Name: Live-imaging van borst epitheliale cel migratie na de voorbijgaande uitputting van TIP60 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Leer live-imaging van borst epitheliale celmigratie na TIP60-depletie met MCF10A-cellen. Deze methode maakt real-time monitoring van wondgenezing mogelijk voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken de leden van het JBZ-laboratorium voor hun nuttige discussie en commentaar. S.J. werd gesteund door subsidies van de National Research Foundation Singapore en het Singapore ministerie van onderwijs onder de onderzoekscentra van Excellence initiatief naar de kanker Science Institute van Singapore (R-713-006-014-271), de nationale medische Onderzoeksraad (CBRG-NIG; BNIG11nov001 en CS-IRG; R-713-000-162-511), het ministerie van onderwijs academische onderzoeksfonds (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 okt-04). Y.Z., G.S.C. en C.Y.T. werden ondersteund door een postdoctorale fellowship uitgereikt door de kanker Science Institute van Singapore, National University of Singapore.

1. voorbereiding
<ol><li>MCF10A-kweekmedium bereiden: Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) / F12 (1:1) met 5% paard serum, 20 ng/mL epitheliale groeifactor 0,5 mg/mL hydrocortison, 100 ng/mL cholera-toxine en 10 µg Fe/mL insuline.</li>
	<li>Bereiden serumvrij medium: DMEM/F12 (1:1) met 20 ng/mL epitheliale groeifactor, 0,5 mg/mL hydrocortison 100 ng/mL cholera-toxine en 10 µg Fe/mL insuline.</li>
	<li>Gebruik de volgende siRNA-reeks: siControl: Forward: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3' Omgekeerde: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3' siTIP60: Forward: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3' Omgekeerde: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'</li>
	<li>Gebruik 10-cm cel cultuur gerechten en 24-Wells-platen.</li>
</ol>2. Pre-steady uitputting van TIP60 met behulp van siRNA
<ol><li>Op dag 1, aliquoot 15 µL van transfectiereagens (bv Lipofectamine RNAiMAX) en 2 mL serum medium (bijvoorbeeld Opti-MEM) verminderd en meng ze met 10 µL van elke siRNA (10 µM stock), respectievelijk.</li>
	<li>Laat het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten inwerken.</li>
	<li>Beënt, 1 x 106 MCF10A cellen samen met 3 mL gestolde voedingsbodem in een 10 cm schotel. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen.</li>
	<li>Het mengsel van siRNA druppelsgewijs toevoegen aan de 10 cm schotel.</li>
	<li>Schud de schotel om ervoor te zorgen dat de cellen gelijk verdeeld alvorens het in de 37 ° C incubator.</li>
	<li>Na 6 uur incubatie wordt het medium siRNA-bevattende vervangen door 8 mL verse kweekmedium.</li>
	<li>Op dag 2, een andere partij van siRNA mengsels voor te bereiden en hen uit te broeden bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Gecombineerd uit 8 mL gestolde voedingsbodem toegevoegd op dag 1 en 3 mL verse voedingsbodem te vervangen.</li>
	<li>De tweede partij van siRNA mengsel toevoegen aan de gerechten door druppelsgewijs. Schud de gerechten om ervoor te zorgen dat de reagentia volledig worden gemengd alvorens ze in de incubator.</li>
	<li>Na 6 uur, door het medium van siRNA-bevattende te vervangen door 8 mL verse kweekmedium.</li>
</ol>3. zaad cellen voor de wondgenezing Assay
<ol><li>Op dag 3, negeren van het medium en wassen van de cellen een keer met 2 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) buffer. Gooi de PBS-buffer.</li>
	<li>Trypsinize de siControl en de siTIP60-behandelde cellen door 1 mL 1 x trypsine-EDTA-buffer toe te voegen aan de plaat. Zet het terug in de incubator voor 20 min.</li>
	<li>4 mL volledige kweekmedium toevoegen aan elke plaat, resuspendeer de cellen door pipetteren en hen overbrengen in een tube van 15 mL.</li>
	<li>Centrifugeer bij 200 g gedurende 5 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen met 5 mL van serumvrij medium en met behulp van een hemocytometer cellen tellen.</li>
	<li>Bereid een celsuspensie van 6 x 105 cellen/mL voor zowel de siControl als de siTIP60; Controleer of de cellen goed gemengd. Voeg 500 µL van de celsuspensie aan één putje van de plaat van een 24-well om ervoor te zorgen 100% confluentie. Zaad van 5 tot en met 6 putten, elk voor siControl en siTIP60.</li>
	<li>Zachtjes schud de plaat heen en weer en dan links-naar-rechts om een gelijkmatige verdeling. Vermijd een cirkelbeweging. Laat de plaat in de incubator gedurende 24 uur.</li>
	<li>De resterende cellen om te controleren de vechtpartij efficiëntie van TIP60 te oogsten. Om dit te doen, centrifugeren van de resterende celsuspensie bij 200 g gedurende 5 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie.</li>
