Live-imaging van borst epitheliale cel migratie na de voorbijgaande uitputting van TIP60

Het algemene doel van deze procedure is om de effecten van het uitputten van specifieke genen van belang op celmigratie te observeren. Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen over kankermetastase te beantwoorden, zoals de migratie van kankercellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het dynamische celmigratie in realtime kan worden gevolgd.

We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we veranderingen in de celmorfologie observeerden bij de patiënt van TIP60, een tumorsuppressor. Begin met het zaaien van een miljoen borstpiteelcellen in drie milliliters kweekmedium per 10 centimeter schotel. Voeg druppelsgewijs de SRINA-mengsel toe dat 20 minuten op kamertemperatuur is geïncubeerd aan de experimentele celkweek.

Schud beide schotels handmatig om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig zijn verdeeld voordat u ze in een incubator van 37 graden Celsius plaatst. Vervang na zes uur de supernatanten met acht milliliters vers kweekmedium per schotel en plaats de culturen terug in de incubator. De volgende ochtend vervangt u de supernatanten met drie milliliters vers kweekmedium per schotel en voegt u een tweede portie SIRNA-mengsel toe aan de experimentele celkweek, zoals zojuist is aangetoond, en schudt u de schotel om ervoor te zorgen dat de reagentia volledig zijn gemengd voordat u de cellen terug in de incubator plaatst.

Vervang vervolgens de supernatanten na zes uur met acht milliliters vers kweekmedium en incubeer de culturen een nacht lang. Op dag drie wast u de cellen eenmaal met twee milliliters BPS per plaat en los de cellen in beide platen met één milliliter tripson EDTA per schotel gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie stopt u de reactie met vier milliliters compleet kweekmedium per plaat.

Resuspendeer de cellen door te pipetteren en breng de celsuspensies over in afzonderlijke 15 milliliter buisjes. Verzamel de cellen door centrifugatie en resuspendeer de pellets in vijf milliliters serumvrij medium per buisje. Na het tellen, verdunt u beide celculturen tot een concentratie van 600.000 cellen per milliliter en voegt u 500 microliters cellen van elke cultuur toe aan één putje van een 24-putjesplaat om 100% confluency te garanderen.

Wanneer alle cellen zijn gezaaid, schudt u de plaat voorzichtig heen en weer en van links naar rechts om een gelijkmatige verdeling te garanderen en plaatst u de plaat 24 uur in de celkweekincubator. Om de knock-down-efficiëntie van het gen van belang te controleren, verzamelt u de resterende cellen in de verzamelbuisjes met een andere centrifugatie en isoleert u het RNA van de pellets, met behulp van een commercieel reagens volgens de instructies van de fabrikant voor real-time kwantitatieve PCR-evaluatie. De volgende ochtend, minstens een uur voordat u begint met het live celbeeldvorming, zet u de microscoop en temperatuurregeling aan.

Stel de temperatuur in op 37 graden Celsius en stel de kooldioxidegastoevoer in op 5%. Wanneer de kamer 37 graden Celsius heeft bereikt, gebruikt u fasecontrastmicroscopie om te bevestigen dat de cellen confluërend zijn en volledig aan de bodem van de putjes zijn gehecht. Gebruik vervolgens een pipettenpunt van 200 microliter om voorzichtig een rechte lijn door het hele midden van elk putje te schrapen en spoel alle putjes vijf keer met serumvrij medium om de losgekomen cellen te verwijderen. Voeg na de laatste spoeling één milliliter serumvrij medium toe aan elke put.

Plaats de plaat op het microscooptafel onder het 10-voudige objectief en leid het uitgezonden licht naar de oculairen in plaats van naar de camera. Pas handmatig de scherpstelling aan om elke wond en de cellen eromheen te lokaliseren. Keer vervolgens het uitgezonden licht terug naar de camera en gebruik een live celobservatiesysteem om de positie van de wonden te markeren en de tijdsvoorwaarden in te stellen.

Beeld de cellen af voor de geschikte experimentperiode en open vervolgens de eerste avi-video in de geschikte beeldvormingssoftware en open de m track j plug-in. Klik op het toevoegen-tabblad om een track toe te voegen voor de enkele cellen en kies één cel aan de punt van de invasieve front en één cel die op eigen kracht kan migreren. Volg de beweging van de gekozen cellen op de video met behulp van mtrackJ om hun verkeer te traceren.

Klik vervolgens op het meettabblad om de afstand van de celbeweging te meten en sla de video's op met de tracks in avi-indeling. Na uitputting van TIP60 zijn borstpiteelcellen meer mesenchymal in vergelijking met controle gekweekte cellen. Inderdaad neemt de expressie van TIP60, evenals de expressie van epitheelcel-adhesieve molecuul, significant af na siTIP60-behandeling.

Aan de andere kant wordt de expressie van specifieke epitheel naar mesenchymal overgang driver-genen verhoogd na uitputting van TIP60. Live beeldvorming van de celculturen na wondadministratie toont een snellere celmigratie van siTIP60 behandelde cellen, vergeleken met siControl-culturen, met een significante toename in het percentage migrerende cellen dat wordt waargenomen als reactie op TIP60-uitputting. Verder bewegen siControl-cellen als een blad, terwijl meer enkelcellig bewegen wordt waargenomen binnen de siTIP60-culturen.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een live celbeeldvormingstechniek kunt gebruiken om dynamische veranderingen in celmigratie te monitoren.