Name: Visualisatie en Live beeldvorming van Oligodendrocyte organellen in Organotypic hersenen plakjes met behulp van Adeno-associated Virus en confocale microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Leer de visualisatie van oligodendrociet mitochondriën in organotypische hersensneden met behulp van AAV-transductie en tijdverloopbeeldvorming. Deze methode biedt inzicht in celorganellen dynamica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Linda Hildegard Bergersen en Magnar Bjørås voor toegang naar cel lab en apparatuur, Janelia moleculaire biologie gedeelde Resource personeel voor plasmide en virus productie als Koen Vervaeke voor hulp bij laser macht metingen. Dit werk werd gefinancierd door de Noorse Health Association, de Noorse Onderzoeksraad en de apparatuur van de microscopie werd gefinancierd door Norbrain.

<ol><li>Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+organization+of+oligodendrocyte+processes+during+development+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neursosci%22%5BJournal%5D)">Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo.</a> Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).</li>
<li>Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+density+distribution+of+endoplasmic+reticulum+proteins+and+mitochondria+at+specialized+Ca2%2B+release+sites+in+oligodendrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes.</a> J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).</li>
<li>Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+transport+and+Parkin-independent+degeneration+of+respiratory+chain-deficient+dopamine+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures%3A+interface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li>
<li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li>
<li>Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+myelin+in+the+vertebrate+central+nervous+system+using+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy.</a> Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).</li>
<li>Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+imaging+of+myelin+degradation+reveals+a+calcium-dependent+pathway+in+lyso-PtdCho-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination.</a> J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nat. Med. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+viral+vector+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated viral vector production and purification.</a> Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).</li>
<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-directed+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).</li>
<li>Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+basic+protein+gene+contains+separate+enhancers+for+oligodendrocyte+and+Schwann+cell+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression.</a> J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).</li>
<li>Rinholm, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+and+structure+of+mitochondria+in+oligodendrocytes+and+their+myelin+sheaths%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths.</a> Glia. 64, 810-825 (2016).</li>
<li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li>
<li>Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).</li>
<li>Macaskill, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li>
<li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).</li>
<li>Rinholm, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+oligodendrocyte+development+and+myelination+by+glucose+and+lactate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate.</a> J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).</li>
<li>Davison, A. N., Dobbing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+as+a+vulnerable+period+in+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Med.+Bull%22%5BJournal%5D)">Myelination as a vulnerable period in brain development.</a> Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+neuronal+degeneration+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures.</a> Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li>
<li>Pignataro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Viral+Vectors+Serotype+8+for+Cell-Specific+Delivery+of+Therapeutic+Genes+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System.</a> Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).</li>
<li>Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticospinal+tract+transduction%3A+a+comparison+of+seven+adeno-associated+viral+vector+serotypes+and+a+non-integrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector.</a> Gene Ther. 19, 49-60 (2012).</li>
<li>Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+composition+of+molecular+motors+on+moving+axonal+cargo+using+cargo+mapping+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis.</a> J. Vis. Exp. (92), e52029(2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Het protocol voor het maken van organotypic culturen hier beschreven is een gewijzigde versie18 van het protocol beschreven door De Simoni en Yu (2006)5. De belangrijkste wijzigingen hebben zijn hieronder. Tris-buffer wordt toegevoegd aan het kweekmedium, waardoor het voortbestaan van de segmenten als buiten de incubator tijdens virale transductie en wijzigen van de cel-medium worden verbeterd. De sterilisatie procedure voor confetti is ook veranderd. Terwijl andere protoco...

