Name: Super resolutie beeldvorming van de uitputting van de grondtoestand in zoogdiercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-05T08:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Leer super-resolutie microscopie met grondtoestand depletie voor visualisatie van membraaneiwitten in zoogdiercellen. Deze methode biedt tien keer betere resolutie dan conventionele fluorescentiemicroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door een subsidie van de AHA R.E.D. (15SDG25560035). Auteurs wil erkennen Dr Fernando Santana voor gebruik van zijn Leica SR GSD 3D Microscoop, en Dr. Johannes Hell voorziet vriendelijk het FP1 antilichaam.

<ol><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+structured-illumination+microscopy%3A+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hell, S. W., Kroug, M. <a target="_blank" href="http://www3.mpibpc.mpg.de/groups/hell/publications/pdf/Appl._Phys._B._60_495_497.pdf">Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit.</a> JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).</li>
<li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+barrier+in+fluorescence+microscopy+by+optical+shelving%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving.</a> Phys Rev Lett. 98 (21), 218103(2007).</li>
<li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. (58), e3302(2011).</li>
<li>Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+is+associated+with+class+C+L-type+calcium+channels+%28Cav1.2%29+and+antagonizes+channel+phosphorylation+by+cAMP-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase.</a> J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twinkle%2C+twinkle+little+star%3A+photoswitchable+fluorophores+for+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).</li>
<li>Dempsey, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja904588g">Photoswitching mechanism of cyanine dyes.</a> J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).</li>
<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).</li>
<li>Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+%28STORM-RLA%29+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li>
<li>Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+versatile+method+for+GFP-based+super-resolution+microscopy+via+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies.</a> Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).</li>
<li>Dixon, R. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4360655/">Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).</li>
<li>Nan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+superresolution+imaging+allows+quantitative+analysis+of+RAF+multimer+formation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).</li>
<li>Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One%2C+two+or+three%3F+Probing+the+stoichiometry+of+membrane+proteins+by+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy.</a> Sci Rep. 5, 14072(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende belangen openbaar te maken.

De recente explosie van technologieën waarmee imaging voorbij de diffractie-limiet hebben aangeboden nieuwe Vensters in de complexiteit van zoogdieren cel signalering in ruimte en tijd. Deze technologieën omvatten STORM, STED, PALM, GSD, SIM en hun varianten (b.v., dSTORM, FPALM). De vindingrijkheid van de wetenschappers achter deze technieken hebben ons tot het omzeilen van de beperkingen die worden opgelegd door de wetten van de fysica bestuur de diffractie van licht. Ondanks deze enorme prestatie, elk van dez...

