiecapaciteiten tussen de behandelingen.
- Bongkrekinezuur remde de opening van de MPTP significant, terwijl atractyloside deze bevorderde.
- Calcium-geïnduceerde zwelling werd gevolgd via absorbantiemetingen, wat duidt op mitochondriale responsen.
- De resultaten suggereren belangrijke implicaties voor het begrip van mitochondriale dynamiek in relatie tot calciumhomeostase.
Conclusies
- Deze studie biedt een waardevol protocol om mitochondriale calciumdynamiek te onderzoeken.
- Het stelt onderzoekers in staat om de mechanismen die ten grond liggen aan mitochondriale dysfunctie in verschillende contexten te begrijpen.
- De bevindingen kunnen implicaties hebben voor de neuronale gezondheid en ziektemodellen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Het beoordelen van de mitochondriale calciumhuishouding is cruciaal voor het verminderen van risico's bij de validatie van targets in programma's voor neurodegeneratieve en metabole ziekten. Deze assays leveren kwantitatieve, reproduceerbare resultaten van de activiteit van de mitochondriale permeabiliteitsovergangspore (mPTP), een sleutelmechanisme dat calciumdysregulatie koppelt aan celdood. Door snelle functionele screening mogelijk te maken van verbindingen die de mPTP moduleren, ondersteunen deze methoden vroege mechanistische risicoanalyse en verbeteren ze het voorspellende vertrouwen bij de selectie van lead-verbindingen.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen met betrekking tot mitochondriale dysfunctie in ziektemodellen.
- Wetenschappelijke waarde: Biedt functionele validatie van targets die betrokken zijn bij calciumhomeostase en mPTP-regulatie.
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door onderscheid te maken tussen inhibitoren en activatoren van mPTP-opening.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve fluorescentie- en absorbentiemetingen die geschikt zijn voor screeningformaten met een hoge aanpassingscapaciteit.
- Operationele waarde: Maakt assay-standaardisatie mogelijk met behulp van geïsoleerde mitochondriën en een gecontroleerde calciumflux.
- Operationele waarde: Ondersteunt hergebruik van het platform voor verschillende verbindingenbibliotheken en het testen van condities.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt het calciumretentievermogen aan ziekte-relevante mitochondriële fenotypes in neuronale modellen.
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door de functionele mPTP-activiteit te meten.
- Operationele waarde: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door mechanische risicoreductie van mitochondriële veiligheidsproblemen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assays passen binnen het discovery-continuüm, van targetvalidatie tot preklinische beoordeling, in het bijzonder voor programma's die gericht zijn op mitochondriële modulatoren of neuroprotectieve middelen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten van calcium-gemedieerde mitochondriale paden en functionele target engagement.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk met kwantitatieve real-time monitoring van calciumflux en zwellingkinetiek.
- Analytics: Genereert fluorescentie- en absorbentiemetingen die vergelijking van compound-effecten op de mPTP-drempel mogelijk maken.
- Translational Research: Verbindt met preklinische continuïteit door de mitochondriale functie te beoordelen in ziekte-relevante cellulaire modellen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor het evalueren van mitochondriale compound-effecten over meerdere projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij target-validatie door mechanistische ambiguïteit rondom de mPTP te verminderen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare resultaten middels detectie met een microplate-reader.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door risico's voor de mitochondriale veiligheid in een vroeg stadium te identificeren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van functionele mitochondriale data.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in mitochondriële isolatie en calciumflux-assays.
- Afhankelijk van toegang tot centrifuges, homogenisatoren en microplaatlezers met fluorescentie- en absorbentiecapaciteiten.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor mitochondriële preparatie en het laden van calciumkleurstoffen tussen teams.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij toepassing op verschillende celtypen of weefselbronnen.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de gevoeligheid van de mitochondriële preparatie voor temperatuur en timing.
