Name: Mitochondriale Ca2 + retentie capaciteit Assay en Ca2 +-mitochondriale zwelling Assay geactiveerd (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Leer de mitochondriale Ca2+ retentiecapaciteit en Ca2+-geïnduceerde mitochondriale zwelling meten in geïsoleerde mitochondriën uit SH-SY5Y-cellen. Deze eenvoudige methode helpt bij het onderzoeken van mitochondriale disfunctie en energiemetabolisme.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door subsidies verlenen van de uitstaande wetenschapper van Shandong (JQ201421) en de subsidie van NSFC (81371226).

1. isolatie van Mitochondria
Opmerking: Alle oplossingen en apparatuur moeten worden precooled op 0 - 4 ° C en op ijs.
<ol><li>Zaad ongeveer 3 x 106 SH-SY5Y cellen per 10 cm cel cultuur schotel. Cultuur cellen in hoge-glucose Dulbecco gewijzigd van Eagle medium met 10% foetale runderserum, penicilline (100 U/mL)-streptomycine (100 µg/mL). Handhaven bij 37 ° C in een broedstoof met 5% CO2 's nachts. Opmerking: ten minste 1-2 x 107 SH-SY5Y cellen zijn nodig voor elke isolatie assay.</li>
	<li>Verwijder het medium en de cellen met ongeveer 1 mL ijs koud PBS in een 10 cm schotel voor de cultuur van de cel 3 keer wassen.</li>
	<li>Voeg nieuwe 1 mL ijs koud PBS in 10 cm cel cultuur schotel en schraap de Adherente cellen in een nieuwe 1,5 mL-buis. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.</li>
	<li>Tijdens het centrifugeren, bereiden 5 mL mitochondriale isolatie buffer (250 mM sacharose, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic zuur), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) aangevuld met 50 μl van protease remmers voorraad oplossing (100 x concentratie; 1 EDTA-gratis tablet opgelost in 500 µL van ddH2O).</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 1 mL van mitochondriale isolatie buffer. Incubeer de 1,5 mL-buis op ijs gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Lyse de zwevende cellen met een glas homogenizer (15-25 strokes) op en neer handmatig op ijs. Opmerking: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen cellen worden gehomogeniseerd. Tellen de onbeschadigde cellen en bared kernen Microscoop visueel en bevestigen dat > 90% cel breuk is opgetreden.</li>
	<li>Breng het homogenaat in een tube 1,5 mL en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot het verwijderen van het puin (kernen en resterende intact cellen).</li>
	<li>Breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe 1,5 mL-buis en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min 4 ° C.</li>
	<li>Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis en centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 15 min 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met mitochondriën met 1 mL van mitochondriale isolatie buffer.</li>
	<li>Centrifugeer de oplossing gedurende 15 minuten staan bij 14.000 x g 4 ° C om het neerslaan van de mitochondriën.</li>
	<li>De resulterende mitochondriën pellet moet worden bewaard op ijs en geresuspendeerde in 50-100 μl KCl media (125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 5 mM glutamaat, 5 mM malate, en 2 μM rotenon, pH 7.4) volgens het volume van het pellet vóór elke kont ay.</li>
	<li>Gebruik 5 μL van mitochondriale oplossing om te meten de mitochondriale eiwitconcentratie door standaard BCA assay, OD562 meten met behulp van een plaat lezer13.</li>
</ol>2. bepaling van mitochondriale Ca2 + retentie capaciteit
<ol><li>Voorbereiden van de KCl-media en voeg de Ca2 +-groen fluorescente kleurstof binden aan een eindconcentratie van 0,5 μM voordat het experiment.</li>
	<li>1 ml van geïsoleerde mitochondriën (0,4 mg/mL) in KCl media met 0,5 μM Ca2 +-bindende groen fluorescente kleurstof in elke plaat 6-well goed.</li>
	<li>Incubeer de mitochondriën en het Ca2 +-bindende groen fluorescente kleurstof in de 6-well plaat bij kamertemperatuur beschermd tegen omgevingslicht voor 1 min. 4 toevoegen μL aliquots van een 20 mM CaCl2 oplossing (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 20 mM HEPES, 5 mM glutamaat, 5 mM-malaat, pH 7.4) aan elke plaat 6-well goed met behulp van de automatische instelling om 200 nmol Ca2 +/mg-mitochondriale eiwit afzien.</li>