Cellulaire signalering reacties vertalen veranderende interne en externe omgeving om te beginnen een cellulaire respons. Ze regelen alle aspecten van de menselijke fysiologie, de Stichting hormoon en neurotransmitter release, hartslag, visie, bevruchting, en cognitieve functie bijeenkomen. Verstoring van deze signalering cascades kan ernstige gevolgen in de vorm van pathofysiologische omstandigheden waaronder kanker, Parkinson en de ziekte van Alzheimer hebben. Voor decennia, heb biologische en medische onderzoekers met succes gebruikt fluorescente proteïnen, sondes en biosensoren fluorescentie microscopie gekoppeld als de belangrijkste instrumenten om te begrijpen van de precieze ruimtelijke en temporele organisatie van deze mobiele signalen.
De troeven van optische technieken zoals epifluorescence, confocal, of totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie zijn hun gevoeligheid, snelheid en compatibiliteit met levende cel imaging, terwijl de grote beperking is hun diffractie-beperkte resolutie, zin structuren of eiwitcomplexen kleiner dan 200-250 nm kunnen niet worden opgelost. Met de ontwikkeling van het theoretische en praktische van deterministische super resolutie (bijvoorbeeldgestimuleerde emissie uitputting microscopie (STED1), gestructureerd verlichting microscopie (SIM2) of stochastische super resolutie (bv , photoactivated lokalisatie microscopie (PALM3) of grondtoestand uitputting (GSD4,,5)), laterale en axiale resolutie fluorescentie microscopie is uitgebreid buiten de diffractie barrière, aan de orde van tientallen nanometer. Onderzoekers hebben dus nu de ongeëvenaarde mogelijkheid te visualiseren en te begrijpen hoe de dynamiek van de eiwitten en organisatie vertaalt naar functie op in de buurt van-moleculair niveau.
Grondtoestand uitputting microscopie gevolgd door individuele molecuul terugkeer (GSDIM), of gewoon GSD omzeilt genoemd, u de limiet van diffractie door het verminderen van het aantal gelijktijdig uitstoten fluorophores4,5. Hoge-energie laserlicht wordt gebruikt voor het prikkelen van het monster fluorophore-geëtiketteerd, bombarderen van elektronen met fotonen en het vergroten van de kans dat zij zal ondergaan een 'spin-flip' en voer de triplet of 'donker-state' van de geëxciteerde toestand4. Dit effectief de grondtoestand uitput, vandaar de naam 'de grond staat uitputting". In de triplet, fluorophores doen niet het uitstoten van fotonen en het monster verschijnt dimmer. Echter deze fluorophores stochastically terug naar de grondtoestand en verschillende foton uitstoten opgewonden-grond staat overgangen voordat hij terugkeerde naar de triplet staat kunt doorlopen. Met minder fluorophores uitstoten te allen tijde, uitgezonden foton uitbarstingen van individuele fluorophores ruimtelijk en stoffelijk losstaat van het naburige fluorophores geworden. De uitbarsting van fotonen worden past met een Gauss functie, de berekende centroid die correspondeert met de positie van de fluorophore met een nauwkeurigheid van lokalisatie die afhankelijk is van de numerieke diafragma (NA) van de lens, de golflengte van het licht gebruikt voor excitatie en cruciaal, het aantal fotonen uitgezonden per fluorophore. Een beperking van de GSD is dat, aangezien slechts een subset van fluorophores actief op elk gewenst moment stoot, duizenden beelden gedurende enkele minuten op te bouwen een volledige lokalisatie-kaart moeten worden verzameld. De lange acquisitietijd in combinatie met de hoge laser machtsvereiste, betekent dat de GSD is beter geschikt voor vaste in plaats van live monsters.
Dit artikel beschrijft de voorbereiding van vaste monsters voor super-resolutie microscopie beeldvorming van membraan en endoplasmatisch reticulum (ER)-resident eiwitten (voor een lijst van de nodig materialen en reagentia Zie de Tabel van de materialen). Voorbeelden van hoe dit protocol kan gemakkelijk aangepast om te kwantificeren van de grootte en de mate van clustering van L-type spanning-gated Ca2 + kanalen (Cav1.2) in het sarcolemma van cardiale myocytes of gebruikt voor het visualiseren van de cellulaire verdeling van de ER, worden aangetoond. Inzicht in de distributie en de organisatie van deze cellulaire componenten is uitermate belangrijk bij het begrijpen van de inleiding, vertaling, en uiteindelijk de functie van vele Ca2 +-afhankelijke signalering cascades. Bijvoorbeeld, zijn Cav1.2 kanalen fundamenteel belang voor de excitatie-contractie koppeling, terwijl receptor-gemedieerde Ca2 + vrijlating uit de ER misschien wel de meest alomtegenwoordige signalering cascade in zoogdiercellen is.