	<li>Isoleren van RNA met behulp van een commerciële reagens, volgens protocol van de fabrikant, en overgaan tot kwantitatieve PCR in real time om de vechtpartij doeltreffendheid te beoordelen.</li>
</ol>4. Maak de wond
<ol><li>Kijk onder een fasecontrastmicroscoop om ervoor te zorgen dat de cellen volledig zijn gekoppeld. Observeren van de cellen onder de Microscoop (4 X, 10 X en 20 X vergroting) om ervoor te zorgen dat de cellen volledig zijn gekoppeld dat een confluente enkelgelaagde van cellen heeft gevormd. Opmerking: siControl cellen meestal hechten beter dan siTIP60 cellen. Dit is omdat de uitputting van de TIP60 de cellen meer mesenchymale-achtige20 maaktverwacht. Hier, wordt een normale benchtop wit-licht fasecontrastmicroscoop gebruikt.</li>
	<li>Voor het genereren van de wond, zachtjes kras een rechte lijn in het midden van de put met een 200 µL Pipetteer tip; de lengte van de wond gegenereerd is gelijk aan de diameter van de put. Herhaal deze stap voor alle resterende putjes. Gebruik een nieuwe Pipet tip voor elk putje.</li>
	<li>Voorzichtig wassen elk goed 5 keer met serumvrij middellange tot de vrijstaande cellen verwijderen.</li>
	<li>1 mL van serumvrij medium toevoegen aan elk putje en overgaan tot live-cel imaging.</li>
</ol>5. setup voor Live-cel Imaging
<ol><li>Inschakelen van de Microscoop en de temperatuurregeling ten minste 1 uur vóór de oprichting van live-cel imaging om ervoor te zorgen dat de temperatuur in de kamer 37 ° C. bereikt</li>
	<li>De levering van het gas kooldioxide (CO2) voordat de beeldvorming van de live-cel inschakelen. Stel de CO2 -concentratie op 5%.</li>
	<li>Plaats de plaat 24-well in het werkgebied van de Microscoop en selecteer het objectief met 10 X vergroting voor imaging. Direct van het uitgestraalde licht aan de oculairs in plaats van de camera en pas de focus om de wond en de cellen eromheen te vinden. Opmerking: In dit geval, wit licht met fase contrast werd gebruikt.</li>
	<li>Gebruik een live-cel waarnemer systeem ter gelegenheid van de positie van de wond in elk putje. Opmerking: De geautomatiseerde fase van het leven-cel imaging systeem voorziet Beeldacquisitie op meerdere posities. Images zijn geschoten op elke gemarkeerde positie eens elk interval.</li>
	<li>Instellen van de tijd voorwaarde: 1 h-interval en 72 h duur; Volgens deze instelling, zal het systeem foto's nemen op elke gemarkeerde positie, elk uur voor 72 h. elke gewenste tijdsinterval instellen en de periode voor monitoring. Opmerking: Hier, een duur van 72 uur is best omdat deze cellen beginnen sterven na 72 uur in serumvrij medium.</li>
</ol>6. het bijhouden van eencellige verkeer
<ol><li>De gegevens exporteren nadat 72 h. de gegevens exporteren als afbeeldingen in JPEG-indeling en als video's in AVI-formaat. Opmerking: Dit is belangrijk omdat ImageJ software alleen video's in AVI-formaat herkent. De andere cel migratie snelheden tussen siTIP60 en siControl cellen is duidelijk waarneembaar in de video.</li>
	<li>De AVI-video in de ImageJ software openen.</li>
	<li>Open de MTrackJ plugin (de plugin moet worden gedownload en geïnstalleerd afzonderlijk): Plugins > MtrackJ.</li>
	<li>Het toevoegen van een track voor afzonderlijke cellen gekozen uit de video door te klikken op de "Add"-tab in de werkbalk van de MtrackJ. Kies een cel op het puntje van de invasieve voorkant en een cel op eigen migreren kunt (eencellige migratie). Volg de beweging van de gekozen cellen op de video en sporen hen met behulp van MtrackJ.</li>
	<li>Meet de afstand van het verkeer door te klikken op het tabblad "maatregel" op de werkbalk. Opmerking: Hier bijna geen cellen in het siControl verplaatst als afzonderlijke cellen, waardoor het moeilijk te meten van eencellige beweging, overwegende dat veel van de siTIP60 cellen als afzonderlijke cellen verplaatst. Het verkeer van cellen gelegen invasieve vooraan kan echter nog worden getraceerd en berekend in zowel siControl als siTIP60 cellen.</li>
	<li>De video met de tracks in AVI-formaat opslaan.</li>
</ol>7. kwantificering van cel migratie vermogen
<ol><li>Selecteer afbeeldingen bij 0 h en afbeeldingen op h van de "n", waarbij "n" naar het timepoint verwijst wanneer de siTIP60 of de siControl cellen hebben de wond volledig gesloten voor kwantificering. Opmerking: Hier, 48 h werd gekozen, zoals de wonden in de siTIP60 cellen werden bijna volledig gesloten.</li>
	<li>Kwantificeren van de percentage migratie met behulp van ImageJ met de volgende formule: (gebied van wond bij 0 h - gebied van wond op "n" h) / gebied van wond bij 0 h x 100.</li>
</ol>