	<li>Gebruik een fluorescentie spectrometer om te controleren de fluorescentie wijzigingen elke 3 s gedurende 2 minuten met een golflengte van excitatie van 506 nm en een golflengte van de emissie van 531 nm. De plaat is voorzien van schudden bij 600 omwentelingen per minuut voor 3 s tussen lezingen gecontroleerd door software (Figuur 1).</li>
	<li>Toevoegen van een extra 4 μL hoeveelheid 20 mM CaCl2 oplossing aan elk putje en controleren van de fluorescentie wijzigingen elke 3 s voor 2 min. Herhaal deze stap totdat de fluorescentie toeneemt met de tijd. Opmerking: De mitochondriën worden uitgedaagd met de toegevoegde Ca2 + aangegeven door de verhoogde opname fluorescentie. Wanneer de mPTP wordt geopend, wordt de fluorescentie met tijd verhoogt.</li>
	<li>Het interpreteren van het totale bedrag van Ca2 + toegevoegd totdat de mPTP wordt geopend als de Ca2 + retentie capaciteit.</li>
</ol>3. bepaling van Ca 2 +-geïnduceerde mitochondriale zwelling
<ol><li>Bereiden de KCl media voordat het experiment.<ol>
<li>Breng 1 mL van geïsoleerde mitochondriën (0,4 mg/mL) in KCl media in elke plaat 6-well goed.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 10 μL van 20 mM CaCl2 waterige oplossing (500 nmol/mg mitochondriale eiwit) in mitochondriale eiwitten mitochondriaal zwelling activeren.</li>
	<li>Opnemen van de afname van de absorptie bij 540 nm elke 3 s op een microplate-lezer gecontroleerd door software voor 10 min (Figuur 2). De fluorescentie veranderingen worden veroorzaakt door een toestroom van opgeloste stoffen over het mitochondriaal binnenste membraan. Opmerking: De verminderde absorptie bij 540 nm komt overeen met de gezwollen mitochondriën. Als de lezer niet dat een afname van de absorptie ziet doet, kan een langer interval lezen of lezen van tijd worden aangenomen.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+respiratory+stimulation%2C+accumulation+of+Ca%2B%2B+and+phosphate%2C+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li>
<li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+transport%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li>
<li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li>
<li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+ions+in+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li>
<li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium+and+cell+death%3A+a+deadly+triad+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li>
<li>Rajdev, S., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+green-5N%2C+a+novel+fluorescent+probe+for+monitoring+high+intracellular+free+Ca2%2B+concentrations+associated+with+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+rat+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons.</a> Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).</li>
<li>Stout, A. K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li>
<li>Bambrick, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin+A+increases+mitochondrial+calcium+uptake+capacity+in+cortical+astrocytes+but+not+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons.</a> J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).</li>
<li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-permeable+peptide+antioxidants+targeted+to+inner+mitochondrial+membrane+inhibit+mitochondrial+swelling%2C+oxidative+cell+death%2C+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury.</a> J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).</li>
<li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+free+calcium+levels+%28Rhod-2+fluorescence%29+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li>
<li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size%2C+flow+cytometric+parameters%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li>
<li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li>
<li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li>
<li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca%282%2B%29+transport+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li>
</ol>