Van de hersenen witte stof bestaat uit zenuwcel axonen verpakt in myeline, een gespecialiseerde uitgebreide plasmamembraan gevormd door oligodendrocyten. Myeline is vereist voor snelle en betrouwbare actiepotentiaal propagatie en voortbestaan van myelinated axonen, en een verlies van myeline neurologische stoornissen kan veroorzaken. Ondanks hun belang, worden de eigenschappen van de oligodendrocyten minder gekend vergeleken met neuronen en astrocyten. Bijgevolg zijn minder gereedschappen ontwikkeld voor het bestuderen van de oligodendrocyten.
Live beeldvorming van cel organellen, zoals mitochondriën, endoplasmatic reticulum (ER) of verschillende vesiculaire structuren kunnen nuttig zijn te onderzoeken van dynamische veranderingen in de organellen na verloop van tijd. Beeldvorming van levende oligodendrocyten is traditioneel, uitgevoerd in monoculturen1,2. Echter oligodendrocyten in monocultuur compacte myeline niet weergegeven, en organotypic of acute hersenen segmenten, dus wellicht een betere optie bij de studie van de lokalisatie en verkeer van organellen. Lokalisatie van kleine organellen en eiwitten in de myelineschede kan worden uitdagend vanwege de korte afstand tussen de myelinated axon en de omliggende myelineschede. Licht microscopische immunokleuring procedures alleen hoeft dus niet de ruimtelijke resolutie te discrimineren tussen organellen in de myelineschede en die in de myelinated axon. Dit kan worden opgelost door virale transductie met genen voor organel-gerichte fluorescente proteïnen gedreven door cel type-specifieke initiatiefnemers. De voordelen zijn een schaars en cel-specifieke expressie, waardoor accurate beoordeling van organel lokalisatie en dynamiek. Transgene dieren kunnen ook worden gebruikt om dergelijke een organel-gerichte cel-specifieke expression3. Echter, de productie en het onderhoud van transgene dieren is duur en bieden meestal niet de schaars expressie die kan worden bereikt door virale methoden.
De beschreven methode gebruikt hier virale transductie van oligodendrocyten met fluorescerende eiwitten mitochondriaal-gerichte (dsred of groen fluorescent protein, GFP) gedreven door de promotor van myeline basic protein (MBP-mito-dsred of MBP-mito-GFP) te visualiseren Oligodendrocyt mitochondriën in organotypic hersenen plakjes. Bovendien wordt expressie van een ander fluorescent proteïne in het cytoplasma (GFP gebruikt in combinatie met mito-dsred of tdtomato gebruikt met mito-GFP) gebruikt om de visualisatie van de morfologie van de cel, met inbegrip van de cytoplasmatische compartimenten van de myelineschede. Het protocol bevat de procedure voor het maken van organotypic hersenen segmenten (een gemodificeerde versie van het protocol beschreven door De Simoni en Yu, 20064,5). Vervolgens beschrijven we de time-lapse imaging procedure voor het bestuderen van mitochondriale beweging. Deze procedure maakt gebruik van een rechtop confocal microscoop met een voortdurende uitwisseling van imaging medium, een setup waarmee de gemakkelijke toepassing van drugs of andere middellange wijzigingen tijdens imaging. De time-lapse imaging procedure kan worden uitgevoerd op elke confocal microscoop, met wat extra apparatuur voor het behoud van levende segmenten zoals hieronder beschreven. Het protocol bevat ook verschillende tips om optimaliseren van beeldvorming en verminderen van fototoxiciteit.
Tot slot, een snelle en eenvoudige manier om te visualiseren onbevlekt myeline door reflectie van de Confocal Microscopie (CoRe) wordt beschreven. Dit kan zinvol zijn om te identificeren van de myelineschede tijdens live imaging. In de afgelopen jaren verschillende technieken zijn ontwikkeld om de afbeelding myeline zonder enige kleuring vereist, maar de meeste van deze vereisen specifieke apparatuur en expertise6,7,-8. De hier beschreven procedure maakt gebruik van de reflectie-eigenschappen van de myelineschede en is een vereenvoudigde single-excitatie golflengte versie van de reflectiecoëfficiënt van spectrale Confocal Microscopie (SCoRe, waarin verschillende golflengten laser worden gecombineerd om te visualiseren van myeline) 9. kern kan gebeuren op elke confocal microscoop met een 488 nm laser en een 470-500 nm bandpass emissie filter of een afstembare emissie-filter.

