Beoordeling van de urinewegen Junction obstructie gebreken door methyleenblauw kleurstof injectie
12 oktober 2017
Methyleenblauw kleurstof injectie in het bekken renal vergemakkelijkt de beoordeling van de urinewegen junction obstructie gebreken tijdens de ontwikkeling van muis embryonale urinewegen. Hier, wordt een protocol voor methyleenblauw kleurstof injectie in het bekken renal beschreven.
Het algemene doel van deze procedure is om de obstructies van urinewegverbindingen te bepalen via injectie van methyleenkleurstof in de nieren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de ontwikkeling van de nieren en de lagere urinewegen, zoals de verbinding tussen de uretra en de blaas. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige methode biedt om de structuur van de urinewegen te visualiseren in het ergste geval van massaontwikkeling, waardoor analyse van de ontwikkeling van de urinewegen mogelijk wordt.
Om het experiment te beginnen, meet u 0,1 gram methyleenblauw poeder af. Los het methyleenblauw op in 10 milliliter 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS en schudden in een vortex. Filtreer vervolgens de oplossing van 10 milligram per milliliter methyleenblauw met een spuitfilter om verstopping tijdens de injectie te voorkomen.
Monteer vervolgens een steriele venepunctieset met een wegwerpspuit van drie milliliter en vul de spuit met drie milliliter van de gefilterde methyleenblauwoplossing. Reinig de dissectiescharen en pincetten met 70% ethanol. Om perinatale embryo's bij E18.5 of E19.5 te verzamelen, euthanaseerd eerst zwangere muizen met kooldioxide-inhalatie.
Voer vervolgens cervicale dislocatie uit volgens de NIH-richtlijnen. Spuit vervolgens 70% ethanol op het ventrale buikoppervlak van het dier. Open vervolgens met de steriele dissectiescharen en pincetten de buikholte van het dier vanaf de buikzijde.
Til de hele baarmoeder op en scheid deze van het lichaam bij de uiteinden van de baarmoederhoorns. Spoel vervolgens de hele baarmoeder met 1x PBS in een petrischaal. Snijd het baarmoedersegmentaal met dissectiescharen en verwijder de placentale decidua met dissectiepincetten om de embryo's en dooierzakken bloot te leggen.
Verwijder eerst de dooierzak en verwijder vervolgens het vruchtwatermembraan met dissectiepincetten om de perinatale embryo's te bevrijden. Onthoofd het embryo met dissectiescharen. Speld het embryo met de buikzijde naar boven vast op een dissectiemicroscoop die is uitgerust met een digitale camera voor beeldvorming.
Verzamel de staart voor genotypering. Scheur voorzichtig met pincetten de huid open om de buikholte van het embryo te openen. Verwijder vervolgens overtollige organen en weefsels zoals lever, maag en darmen met pincetten door ze af te snijden of eruit te trekken om de nieren, urineleiders en de blaas die dorsaal zijn gelegen bloot te leggen.
Absorbeer overtollig bloed uit het gedissekteerde embryo met steriele gaasjes en ga dan verder met de kleurstofinjectie. Verwijder luchtbellen in de naald en het slangetje door oplossing van methyleenblauw uit de naaldpunt te persen door middel van hydrostatische druk. Til de spuit met de kleurstofoplossing boven het niveau van de naaldpunt om de stroom te starten.
En laat vervolgens de spuit zakken om de stroom te stoppen. Steek vervolgens de naald in het nierbekken in de buurt van de proximale ureter, zorg ervoor dat deze niet wordt verstoord zodra deze is geplaatst. Voer kleurstofinjectie uit in een nier om de obstructie van de urinewegen te bepalen.
Na het inbrengen van een naald in het nierbekken moet een tweede naald in het nierbekken worden gestoken richting de ureter, zonder door de nier te passeren of richting de bloedvaten. Til de spuit ongeveer 20 centimeter op om hydrostatische druk te creëren en laat 15 tot 16 microliters van de kleurstofoplossing stromen. Bewaak vervolgens de blauwe kleur van de kleurstof, eerst in het nierbekken, vervolgens in de lengte van de ureter en tenslotte in het blaaslumen.
Plaats de spuit neer om de kleurstofstroom te stoppen en verwijder de naald uit de nier. Noteer de hydronefrose van de nier, hydroureter en de uiteindelijke positie van de kleurstofoplossing in een labnotitieboekje. Voer ten slotte injectie uit in de contralaterale nier en laat de kleurstof 20 seconden in totaal stromen.
Maak foto's van de nier, de urineleider en de blaas die met kleurstofoplossing zijn getraceerd met behulp van de camera en het beeldvormingsprogramma dat is aangesloten op een stereomicroscoop. Na injectie in één nier stroomt de methyleenblauwkleurstof van het nierbekken door de urineleider en in de blaas, wat resulteert in een zichtbare blauwe kleur in de urineleider en het blaaslumen. Een sterkere blauwe kleur verschijnt in het blaaslumen vanwege een langere stroom ongeveer 20 seconden na injectie van beide nieren met kleurstof, wat wijst op de afwezigheid van obstructie van de urinewegverbinding in het tweede urinestelsel.
Bij het injecteren van een abnormaal verwijde hydroureter is de uiteindelijke positie van de kleurstofoplossing onduidelijk. En obstructie van de ureterovesicale verbinding of UVJO kan niet worden geverifieerd ondanks de afwezigheid van de kleurstof in het blaaslumen, omdat de abnormale hydroureter in het midden is beschadigd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om de kleurstofzak perinatale embryo's te berekenen om een intact urinestelsel te krijgen.