X. zon onder toezicht van de experimenten. Wei Li de experimenten uitgevoerd. Chen Zhang en X. zon schreef het papier.

Hier, beschreven we een eenvoudige en effectieve protocol voor de mitochondriale Ca2 + retentie capaciteit assay en Ca2 +-mitochondriale zwelling assay geactiveerd.
Voor de mitochondriale isolatie, door ervoor te zorgen dat alle materialen en buizen op ijs, zijn met name wanneer de cellen homogenisatie. 0,25% trypsine-EDTA kan ook worden gebruikt om het loskoppelen van de cellen van de schotel voor 5 minuten bij 37 ° C. Na 15 tot 25 lijnen is het noodzakelijk om te observ...

Mitochondriën zijn de belangrijkste cellulaire organen te produceren bijna 95% van de ATP in de cellen van zoogdieren gebruikt door oxidatieve fosforylering. Het is gemeld dat de afgezonderd micromolar concentratie van Ca2 + door de mitochondriën, de aanwezigheid van ADP en anorganisch fosfaat kan worden gebruikt om phosphorylate ADP op1ATP synthese. Wanneer de concentratie van cytosolische Ca2 + boven een drempel gaat, mitochondriën kunnen opname Ca2 + snel en efflux het langzaam. Zo kunnen de functionerende mitochondriën toestroom de verhoogde cytosolische Ca2 +. Irrelevant voor de deelname aan de oxidatieve fosforylatie, de mitochondriale Ca2 + ook deelnemen aan de cytosolische calcium-signalen en het mechanisme van de mitochondriale apoptotic activeren door de opening van de mPTP in de binnenste mitochondriale inducerende membraan2. Het is algemeen erkend dat een abnormale verhoging van de intracellulaire Ca2 + mitochondriale enorme zwelling veroorzaken kan door het openen van de mPTP-3. Dus, dit protocol heeft tot doel te beoordelen van de mitochondriale functie door het kwantificeren van de mitochondriale Ca2 + retentie capaciteit en Ca2 +-trigged mitochondriale zwelling.
CA2 + retentie capaciteit is de meting van het vermogen van de mitochondriën om opname cytosolische calcium. Mitochondriën kunnen buffer het cytosolische vrij calcium en calcium-afhankelijke cellulaire processen regelen door opname van de calcium in de vorm van inactieve precipitaten. Verminderde Ca2 + retentie capaciteit treedt op in stress verschijnselen die is gekoppeld aan de beperking van de energie en zelfs neurodegeneratieve ziekten4,5. Geïsoleerde mitochondriën of digitonin-permeabel cellen kunnen worden gebruikt voor identificatie van de Ca2 + retentie capaciteit, en de verhoogde capaciteit om te accumuleren Ca2 + door geïsoleerde mitochondriën met de additonal glutamaat en malate wordt niet verricht door de mitochondriale isolatie procedure6. Een bepaalde hoeveelheid digitonin moet worden gebruikt om de permeabilize van de plasma-membranen van verschillende celtypes. Het hexapotassium zout van Ca2 +-bindende groen fluorescente kleurstof, een Ca2 +-gevoelige cel-impermeant zichtbaar licht-prikkelbaar indicator, gebruikte7is geweest. CA2 +-bindende groen fluorescente kleurstof is een indicator van de lage-affiniteit en gebruikt om te tonen dat intracellulaire gratis Ca2 + concentraties stijgen blijven tijdens langdurige (5 min) stimulaties8. Deze methode is minder gevoelig dan de radioactieve filter techniek maar werd sterk vereenvoudigd. De extra Ca2 + calcium groene fluorescentie verheft en de Ca2 + ICT door mitochondriën retourneert de fluorescentie op basislijn. Opeenvolgende toevoegingen van Ca2 + aangebracht totdat de mitochondriën niet opname extramitochondrial Ca2 + 9. Een fluorescentie microplate lezer kan worden gebruikt om voortdurend verslag de calcium groene fluorescentie.
Na Ca2 + accumulatie, mitochondriën depolarized, vrijgegeven Ca2 + in het medium, en begon te zwellen. CA2 +-mitochondriën zwelling wordt gebruikt om aan te geven van de opening van de mPTP geactiveerd. Elektronenmicroscopie en de daling lichtabsorptie bij 540 nm kan worden gebruikt voor het meten van de Ca2 +-geactiveerd mitochondriale zwelling10,11. Volume van de mitochondriën kan rechtstreeks worden bepaald door de voorwaartse hoek lichtverstrooiing12, waar de dalingen van de extinctie passieve zwelling van de mitochondriale matrix reflecteren.
Hier, we illustreren de methodologie te onderzoeken van de mitochondriale Ca2 + retentie capaciteit en Ca2 +-mitochondriale zwelling in geïsoleerde mitochondriën van de cellen van de SH-SY5Y geactiveerd.