<table><tbody><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 19G</td><td>BD</td><td>301500</td><td>Naalden gebruikt voor in- en uitlaat van bad</td></tr><tr><td>Bioxide gas</td><td>AGA</td><td>105701</td><td></td></tr><tr><td>Brand pipette bulbs</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z615927</td><td>Pipetbulbs</td></tr><tr><td>Bunsen burner (Liquid propane burner)</td><td>VWR</td><td>89038-530</td><td></td></tr><tr><td>Cable assembly for heater controllers</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0106&nbsp;</td><td>Temperatuurregelaar - thermometer deel</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fluka</td><td>21100</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp;</td><td>AGA</td><td>100309</td><td>CO2 voor incubator</td></tr><tr><td>Cover glass, square Corning</td><td>Thermo&nbsp; Fischer Scientific</td><td>13206778</td><td>Om onder bad te bevestigen voor live imaging. Verzegeld met lijm of petroleum jelly.</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Delicate forceps</td><td>Finescience</td><td>11063-07</td><td>Voor dissectie</td></tr><tr><td>Diamond scriber pen</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>54463</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td>Glazen pipetten</td></tr><tr><td>Double edge stainless steel razor blade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#7200</td><td>Vleesmes voor vibratoom</td></tr><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>24010-043</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper circles</td><td>Schleicher &amp; Schuell</td><td>300,220</td><td>Filterpapier gebruikt voor filtratie van PFA</td></tr><tr><td>Fun tack</td><td>Loctite</td><td>1270884</td><td>Gebruik om de positie van in- en uitlaten in het bad te verbinden/aanpassen</td></tr><tr><td>Hand towel C-Fold 2</td><td>Katrin</td><td>344388</td><td></td></tr><tr><td>Harp, Flat for RC-41 Chamber,</td><td>Warner Instruments</td><td>&nbsp;64-1418</td><td>Harp om confetti in het bad vast te houden. Snijd de snaren af voor gebruik met organotypische plakjes. 1,5 mm, 13mm, SHD-41/15</td></tr><tr><td>HEPES, FW: 260.3</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td></td></tr><tr><td>Holten LaminAir, Model 1.2</td><td>Heto-Holten</td><td>96004000M</td><td>Laminare stroomkap</td></tr><tr><td>Horse serum, heat inactivated</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>LCR Membrane, PTFE,&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>FHLC0130</td><td>Confetti&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica VT1200</td><td>Leica</td><td>14048142065</td><td>Vibratoom</td></tr><tr><td>MEM-Glutamax with HEPES</td><td>Thermo&nbsp; Fischer Scientific</td><td>42360024</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>R.P. Normapur</td><td>25 108.295</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spoon Heyman Type B</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62411-B</td><td>Kleine, afgeronde spatel met geslepen punt voor dissectie</td></tr><tr><td>Millex-GP filter unit</td><td>Millipore</td><td>SLGPM33RA</td><td>Spuitfiltereenheid</td></tr><tr><td>Millicell cell culture insert, 30 mm</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td>Celcultuur inzetstukken</td></tr><tr><td>Minipuls 3 Speed Control Module</td><td>GILSON</td><td>F155001</td><td>Peristaltische pomp voor live imaging - Besturingsmodule-onderdeel (aansluiten op tweekanaals kop)</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fluka</td><td>71628</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Surface</td><td>Thermo&nbsp; Fischer Scientific</td><td>140675</td><td>Kweekplaat</td></tr><tr><td>Nystatin Suspension</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>441452-9900-000&nbsp;</td><td>Waterimmersieobjectief gebruikt voor live imaging. (WD=2,5mm), VIS-IR</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>291-1211</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, granulair</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#19208</td><td></td></tr><tr><td>PC-R perfusion chamber</td><td>SiSkiYou</td><td>&nbsp;15280000E</td><td>Bad voor live imaging</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin, liquid</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 140 mm&nbsp;</td><td>Heger</td><td>1075</td><td>Grote petrischaal&nbsp;</td></tr><tr><td>Petri dish 92x16 mm&nbsp;</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>82.1473</td><td>Gemiddelde petrischaal&nbsp;</td></tr><tr><td>Petridish 55x14,2 mm</td><td>VWR</td><td>391-0868</td><td>Kleine petrischaal</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td>PBS-tabletten</td></tr><tr><td>R2 Two Channel Head&nbsp;</td><td>GILSON</td><td>F117800</td><td>Peristaltische pomp voor live imaging - Tweekanaals kopdeel (vereist besturingsmodule)</td></tr><tr><td>Round/Flat Spatulas, Stainless Steel</td><td>VWR</td><td>82027-528</td><td>Grote spatel voor dissectie</td></tr><tr><td>Sand paper</td><td>VWR</td><td>MMMA63119</td><td>Optioneel, voor het gladstrijken van gebroken glazen pipetten</td></tr><tr><td>Scissors,&nbsp; 17,5 cm</td><td>Finescience</td><td>14130-17</td><td>Grote schaar voor dissectie</td></tr><tr><td>Scissors, 8,5&nbsp;</td><td>Finescience</td><td>14084-08</td><td>Kleine, scherpe schaar voor&nbsp; dissectie</td></tr><tr><td>Single edge, gem blade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#71972</td><td>Enkelzijdig vleesmes</td></tr><tr><td>Single inline solution heater SH-27B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td>Temperatuurregelaar - verwarmingsdeel</td></tr><tr><td>Steritop-GP Filter unit, 500 ml, 45mm</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>Filter om oplossingen te steriliseren</td></tr><tr><td>Super glue precision</td><td>Loctite</td><td>1577386</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scalpel blade no. 22</td><td>Swann Morton Ltd.</td><td>209</td><td>Afgeronde scalpelmes

visualisatie en live beeldvorming van oligodendrocyte organellen in organotypic hersenen plakjes met behulp van adeno-associated virus en confocale microscopie