<table><tbody><tr><td>KOH</td><td>Thermo Scientific</td><td>P250-500</td><td>Om coverglas te reinigen</td></tr><tr><td>#1.5 coverglas 18 x 18 mm</td><td>Marienfeld Superior</td><td>0107032)</td><td>Om cellen te laten groeien/verwerken/afbeeldingen te maken</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>BP3994</td><td>Verdunnen tot 1x met gedeïoniseerd water</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>Helpt bij celadhesie aan coverglas</td></tr><tr><td>laminine</td><td>Sigma</td><td>114956-81-9</td><td>Helpt bij celadhesie aan coverglas</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Thermo Scientific</td><td>11150-059</td><td>Ventriculaire myocyt cultuur media</td></tr><tr><td>DMEM 11995</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td>Celcultuur media</td></tr><tr><td>Fetal bovien Serum (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437028</td><td>Media aanvulling</td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Media aanvulling</td></tr><tr><td>0,05% trypsin-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CL</td><td>Celcultuur oplossing</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Transiente transfectie reagens</td></tr><tr><td>Ca2+-vrij PBS</td><td>Gibco</td><td>1419-144</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>100% Methanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A414-4</td><td>Cel Fixatie</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Cel Fixatie</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBR6504V</td><td>Cel Fixatie</td></tr><tr><td>SEAblock</td><td>Thermo Scientific</td><td>37527</td><td>BSA of andere blokkerende oplossingen zijn beschikbaar</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Detergentia om cellen te permeabiliseren</td></tr><tr><td>Konijn anti-CaV1.2 (FP1)</td><td>Gift</td><td>N/A</td><td>Commerciële anti-CaV1.2 antilichamen zijn beschikbaar zoals Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)</td></tr><tr><td>Muis monoklonaal anti-RFP</td><td>Rockland Inc.</td><td>200-301-379</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 donkey anti-konijn IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A31573</td><td>Secundair antilichaam</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 geit anti-muis IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A11031</td><td>Secundair antilichaam</td></tr><tr><td>Natriumaziet</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Voorkomt microbiële groei voor langdurige opslag van monsters</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td>Fotoswitching buffer ingrediënt</td></tr><tr><td>Glucose oxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Fotoswitching buffer ingrediënt</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Fotoswitching buffer ingrediënt</td></tr><tr><td>beta-Mercaptoethylamine hydrochloride</td><td>Fisher</td><td>BP2664100</td><td>Fotoswitching buffer ingrediënt</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>63689</td><td>Fotoswitching buffer ingrediënt</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td>Fotoswitching buffer ingrediënt</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>D14-212</td><td>Fotoswitching buffer ingrediënt</td></tr><tr><td>Glazen depressieschuiven</td><td>Neolab</td><td>1 &ndash; 6293</td><td>Om monsters te monteren</td></tr><tr><td>Twinsil</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>Om coverglas te verzegelen</td></tr><tr><td>sec61&beta;-mCherry plasmid</td><td>Addgene</td><td>49155</td><td></td></tr><tr><td>Leica SR GSD 3D-microscoop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Washing block oplossing</td><td></td><td></td><td>20% SEAblock in PBS</td></tr><tr><td>Primair antilichaam incubatie oplossing</td><td></td><td></td><td>0,5% Triton-X100, 20% SEAblock, in PBS</td></tr><tr><td>Secundair antilichaam incubatie oplossing</td><td></td><td></td><td>1:1000 in PBS</td></tr></tbody></table>

super resolutie beeldvorming van de uitputting van de grondtoestand in zoogdiercellen

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Voorschotten in fluorescent microscopie en celbiologie zijn nauw gecorreleerd, met de verbeterde mogelijkheid om te visualiseren van cellulaire gebeurtenissen die vaak leiden tot dramatische sprongen in ons begrip van hoe cellen functie. De ontwikkeling en beschikbaarheid van super resolutie microscopie is aanzienlijk uitgebreid de grenzen van de optische resolutie van ~ 250-20 nm. Biologen zijn niet langer beperkt tot het beschrijven van de moleculaire interacties in termen van colocalization binnen een gebied van diffractie beperkt, eerder het is nu mogelijk om te visualiseren de dynamische interacties van afzonderlijke moleculen. Hier duidelijk naar voren komt een protocol voor de visualisatie en de kwantificering van cellulaire eiwitten door uitputting van de grondtoestand microscopie voor beeldvorming van de vaste cel. We bieden voorbeelden uit twee verschillende membraaneiwitten, een element van het endoplasmatisch reticulum-translocon, sec61β, en een plasmamembraan-gelokaliseerde spanning-gated L-type Ca2 + kanaal (CaV1.2). Besproken zijn de specifieke Microscoop parameters, fixatie methoden, foto-switching buffer formulering, valkuilen en uitdagingen van de beeldverwerking.