<table><tbody><tr><td>SH-SY5Y cellijn</td><td>ATCC (The Global Bioresource Center)</td><td>ATCC Nummer: CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Calcium green-5N</td><td>Life Technologies</td><td>c-3737</td><td>Ca2+-bindende groen fluorescerende kleurstof</td></tr><tr><td>volledige proteaseremmers</td><td>Roche Molecular Biochemicals</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>glashomogenisator</td><td>Kimble Chase</td><td>9885303002</td><td></td></tr><tr><td>glutamaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES5063G-A7</td><td></td></tr><tr><td>malaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46940-U</td><td></td></tr><tr><td>rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>00457</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900050</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900266</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan flash instrumenten</td><td>Thermo Scientific</td><td>IC100E</td><td></td></tr><tr><td>Bongkrekate</td><td>Biovision</td><td>1820-100</td><td></td></tr><tr><td>atractylosid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4992</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos gemodificeerd Eagle-medium met hoge glucose</td><td>Hyclone</td><td>SH30022</td><td>4,5 g/L glucose, L-glutamine, zonder natriumpyruvaat</td></tr><tr><td>foetaal bovien serum</td><td>Hyclone</td><td>SV30087</td><td></td></tr><tr><td>penicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>11860-038</td><td></td></tr><tr><td>BCA-assaykit</td><td>Thermo Scientific</td><td>NCI3225CH</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>10 cm celkweekschaal</td><td>NEST</td><td>704001</td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondriale ca2 + retentie capaciteit assay en ca2 +-mitochondriale zwelling assay geactiveerd

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

De productie van ATP door oxidatieve fosforylatie is de primaire functie van de mitochondriën. Mitochondriën in hogere eukaryoten ook deelnemen aan cytosolische Ca2 + bufferen en de ATP productie in mitochondriale kan worden bemiddeld door intramitochondrial gratis Ca2 + concentratie. CA2 + retentie capaciteit kan worden beschouwd als het vermogen van de mitochondriën te behouden van calcium in de mitochondriale matrix. Geaccumuleerde intracellulaire Ca2 + leidt tot de doorlaatbaarheid van de innerlijke mitochondriale membraan, genoemd de opening van mitochondriale permeabiliteit overgang porie (mPTP), die leidt tot het weglekken van moleculen met een moleculair gewicht van minder dan 1,5 kDa. CA2 +-mitochondriën zwelling wordt gebruikt om aan te geven van de opening van de mPTP geactiveerd. Hier beschrijven we twee testen om te controleren de Ca2 + retentie capaciteit en Ca2 +-mitochondriale zwelling in geïsoleerde mitochondriën geactiveerd. Na bepaalde hoeveelheden van Ca2 + worden toegevoegd, kunnen alle stappen worden voltooid in één dag en geregistreerd door een microplate-lezer. Dus, deze twee eenvoudige en effectieve testen kunnen worden vastgesteld om te beoordelen de Ca2 +-mitochondriale functies.

De resultaten van de vertegenwoordiger van Ca2 + retentie capaciteit: Resultaten werden uitgedrukt als fluorescentie waarden. Met de extra pulsen van Ca2 + (200 nmols/mg mitochondriale eiwit), de fluorescentie stegen met dubbele boven basislijn met de opening van de mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), een inhibitor van de omwenteling van Ca2 +-geïnduceerde mPTP opening, of 1 μM atractyloside (ATR), een activator van Ca2 +-geïnduceerde mPTP...

Dit protocol is gericht op het beschrijven van een methode om te onderzoeken of het Ca2 + retentie capaciteit en Ca2 +- geactiveerd mitochondriale zwelling van geïsoleerde mitochondria van SH-SY5Y cellen stapsgewijze.

Mitochondriale Ca2 + retentie capaciteit Assay en Ca2 +-mitochondriale zwelling Assay geactiveerd