En verwijder luchtbellen om de kleurstofstroom niet te blokkeren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het injecteren van methyleenblauwkleurstof in het nierbekken om obstructies van de urinewegovergang tijdens de embryonale ontwikkeling van de muis te beoordelen. Deze techniek helpt bij het visualiseren van de structuren van de urinewegen en het begrijpen van ontwikkelingsprocessen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Urologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de ontwikkeling van de urinewegen is cruciaal voor het aanpakken van aangeboren afwijkingen.
- Methylenblauw dient als visueel hulpmiddel bij het identificeren van obstructies.
- Deze methode kan het onderzoek naar de ontwikkeling van de nieren en de lagere urinewegen verbeteren.
- Aansluitingen van de urinewegen zijn essentieel voor een goede nierfunctie.
Doel van de studie
- Om structuren van de urinewegen tijdens de embryonale ontwikkeling te visualiseren.
- Om obstructies bij de aansluitingen van de urinewegen te identificeren.
- Om een eenvoudige methode te bieden voor het beoordelen van de ontwikkeling van de urinewegen.
Gebruikte methoden
- Weeg 0,1 gram methyleenblauwpoeder af.
- Los dit op in 10 milliliter 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Vortex het mengsel voor een volledige oplossing.
- Filtreer de oplossing met een spuitfilter om verstoppingen tijdens de injectie te voorkomen.
Belangrijkste resultaten
- De kleurstof methyleenblauw brengt urinewegstructuren effectief in beeld.
- Deze methode maakt het mogelijk om obstructies van de junctie te beoordelen.
- Visualisaties kunnen helpen bij het begrijpen van ontwikkelingsafwijkingen.
- De resultaten ondersteunen verder onderzoek naar de ontwikkeling van de urinewegen.
Conclusies
- Injectie van methyleenblauw-kleurstof is een waardevol instrument voor het bestuderen van de ontwikkeling van de urinewegen.
- Deze techniek kan de identificatie van ontwikkelingsdefecten vergemakkelijken.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode om aanverwante vraagstukken te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Betrouwbare detectie van obstructies in de urinewegverbindingen in preklinische modellen is essentieel voor het begrijpen van aangeboren afwijkingen die de nierfunctie beïnvloeden en voor studies naar geneesmiddelveiligheid. Het protocol voor injectie van methyleenblauw-kleurstof maakt directe visualisatie van de urinestroom en obstructiepunten mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie en targetvalidatie in ontwikkelingsbiologisch en urologisch onderzoek. Deze aanpak versterkt het voorspellende vertrouwen in ziektespecifieke muismodellen, wat translationeel onderzoek en besluitvorming in vroege fasen van de portfolio informeert.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt functionele beoordeling van de connectiviteit en obstructie van de urinewegen in embryonale modellen mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door directe visualisatie van hydronefrose en hydroureter.
- Faciliteert de validatie van genetische of farmacologische interventies gericht op de ontwikkeling van de urinewegen.
- Biedt een reproduceerbare readout voor het bevestigen van anatomische en functionele eindpunten.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt een gestandaardiseerde, visuele assay vast voor het detecteren van doorgankelijkheid of obstructie van de urinewegen.
- Levert kwantitatieve en kwalitatieve resultaten voor downstream fenotypische screening.
- Maakt reproduceerbare beoordeling mogelijk van de effecten van interventies op de morfologie van de urinewegen.
- Ondersteunt schaalbaarheid voor vergelijkende studies over meerdere genotypen of behandelingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt muis-fenotypes uitgelijnd met menselijke congenitale defecten van de urinewegen voor translationele continuïteit.
- Biedt een platform voor de evaluatie van kandidaat-therapeutica in ziekterelevante systemen.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van targets die betrokken zijn bij de ontwikkeling van de urinewegen.
- Maakt de ontwikkeling van op beeldvorming gebaseerde biomarkers mogelijk voor preklinische validatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol is geïntegreerd in het continuüm van vroege ontdekking en preklinische validatie en slaat een brug tussen de karakterisering van genetische modellen en translationeel onderzoek naar renale en urologische aandoeningen.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetoetsing met betrekking tot de ontwikkeling van de urinewegen en mechanismen van obstructie.
- Screening: Biedt een visuele, kwantitatieve assay voor het evalueren van de impact van interventies op de urinestroom.
- Analytics: Genereert beeldgevings- en positionele gegevens voor statistische vergelijking van normale en geobstrueerde fenotypes.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt bevindingen bij muizen met menselijke ziektemodellen voor de ontwikkeling van biomarkers en therapieën.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar protocol voor diverse genetische achtergronden en interventiestudies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van ontwikkelings- en urologische targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert de beoordeling van de doorgankelijkheid van de urinewegen met reproduceerbare imaging-resultaten.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-beslissingen voor het verder ontwikkelen van renale en urologische targets.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van kandidaten die de ontwikkeling van de urinewegen beïnvloeden.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in murine embryonale dissectie en microinjectietechnieken.
- Toegang tot beeldvormingsinfrastructuur is nodig voor real-time visualisatie en documentatie.
- Strikte standaardisatie tussen teams is vereist om de reproduceerbaarheid van de beoordeling van de kleurstofstroom te waarborgen.
- Aanpassing kan noodzakelijk zijn voor verschillende ontwikkelingsstadia of genetische achtergronden.
- Zorgvuldige hantering is essentieel om weefselschade en foutief-negatieve resultaten voor obstructie te voorkomen.