Zoals vermeld in de inleiding, zijn er veel verschillende super resolutie microscopie imaging modaliteiten. Dit protocol, richt zich op GSD super resolutie beeldvorming. Representatieve beelden en lokalisatie kaarten worden weergegeven in Figuur 2 en Figuur 3.
Figuur 2 toont een COS-7 cellen transfected met de ER eiwit, mCherry-Sec61β en ve...

Dit artikel schetst een protocol voor de detectie van een of meer plasma en/of intracellulaire membraaneiwitten grondtoestand uitputting (GSD) Super resolutie microscopie met zoogdiercellen. Hier bespreken we de voordelen en de overwegingen van het gebruik van dergelijke benaderingen voor de visualisatie en de kwantificering van cellulaire eiwitten.

Super resolutie beeldvorming van de uitputting van de grondtoestand in zoogdiercellen

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Het algemene doel van deze fluorescentiebeeldvormingstechniek is het visualiseren en kwantificeren van cellulaire eiwitten in gefixeerde cellen met een resolutie onder de diffractielimiet, gebruikmakend van een vorm van superresolutie-microscopie genaamd ground state depletion microscopy en individual molecule return. Deze methode helpt bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de celbiologie en membraanbiofysica, aangezien het de diffractielimiet omzeilt, waardoor onderzoekers de distributie van cellulaire eiwitten nauwkeuriger kunnen definiëren, visualiseren en kwantificeren. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het de acquisitie van beelden mogelijk maakt met een resolutieverbetering van ongeveer tienvoudig ten opzichte van conventionele fluorescentiebeeldvormingsbenaderingen, zoals confocale microscopie.De procedure zal worden gedemonstreerd door Oscar Vivas, postdoc in mijn laboratorium, en Karen Hannigan, postdoc in het laboratorium van Rose Dixon. Begin met het voorbereiden van de dekglasjes en cellen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Fixeer vervolgens de monsters en voer immunocytochemie uit om de plasmamembraan en/of de relevante intracellulaire membraanproteïnen te labelen.Bereid vervolgens de zuurstofvangers Glock-oplossing door eerst 12,5 µL van een catalase-stockoplossing, 3,5 mg glucose-oxidase en 0,5 µL 1 M Tris toe te voegen aan 49,5 µL PBS in een 1,5 mL microcentrifugebuisje. Sluit het buisje en vortex kort om de componenten op te lossen. Centrifugeer de oplossing vervolgens gedurende drie minuten.Bereid nu de thial-oplossing voor het induceren van fotowisseling door een beta-mercaptoethylamine-oplossing op te lossen in PBS tot een concentratie van 100 millimolar en stel de pH in op 8,0. Verdeel de thial-oplossing in aliquoten en bewaar deze tot een week in de vriezer. Meng vlak voor de beeldvorming de thial- en zuurstofvangers samen met een zoutbuffer en bewaar de oplossing op ijs.Monteer dekglasjes met gekleurde cellen op de inkepingglaasjes met behulp van 100 µL van de bereide fotoschakelbuffer. Seal vervolgens de randen van het dekglasje met siliconenkit om snelle oxidatie van de beeldvormingsbuffer te voorkomen. Wacht enkele minuten tot de siliconenkit volledig is uitgehard voordat u begint met de beeldvorming.Anders zal het dekglas wegdrijven. Begin met het selecteren van een geschikte laser om het monster te belichten, op basis van het gekozen fluorofoor. Gebruik voor een Alexa 647 fluorofoor een laser van 642 nanometer.Kies vervolgens de juiste dichroïsche