<ol><li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+Tip60+histone+acetyltransferase+in+the+acetylation+and+activation+of+ATM%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).</li>
<li>Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+the+DNA+binding+domain+regulates+transcription-independent+apoptosis+by+p53%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53.</a> J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).</li>
<li>Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Rvb1%2FTip49+is+required+for+the+histone+acetyltransferase+activity+of+Tip60%2FNuA4+and+for+the+downregulation+of+phosphorylation+on+H2AX+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).</li>
<li>Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+functions+of+TIP60%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular functions of TIP60.</a> Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).</li>
<li>Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60+in+DNA+damage+response+and+growth+control%3A+many+tricks+in+one+HAT%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT.</a> Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).</li>
<li>Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+acetylation+of+lysine+3016+of+ATM+activates+ATM+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity.</a> Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).</li>
<li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+the+p53+DNA-binding+domain+regulates+apoptosis+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction.</a> Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).</li>
<li>Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60-dependent+acetylation+of+p53+modulates+the+decision+between+cell-cycle+arrest+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis.</a> Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).</li>
<li>Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tip60+in+human+melanoma+cell+migration%2C+metastasis%2C+and+patient+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).</li>
<li>Gorrini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60+is+a+haplo-insufficient+tumour+suppressor+required+for+an+oncogene-induced+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response.</a> Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+TIP60+by+human+papillomavirus+E6+results+in+attenuation+of+TIP60-dependent+transcriptional+regulation+and+apoptotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway.</a> Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+a+metastasis+suppressor+gene+by+Tip60+and+beta-catenin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes.</a> Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).</li>
<li>Sakuraba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+Tip60+gene+as+a+potential+marker+for+the+malignancy+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer.</a> Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).</li>
<li>Subbaiah, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+ligase+EDD1%2FUBR5+is+utilized+by+the+HPV+E6+oncogene+to+destabilize+tumor+suppressor+TIP60%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60.</a> Oncogene. , (2015).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+steps+of+metastasis%3A+cell+invasion+and+endothelial+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).</li>
<li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIP60+inhibits+metastasis+by+ablating+DNMT1-SNAIL2-driven+epithelial-mesenchymal+transition+program%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program.</a> J Mol Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).</li>
<li>Jonkman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Het is bekend dat in het proces van migratie van de cel, cellen ofwel beweging in de vorm van aanhangend vellen kunnen; losse clusters; of enkele, geïsoleerde cellen. De modus en de dynamiek van de invasie van de cel kunnen variëren van één voorwaarde naar de andere en het fenotype binnen uur kunt wijzigen. De traditionele wondgenezing bepaling is gebaseerd op opnames van de momentopname van een microscoop met een lange tijdsinterval, bijvoorbeeld 12 of 24 h. Dit maakt het moeilijk om de dynamiek van de sluiting van de w...