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Neuronen zijn, is afhankelijk van de elektrische isolatie en trofische steun van myelinating oligodendrocyten. Ondanks het belang van de oligodendrocyten, zijn de geavanceerde hulpmiddelen die momenteel gebruikt voor het bestuderen van neuronen, slechts gedeeltelijk gezet op door Oligodendrocyt onderzoekers. Cel type-specifieke kleuring door virale transductie is handig om te studeren live organel dynamiek. Dit witboek beschrijft een protocol voor het visualiseren van Oligodendrocyt mitochondriën in organotypic hersenen plakjes door transductie met adeno-associated virus (AAV) uitvoering van genen voor mitochondriale gerichte fluorescerende eiwitten onder de Transcriptionele controle van de myeline fundamentele eiwit promotor. Het bevat het protocol voor het maken van organotypic coronale muis hersenen segmenten. Een procedure voor time-lapse beeldvorming van mitochondriën dan volgt. Deze methoden kunnen worden overgedragen aan andere organellen en kunnen bijzonder nuttig zijn voor de studie van de organellen in de myelineschede. Ten slotte, beschrijven we een gemakkelijk beschikbare techniek voor visualisatie van onbevlekt myeline in levende segmenten door reflectie van de Confocal Microscopie (CoRe). Kern vereist geen extra apparatuur en nuttig kan zijn voor het identificeren van de myelineschede tijdens live imaging.

Organotypic hersenen segmenten die werden gekweekt en getransduceerde zoals hierboven beschreven toonde een schaars verdeling van corticale oligodendrocyten mito_dsred en GFP uitspreken. Immunokleuring met antilichamen tegen Olig2 en MBP bevestigd dat de expressie specifiek voor oligodendrocyten (Figuur 1 was).
Voor levende imaging, werden getransduceerde oligodendrocyten erkend door hun kenmerkende...

Myelinating oligodendrocyten bevorderen snelle actiepotentiaal propagatie en neuronale overleving. Hier beschreven is een protocol voor Oligodendrocyt-specifieke expressie van fluorescente proteïnen in organotypic hersenen segmenten met latere time-lapse beeldvorming. Verder is wordt een eenvoudige procedure voor het visualiseren van onbevlekt myeline gepresenteerd.

Visualisatie en Live beeldvorming van Oligodendrocyte organellen in Organotypic hersenen plakjes met behulp van Adeno-associated Virus en confocale microscopie

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Het algemene doel van deze virale transductie en time-lapse opname is om de beweging van mitochondriën in oligodendrocyten in organotypische hersensnijplaten te visualiseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de oligodendrocyten, zoals de manier waarop oligodendrocyten en hun organellen reageren op veranderingen in de lokale omgeving. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gedetailleerde informatie verschaft over de structuur van oligodendrocyten en de dynamiek van organellen in een preparaat waarin alle verschillende hersencellen aanwezig zijn en oligodendrocyten compact myeline produceren. Transduceer oligodendrocyten in snijplaatculturen op dag zeven in vitro. Trek eerst 1,3 µL verdunde AAV per snijplaat op. Zorg dat de buitenkant van de pipetpunt droog is, houd de pipet zo dicht mogelijk boven de cortex zonder de snijplaat met de pipetpunt aan te raken en duw de oplossing langzaam uit de pipet. Zodra de oplossing de snijplaat raakt, beweegt u de pipetpunt over de cortex om de oplossing over het gehele cortexgebied te verspreiden. Zodra alle snijplaten in één schaal zijn getransduceerd, plaatst u de schaal terug in de incubator en herhaalt u het proces bij de andere schalen. Controleer de snijplaten op de expressie van fluorescente markers en beeld de snijplaten af wanneer de expressieniveaus van de fluorescente markers voldoende zijn en de snijplaten er gezond uitzien. Begin met het opzetten van het beeldbad door boetseerklei te gebruiken om spuitnaalden te bevestigen die in een hoek van 45

visualization-live-imaging-oligodendrocyte-organelles-organotypic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier presenteren we de intracraniële injectie van AAV-vectoren voor TL-etikettering van neuronen en glia in de visuele cortex.