beeldkubus en objectieflens. Open de beeldvormingssoftware. Selecteer de 2D-acquisitiemodus en stel de belichtingstijd vervolgens in op 11 milliseconden.Stel daarnaast de EM Gain in op 300 en selecteer een passende detectiedrempel. Schakel vervolgens Auto Event Control in en stel het aantal Events Per Images in op acht. Voer de Pixel Size in als 20 nanometers.Ga in het tabblad GSD Tools naar de opties voor High Resolution Image Calculation en zorg dat Histogram Mode is geselecteerd. Selecteer TIRF-modus om eiwitten aan het plasmamembraan te beelden en pas de invalshoek aan om de penetratiediepte te bepalen. Stel vervolgens de laserintensiteit in op 100% om elektronen naar de donkere toestand te sturen.Selecteer vervolgens Single Molecule Detection tijdens het pompen en stel in om automatisch te acquireren wanneer de framecorrelatie 0,20 is. Stel voor de acquisitie de laserintensiteit in op 50% en het aantal acquisitieframes op 60.000. Begin daarna met het maken van beelden.Om de grootte van eiwitclusters te kwantificeren, opent u het afbeeldingsbestand van een 10 nanometer histogram single molecule localization map in ImageJ. Ga in het Image-menu naar Adjust en gebruik de optie Auto om de helderheid en het contrast van de afbeelding te optimaliseren. Kies vervolgens onder het Type-menu voor 8-bit.Open vervolgens het Analyze-menu, klik op Set Scale en voer de hier getoonde waarden in. Selecteer daarna in het Analyze-menu Set Measurements en vink het vakje naast de optie Area aan. Ga terug naar het Image-menu, selecteer Adjust, Threshold, en kies vervolgens Over/Under.Stel de maximale waarde in op 255, de minimale waarde op één en klik op Apply. Open ten slotte het Analyze-menu en selecteer Analyze Particles. Vink de opties Pixel units, Display results en Summarize aan.Stel vervolgens de grootte in op vier tot oneindig, selecteer de optie Bare Outlines en klik op OK. De cel die hier wordt afgebeeld was getransfecteerd met het endoplasmatisch reticulum-eiwit, mCherry-Sec61 beta, en is gefotografeerd met zowel diffractie-gelimiteerde TIRF-microscopie als superresolutie GSD-microscopie in TIRF-modus. Deze curven representeren de diameter van de ER-tubuli. De afbeelding aan de rechterkant toont een verbetering in de laterale resolutie en geeft een nauwkeuriger weergave van de structuur van de ER-tubuli.De verbetering in resolutie die superresolutie GSD-beeldvorming biedt, wordt verder aangetoond in deze afbeeldingen, waarop een gelabelde cardiale myocyt met een anti-CAV 1.2 antilichaam te zien is. Bij gebruik van de GSD-modus is de verbetering in de laterale resolutie prominent en zijn afzonderlijke clusters van kanalen gemakkelijker te identificeren. Zodra men hiermee vertrouwd is, kan dit protocol in minder dan drie dagen worden voltooid.De superresolutie-beeldvorming van een enkele cel duurt 10 tot 30 minuten, afhankelijk van het aantal benodigde frames. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals elektronenmicroscopie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de wijze waarop het fluorescerende eiwit van belang interageert met de complexe cellulaire omgeving. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het voorbereiden, verwerven en analyseren van monsters om één of meer cellulaire eiwitten te visualiseren voor superresolutie-microscopie met behulp van ground state depletion gevolgd door individual molecule return.