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Het algemene doel van dit experiment is het bepalen van de mitochondriale calciumretentiecapaciteit bij calcium-geïnduceerde mitochondriale zwelling. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de studie naar mitochondriale dysfunctie, zoals een abnormaal energiemetabolisme. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze zeer eenvoudig en effectief is.Begin met het uitplaten van ongeveer drie miljoen SH-SY5Y-cellen per celluulteelkenschaal van 10 centimeter. Verwijder het medium en was de cellen in de 10 centimeter celluulteelkenschaal drie keer met ongeveer één milliliter ijskoud PBS. Voeg één milliliter ijskoud PBS toe aan de 10 centimeter celluulteelkenschaal en schraap de adherente cellen in een nieuwe buis van 1,5 milliliter.Centrifugeer 10 minuten bij 800 ×g bij vier graden Celsius. Bereid tijdens het centrifugeren vijf milliliter mitochondriële isolatiebuffer, aangevuld met 50 µL protease-remmer stockoplossing. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in één milliliter mitochondriële isolatiebuffer.Incubeer de 1,5 milliliter buis 30 minuten op ijs. Lyse vervolgens de gesuspendeerde cellen met een glazen homogenisator door deze handmatig op en neer te bewegen op ijs. Breng het homogenaat over in een 1,5 milliliter buis.Centrifugeer vervolgens 5 minuten bij 1.000 ×g bij vier graden Celsius om het debris te verwijderen. Draai na de centrifugatie de supernatant over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter voordat u opnieuw centrifugeert zoals voorheen. Nadat de supernatant naar een nieuwe buis is overgebracht, centrifugeert u 15 minuten bij 14.000 ×g bij vier graden Celsius.Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet met mitochondria in één milliliter mitochondriale isolatiebuffer. Centrifugeer de oplossing vervolgens 15 minuten bij 14 000 ×g en 4 °C om de mitochondria neer te slaan. Het resulterende mitochondria-pellet moet op ijs worden bewaard en, afhankelijk van het pelletvolume vóór de assay, worden geresuspendeerd in 50 tot 100 µL kaliumchloride-medium.Gebruik tot slot vijf µL mitochondriale oplossing om de mitochondriale eiwitconcentratie te bepalen met een standaard BCA-assay, waarbij de OD562 wordt gemeten met een platenlezer. Bereid het kaliumchloridemedium voor en voeg de calciumbindende groene fluorescente kleurstof toe tot een eindconcentratie van 0,5 µM vóór het experiment. Om de mitochondriale calciumretentiecapaciteit te bepalen, brengt u eerst één mL geïsoleerde mitochondriën in kaliumchloridemedium dat 0,5 µM calciumbindende groene fluorescente kleurstof bevat over naar elke well van een zes-wells plaat.Incubeer de mitochondriën en de calciumbindende groene fluorescerende kleurstof in de zeswellsplaat bij kamertemperatuur, beschermd tegen omgevingslicht, gedurende één minuut. Voeg na incubatie aan elke well van de zeswellsplaat aliquots van 4 µL van de 20 mM calciumchloride-oplossing toe met de automatische doseerinstelling om 200 nmol calcium per mg mitochondriaal eiwit toe te voegen. Gebruik de fluorescentiespectrometer om de fluorescentieveranderingen elke drie seconden gedurende twee minuten te monitoren met een excitatiegolflengte van 506 nm en een emissiegolflengte van 531 nm.De plaat is uitgerust met een schudfunctie van 600 rpm gedurende drie seconden tussen de metingen, aangestuurd door software. Voeg een extra aliquot van 4 µL 20 mM calciumchloride-oplossing toe aan elke well en monitor vervolgens de fluorescentiewijzigingen elke drie seconden gedurende twee minuten. Om calcium-geïnduceerde mitochondriale zwelling te bepalen, wordt 1 mL geïsoleerde mitochondriën in kaliumchloride-medium overgebracht naar elke well van een six-well plaat.Voeg vervolgens 10 µL van een 20 mM waterige calciumchlorideoplossing toe aan het mitochondriale eiwit om mitochondriale zwelling te induceren. Registreer met een microplaatlezer, aangestuurd door software, de afname in absorbentie elke drie seconden gedurende 10 minuten bij 540 nm. Hier worden representatieve resultaten getoond van de mitochondriale calciumretentiecapaciteit van bongkrekic, een remmer van de calcium-geïnduceerde opening van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie (MPTP), atractyloside, een activator van de calcium-geïnduceerde MPTP-opening, en een blanco controle.De capaciteit bij de bongkrekic-behandeling is veel hoger dan bij de atractyloside-groep, zoals verwacht. Representatieve resultaten van calcium-geïnduceerde mitochondriale zwelling van bongkrekic, atractyloside en de onbehandelde controle worden hier getoond. De afname in absorbentie gemeten bij 540 nanometer duidt op de mitochondriale zwellingen.De resultaten suggereren dat BKA de opening van de MPTP kan remmen, terwijl ATR de opening van de MPTP kan faciliteren. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in vijf uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alle oplossingen op ijs moeten worden bewaard.

mitochondrial-ca2-retention-capacity-assay-ca2-triggered

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft een methode voor real-time meting van mitochondriale calcium fluxen door fluorescerende beeldvorming. De methode maakt gebruik van een circulair gepermuteerd YFP-gebaseerde dual-excitatie ratiometrische calcium sensor (ratiometrische pericam-mt) selectief, uitgedrukt in mitochondriën.