HIV-Tat-interactieve eiwit 60 kDa (TIP60) is een lysine-acetyltransferase die zowel histone en niet-Histon eiwitten1,2 acetylate kan. De functies worden gevonden gevolgen kunnen hebben in meerdere signaalroutes, met inbegrip van transcriptie, DNA-schade reparatie en apoptosis1,3,4,5,6, 7 , 8. Bovendien TIP60 is vaak werden in kanker, en haar Downregulatie is gecorreleerd met kanker uitzaaiingen en arme survival tarieven9,10,11,12, 13,14. Uitzaaiing van de tumor is de belangrijkste oorzaak van sterfgevallen ten gevolge van kanker. Het is een proces van meerdere stappen, en de eerste stap van metastase impliceert de migratie en invasie van tumorcellen in aangrenzende weefsels15,16. Om dit te doen, tumorcellen eerst moeten loskoppelen van de primaire tumor massa, hetzij in de vorm van een collectief binnenvallende cellaag of vrijstaand als afzonderlijke cellen17. Tijdens dit proces ondergaan vaak tumorcellen epitheliale mesenchymale overgang (EMT), wat resulteert in veranderingen in de morfologie en cel adhesie vermogen17,18.
Een paar technieken zijn ontwikkeld om te bestuderen van de migratie en invasie vermogen van tumor cellen in vitro. Onder hen is de wondgenezing bepaling de meest efficiënte en voordelige19. Deze methode houdt ten eerste de oprichting van een kunstmatige kloof op een confluente enkelgelaagde van cellen, waardoor de cellen om te migreren en de kloof dichten. Ten tweede, kunnen beelden van de lacunes worden vastgelegd aan het begin en einde van het experiment. Tot slot wordt een vergelijking van kloof sluiting gebruikt voor het bepalen van de omvang van de migratie van de cel. Een fase contrast Microscoop wordt meestal gebruikt om beelden voor conventionele wondgenezing testen te vangen. Een ander voordeel van de wondgenezing bepaling is dat deels in vivo tumor cel migratie lijkt. Ook toont in vivo de uitzaaiing van de tumor, cel migratie in de wond-genezing assays zowel de collectieve migratie van epitheliale bladen en de migratie van vrijstaande afzonderlijke cellen.
Echter cel migratie is bekend om zijn dynamische, en er is een noodzaak voor het documenteren van het verkeer van cellen in real-time. Een conventionele wondgenezing assay staat bijvoorbeeld geen een onderzoeker voor het analyseren van eencellige beweging. Aan de andere kant, zijn cellen gekweekt voor wondgenezing testen vaak serum-uitgehongerd voor de remming van celproliferatie. Dit wordt gedaan om het uitsluiten van de mogelijkheid van kloof sluiting als gevolg van celproliferatie. Toch zullen er nog sommige proliferatie en celdood, en fase-contrast beelden genomen vóór en na het experiment niet in staat om onderscheid tussen hen te zijn.
De live-cel beeldvormende techniek richt deze beperking van conventionele wondgenezing tests. Met behulp van een Microscoop wonen-imaging in combinatie met een CO2 incubator en passende temperatuurregeling, onderzoekers de kloof grootte kunnen meten en het percentage van de sluiting na verloop van tijd terwijl tracering van het verkeer van actief migreren cellen gelegen op de toppen van de invasieve voorkant. Vandaar, de uitvoering van live-cel imaging als u wilt controleren cel migratie zal niet alleen het leveren van betere visualisatie van cel migratie, maar zal ook voorzien in de mogelijkheid om te differentiëren tussen cel migratie en celproliferatie, waardoor een meer betrouwbare analyse van cel migratie.
In deze studie werden MCF10A borst epitheliale cellen gebruikt om aan te tonen van de combinatie van de wond-genezing assay en live-cel imaging om te bestuderen van de rol van TIP60 in cel migratie. De uitputting van de TIP60 resulteert in verhoogde migratie capaciteiten in MCF10A cellen.