ground-state-depletion-super-resolution-imaging-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een super-resolutie beeldvorming methode om de structurele organisatie van de bacteriële FtsZ-ring, een essentieel inrichting voor celdeling sonde. Deze methode is gebaseerd op kwantitatieve analyses van fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) beelden en kan worden toegepast op andere bacteriële cytoskeleteiwitten.

Super-resolution Imaging van de bacteriële Division Machinery

Spatiotemporele informatie over dynamische eiwitten in levende cellen is cruciaal voor het begrijpen van de biologie. Een type superresolutiemicroscopie genaamd fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) onthult unieke informatie over de cytokinetische Z-ring in bacteriën: zowel het kralenachtige uiterlijk als de snelle dynamica van FtsZ binnen de ring.

Super-resolution Imaging van de Cytokinetic Z Ring in levende bacteriën met behulp van Fast-3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

We beschrijven hier een combinatie van de glas-ondersteunde lipide dubbellaagstechniek voor het vormen van immunologische synapsen met de superresolutie-beeldtechniek van gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie. Het doel van dit protocol is gebruikers de nodige instructies te geven om deze twee technieken met succes uit te voeren.

Super-resolutie beeldvorming van de Natural Killer Cell Immunological Synapse op een glas-ondersteunde Planar lipidendubbellaag

PI (4,5) P2 regelt diverse cellulaire functies, maar de nanoschaal organisatie in de cel plasmamembraan wordt slecht begrepen. Etikettering PI (4,5) P2 met een dubbele-color fluorescent probe gefuseerd met het Pleckstrin homologie domein beschrijven we een nieuwe benadering voor het bestuderen PI (4,5) P2 ruimtelijke verdeling in het plasmamembraan op nanometerschaal .

Single-molecule Super-resolutie beeldvorming van fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat in het plasmamembraan met Novel Fluorescerende Probes

Conventionele BODIPY conjugaten kunnen worden gebruikt voor live-cel single-molecule lokalisatie microscopie (SMLM) door de exploitatie van hun tijdelijk vormende, rood verschoven grond staat dimers. We presenteren een geoptimaliseerd SMLM-protocol om subcellulaire neutrale lipiden en vetzuren in levende zoogdier- en gistcellen op nanoscopische lengteschaal te volgen en op te lossen.

Conventionele BODIPY Conjugates voor Live-Cell Super-Resolution Microscopie en Single-Molecule Tracking

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor superresolutie live-cell imaging in intact weefsel. We hebben de voorwaarden gestandaardiseerd voor beeldvorming van een zeer gevoelige volwassen stamcelpopulatie in zijn inheemse weefselomgeving. Deze techniek omvat het balanceren van temporele en ruimtelijke resolutie om de directe observatie van biologische verschijnselen in levend weefsel mogelijk te maken.

Superresolutie live celbeeldvorming van subcellulaire structuren

Het keldermembraan is essentieel voor weefsel- en orgaanmorfogenese tijdens de ontwikkeling. Om de mechanismen die leiden tot de juiste plaatsing van deze structuur beter te begrijpen, beschrijft het gepresenteerde protocol methoden om de intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten in epitheelcellen te visualiseren en te karakteriseren met behulp van confocale en superresolutiemicroscopie.

Confocale en superresolutie beeldvorming van gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten tijdens Drosophila Oogenesis

Superresolutiemicroscopie kan een gedetailleerd inzicht geven in de organisatie van componenten binnen het synaptonemale complex bij meiose. Hier demonstreren we een protocol om individuele eiwitten van het Caenorhabditis elegans synaptonemale complex op te lossen.

Superresolutiemicroscopie van het synaptonemale complex binnen de Caenorhabditis elegans kiembaan

Dit artikel biedt een eenvoudig en duidelijk protocol om Salmonella-uitgescheiden effectoren te labelen met behulp van genetische code-uitbreiding (GCE) site-specifiek en de subcellulaire lokalisatie van uitgescheiden eiwitten in HeLa-cellen in beeld te brengen met behulp van directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM)...

Superresolutiebeeldvorming van bacteriële uitgescheiden eiwitten met behulp van genetische code-uitbreiding

Dit protocol beschrijft de procedure voor het uitvoeren van diepe, whole-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop met optische fotonherplaatsing, waardoor DNA-PAINT-beeldvorming mogelijk is zonder de noodzaak van aangepaste optica of complexe verlichting.

Superresolutiebeeldvorming van hele cellen via DNA-PAINT op een draaiende schijf confocaal met optische fotonhertoewijzing

Dit protocol beschrijft de geavanceerde beeldvormingstoepassingen en het beheer van gedeelde middelen van een laser-scannend confocaal microscoopsysteem, geïntegreerd met een multiplexed arraydetector voor hoogresolutie cellulaire en subcellulaire beeldvorming. De workflow maakt multimodale beeldvorming mogelijk van confocaal tot superresolutie (~120 nm) binnen één platform, waardoor visualisatie op nanoschaal toegankelijker wordt.

Superresolutie beeldvorming en gedeeld beheer: een protocol voor confocale microscopie met multiplexdetectie

Leer super-resolutie microscopie met grondtoestand depletie voor visualisatie van membraaneiwitten in zoogdiercellen. Deze methode biedt tien keer betere resolutie dan conventionele fluorescentiemicroscopie.

Super resolutie beeldvorming van de uitputting van de grondtoestand in zoogdiercellen

Meer video's verkennen