Monitoring dynamische veranderingen in het mitochondriaal calciumgehalte Tijdens Apoptosis Met behulp van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

Een spectrofluorimetrische protocol voor het meten van de mitochondriale permeabiliteit transitie porie opening in geïsoleerde muizenhart mitochondria wordt hier gepresenteerd. De bepaling omvat de gelijktijdige meting van Ca...

Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria

This video describes a plate reader-based assay to measure mitochondrial calcium uptake in isolated mitochondria. The assay analyzes the fluorescence signal of a calcium-sensitive fluorescent dye to study the kinetics of mitochondrial calcium uptake and calcium overload.

Mitochondrial Calcium Uptake Assay: A Plate Reader-Based Method for Measuring Calcium Uptake in Isolated Mitochondria

This video describes a confocal microscopy imaging-based assay to measure mitochondrial calcium uptake in cultured cells. The assay uses the calcium-sensitive fluorescent dye Rhod-2/AM to measure the mitochondrial calcium in permeabilized cultured cells.

Calcium Influx Assay to Measure Mitochondrial Calcium Uptake in Cultured Cells

This video demonstrates the procedure to assess mitochondrial calcium retention capacity by monitoring real-time changes in fluorescence as mitochondria uptake calcium. This assay is useful for studying mitochondrial function and calcium-related processes, including apoptosis and neurodegenerative diseases.

Determination of the Calcium Retention Capacity of Isolated Mitochondria

Mitochondriën kan de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (Δ Ψm) te gebruiken om calcium sekwestreren (Ca 2+), waardoor ze vorm te geven cytosolische Ca 2+ het signaleren binnen de cel. We beschrijven een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met fluorescerende kleurstoffen en confocale microscopie.

Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

Hier presenteren we twee protocollen voor het meten van mitochondriale Ca2 + toestroom in geïsoleerde mitochondriën en gekweekte cellen. Voor geïsoleerde mitochondriën, detailleren wij een plaat lezer gebaseerde Ca2 + import assay met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof calcium groen-5N. Voor gekweekte cellen beschrijven we een methode van de confocal microscopie met behulp van de Ca2 + kleurstof Rhod-2/AM.

Analyses van mitochondriale Calcium toestroom in geïsoleerde Mitochondria en gekweekte cellen

In dit werk beschrijven we een aangepast protocol om mitochondriale respiratoire substraatflux te testen met behulp van recombinant perfringolysine O in combinatie met respirometrie op basis van microplaten. Met dit protocol laten we zien hoe metformine de mitochondriale ademhaling van twee verschillende tumorcellijnen beïnvloedt.

Meten van mitochondriale substraatflux in recombinante perfringolysine O-permeabiliseerde cellen

Dit proctocol heeft tot doel een methode te bieden voor in vitro en in vivo mitochondriale Ca2+ beeldvorming in astrocyten en neuronen.

Beeldvorming mitochondriale Ca2+ opname in astrocyten en neuronen met behulp van genetisch gecodeerde Ca2+ indicatoren (GECI's)

Dit protocol beschrijft een vergelijkende test, met behulp van mitochondriale complexe activiteiten CI+CIII en CII+CIII in de aan- of afwezigheid van Na+, om het bestaan van gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools te bestuderen.

Interne mitochondriale membraangevoeligheid voor Na + onthult gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools

Hier presenteren we een compilatie van testen om de mitochondriale functie in zoogdiercellen direct te meten, onafhankelijk van hun vermogen om moleculaire zuurstof te consumeren.

Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

Leer de mitochondriale Ca2+ retentiecapaciteit en Ca2+-geïnduceerde mitochondriale zwelling meten in geïsoleerde mitochondriën uit SH-SY5Y-cellen. Deze eenvoudige methode helpt bij het onderzoeken van mitochondriale disfunctie en energiemetabolisme.

Mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit Assay en Ca^{2 +}-mitochondriale zwelling Assay geactiveerd

Meer video's verkennen