<table><tbody><tr><td>MCF10A-cel</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317TM</td><td>Borst-epitheelcel</td></tr><tr><td>DMEM/F12-media (1:1)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>MCF10A-cultuurmedia</td></tr><tr><td>Epitheliaal groeifactor (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Supplementen voor MCF10A-cultuurmedia</td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8052</td><td>Supplementen voor MCF10A-cultuurmedia</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-0888</td><td>Supplementen voor MCF10A-cultuurmedia</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-1882</td><td>Supplementen voor MCF10A-cultuurmedia</td></tr><tr><td>Huis serum</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Supplementen voor MCF10A-cultuurmedia</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Voor MCF10A losmaken van plaat</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td>Voor celtelling</td></tr><tr><td>Opti-MEM-media met verminderd serum</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Voor siRNA-mengsel</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>56532</td><td>Transfectie-reagens</td></tr><tr><td>Trizol-reagens</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>Voor mRNA-extractie</td></tr><tr><td>iScript cDNA-synthesekit</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td>Voor cDNA-generatie</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5125</td><td>Voor real-time qPCR</td></tr><tr><td>7500 Fast Real Time PCR-systeem</td><td>Biosystems</td><td></td><td>Real-time qPCR-machine</td></tr><tr><td>10-cm schaal</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td>Voor Knockdown-experiment</td></tr><tr><td>24-wellplaat</td><td>Cellstar</td><td>662160</td><td>Voor wondgenezingstest</td></tr><tr><td>siControl siRNA</td><td>Zelf ontworpen</td><td>Zelf ontworpen</td><td>CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT</td></tr><tr><td>siTIP60 siRNA</td><td>Zelf ontworpen</td><td>Zelf ontworpen</td><td>UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT</td></tr><tr><td>Live cell observer</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss geïnverteerde Cell Observer voor live cel-experimenten</td></tr></tbody></table>

live-imaging van borst epitheliale cel migratie na de voorbijgaande uitputting van tip60

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

De wondgenezing bepaling is efficiënt en één van de voordeligste manieren om de cel migratie in vitrostudie. Conventioneel, images zijn geschoten aan het begin en einde van een experiment met behulp van een Microscoop fase contrast, en de capaciteiten van de migratie van de cellen worden geëvalueerd door de sluiting van wonden. Cel verkeer is een dynamisch verschijnsel echter, en een conventionele methode voor het bijhouden van eencellige verkeer niet mogelijk. We gebruik om te verbeteren huidige wondgenezing testen, live-cel beeldvormingstechnieken cel migratie in real-time volgen. Deze methode laat ons toe om het bepalen van de cel migratie percentage op basis van een cel tracking systeem en biedt een duidelijker onderscheid tussen cel migratie en celproliferatie. Wij tonen hier, het gebruik van live-cel beeldvorming in de wond-genezing testen te bestuderen van de capaciteiten van de verschillende migratie van borst epitheliale cellen beïnvloed door de aanwezigheid van TIP60. Als cel beweeglijkheid zeer dynamisch is, biedt onze methode meer inzicht in de processen van wond genezing dan een momentopname van de wond sluiting genomen met de traditionele beeldvormingstechnieken gebruikt voor wondgenezing testen.

Algemene Schema van Live-Imaging gebaseerde cel migratie Assay Figuur 1A is een schema van dit protocol. MCF10A cellen transfected met siControl toonde typische epitheliale morfologie. Na de uitputting van de TIP60 waren MCF10A cellen meer mesenchymale in vergelijking met cellen (figuur 1B).
Onderzoek van TIP60 vechtpartij efficiëntie</strong...

Hier presenteren we de real-time bewaking van de cel migratie in een wondgenezing assay met behulp van TIP60-verarmd MCF10A borst epitheliale cellen. De uitvoering van live-cel beeldvormingstechnieken in ons protocol kan we analyseren en visualiseren van eencellige verkeer in real time en in de tijd.

Live-imaging van borst epitheliale cel migratie na de voorbijgaande uitputting van TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Het algemene doel van deze procedure is om de effecten van depletie van specifieke genen van belang op celmigratie te observeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over kankermetastasering, zoals de migratie van kankercellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om de dynamische celmigratie in real-time te monitoren.We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we veranderingen in de celmorfologie observeerden na de patiënt van TIP60, een tumorsuppressor. Begin met het uitzaaien van één miljoen borstepitheelcellen in drie milliliter cultuurmedium per 10 centimeter schaal. Voeg 20 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd SRINA-mengsel druppel voor druppel toe aan de experimentele celcultuur.Schud beide schalen handmatig om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig zijn verdeeld voordat u ze in een incubator van 37 graden Celsius plaatst. Vervang na zes uur de supernatanten per schaal door acht milliliter vers cultuurmedium en plaats de culturen terug in de incubator. Vervang de volgende ochtend de supernatanten per schaal door drie milliliter vers cultuurmedium en voeg, zoals zojuist gedemonstreerd, een tweede d

live-imaging-breast-epithelial-cell-migration-after-transient

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een compartimentering microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van kanker stamcellen migratie wordt beschreven. Deze roman platform creëert een levensvatbare cellulaire micro-omgeving en maakt microscopische visualisatie van levende cellen voortbewegen. Zeer beweeglijke kankercellen worden geïsoleerd om moleculaire mechanismen van agressieve infiltratie, wat kan leiden tot een meer doeltreffende toekomstige therapieën te bestuderen.