Intracraniële Injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren

Dit protocol beschrijft een organotypische slice assay geoptimaliseerd voor de postnatale hersenen en hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van neuroblast migratie in de rostrale migratie stroom.

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

Source: Kennedy, L. H., et. al. Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the imaging of oligodendrocyte mitochondria in organotypic mouse brain slices. The slice is placed inside a bath chamber with continuous fluid circulation and controlled temperature. After setting up various parameters of the confocal microscope, time-lapse images of mitochondria...

Confocal Imaging of Mitochondrial Movement within Oligodendrocytes in Organotypic Brain Slice Cultures

Source: Moye, S. L., et.al. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (2019). This video demonstrates the use of fluorescent dye iontophoresis to study astrocyte morphology in fixed brain slices. It details the piercing of the astrocyte soma with an electrode to deliver an anionic, hydrophilic dye into the cytoplasm under a low-voltage current, enabling the dye to diffuse and label the soma and branches. Confocal microscopy is then used to visualize the...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Fluorescent Dye Iontophoresis in a Fixed Mouse Brain Slice

Een techniek om NG2-cellen en oligodendrocyten te bestuderen met behulp van een slice-kweeksysteem van de voorhersenen en het cerebellum wordt beschreven. Deze methode maakt onderzoek van de dynamica van proliferatie en differentiatie van cellen binnen de oligodendrocytlijn mogelijk, waarbij de extracellulaire omgeving gemakkelijk kan worden gemanipuleerd terwijl de weefselcytoarchitectuur behouden blijft.

Organotypische Slice culturen om te studeren Oligodendrocyte Dynamics en Myelination

Om mechanismen van demyelinisatie en neuronale apoptose in corticale laesies van inflammatoire demyeliniserende aandoeningen aan te pakken, worden verschillende diermodellen gebruikt. We beschrijven hier een ex vivo benadering door gebruik te maken van oligodendrocyten-specifieke CD8+ T-cellen op herfsneden, wat resulteert in oligodendrogliale en neuronale dood. Potentiële toepassingen en beperkingen van het model worden besproken.

Een Ex vivo Model van een Oligodendrocyte gericht T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Hier is een gemodificeerde roller buis methode voor het kweken en intermitterende high-resolution beeldvorming van knaagdier hersenen plakjes vele weken met precieze herpositionering op photoetched coverslips. Neuronale levensvatbaarheid en morfologie van het segment zijn goed onderhouden. Toepassingen van deze volledig gesloten systeem met virussen voor celtype specifieke expressie worden geleverd.

Gemodificeerde Roller buis methode voor juist gelokaliseerd en repetitieve intermitterende Imaging tijdens langetermijnkweek van hersenen segmenten in een gesloten systeem

We beschrijven een protocol voor cel-type specifieke uitdrukking van de genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde sensor ATeam 1.03Yemk in organotypische segment culturen van de muis forebrain. Bovendien, we laten zien hoe deze sensor gebruiken voor dynamische beeldvorming van cellulaire ATP niveaus in neuronen en astrocyten.

Imaging van intracellulaire ATP in Organotypic weefsel segmenten van de muis hersenen met behulp van de FRET-gebaseerde sensor ATeam 1.03Yemk

Hier presenteren we een methode voor het onderzoeken van neurietmorfogenese in postnatale muis retinale explantaten door time-lapse confocale microscopie. We beschrijven een aanpak voor schaarse etikettering en acquisitie van retinale celtypen en hun fijne processen met behulp van recombinante adeno-geassocieerde virusvectoren die membraangerichte fluorescerende eiwitten op een Cre-afhankelijke manier tot expressie brengen.

Time-lapse beeldvorming van neuronale arborisatie met behulp van schaarse Adeno-geassocieerde virusetikettering van genetisch gerichte retinale celpopulaties

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Leer de visualisatie van oligodendrociet mitochondriën in organotypische hersensneden met behulp van AAV-transductie en tijdverloopbeeldvorming. Deze methode biedt inzicht in celorganellen dynamica.

Visualisatie en Live beeldvorming van Oligodendrocyte organellen in Organotypic hersenen plakjes met behulp van Adeno-associated Virus en confocale microscopie (Video) | JoVE Journal

Visualisatie en Live beeldvorming van Oligodendrocyte organellen in Organotypic hersenen plakjes met behulp van Adeno-associated Virus en confocale microscopie

Meer video's verkennen