Evaluatie van kankerstamcel Migratie Met behulp van compartimentering microfluïdische apparaten en live cell imaging

Cellulaire processen zoals celmigratie van oudsher bestudeerd op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Dit rapport beschrijft een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en het analyseren van eiwitten dynamiek in cellen migreren in een meer fysiologisch relevante, drie-dimensionale matrix.

Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix

Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen afkomstig van genetisch gemanipuleerde muizen met borstkanker te bepalen of er correlaties tussen specifieke gedragsparameters en verschillende genetische laesies beoordelen.

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

Door celtransplantatie, cytoskelettenlabeling en verlies/winst van functiebenaderingen te combineren, beschrijft dit protocol hoe de migrererende zebravis prospectieve prechordale plaat kan worden gebruikt om de functie van een kandidaatgen in in vivo celmigratie te analyseren.

analyseren<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo&#39;s

Hier beschrijven we een methode van lange-termijn tijds-lapse microscopie om individuele cellen longitudinaal te volgen in reactie op anti-kanker therapieën.

Through the Looking Glass: Time-lapse microscopie en Longitudinal volgen van enkele cellen aan anti-kanker Therapeutics Studie

Dit protocol beschrijft het gebruik van multiphoton microscopie tot uitgebreide time-lapse beeldvorming van meercellige interacties uit te voeren in real time, in vivo bij enkele resolutie cel.

Extended Time-lapse intravitale Imaging van Real-time Meercellige Dynamiek in de tumor micro

In dit artikel rapporteren we een protocol dat een in vivo methode beschrijft om microtubuli dynamische instabiliteit te meten in docetaxel-resistente borstkankercellen (MCF-7TXT). In deze methode wordt een deconvolutie-microscopie-beeldvormingssysteem gebruikt om de expressie van GFP-tubuline in doelcellen te detecteren.

Live-Imaging om te studeren microtubuli Dynamic Instabiliteit in taxaan-resistente borstkankers

Hier beschrijven we live-cel beeldvormingstechnieken voor het kwantitatief meten van de migratie en invasie van de cellen van de stam van tumor van de hersenen van glioblastoma na verloop van tijd en onder meerdere behandeling voorwaarden.

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Het huidige protocol beschrijft een geïntegreerde methode onderzoek naar kanker cel migratie en invasie op één platform in real-time, het verstrekken van een gemakkelijk reproduceerbaar zijn en tijd-efficiënte optie te bestuderen van de cel mobiliteit en morfologie.

Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager

Hier presenteren we een protocol om de dynamiek van spindel vorming en mitotische progressie te beoordelen. Onze toepassing van time-lapse Imaging stelt de gebruiker in staat om cellen te identificeren in verschillende stadia van mitose, sporen en identificeren mitotische defecten, en analyseren spil dynamiek en mitotische cel lot bij blootstelling aan anti-mitotische drugs.

Live Cell Imaging om de dynamiek van de metafase timing en het lot van de cel na de mitotische spindel perturbations te beoordelen

We rapporteren een techniek die live beeldvorming mogelijk maakt van microtubule dynamica in glioblastoom (GBM) cellen die een gewerveld hersenweefsel binnendringen. Door de orthotopische injectie van fluorescerend gelabelde GBM-cellen te koppelen aan een transparant zebravisbrein met intravitale beeldvorming met hoge resolutie, kan de cytoskeletdynamiek worden gemeten tijdens in situ kankerinvasie.

Live imaging van microtubulidynamica in glioblastoomcellen die het zebravisbrein binnendringen

Leer live-imaging van borst epitheliale celmigratie na TIP60-depletie met MCF10A-cellen. Deze methode maakt real-time monitoring van wondgenezing mogelijk voor kankeronderzoek.

Live-imaging van borst epitheliale cel migratie na de voorbijgaande uitputting van TIP60

Meer video's verkennen