Name: Müller Glia cel activatie in een Laser-geïnduceerde Retina degeneratie en regeneratie Model in de zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Leer hoe je focale laserbeschadiging in het zebravisnetvlies induceert en de regeneratie van Müller-glia in vivo monitort met OCT-beeldvorming. Deze methode biedt inzicht in retinale herstelmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Martin Zinkernagel, MD, PhD en Miriam Reisenhofer, PhD voor haar wetenschappelijke bijdrage tot stand te brengen van het model en Federica Bisignani voor haar uitstekende technische bijstand.

alle experimenten vastgehouden aan de instructie voor het gebruik van dieren in Ophthalmic en onderzoek van de visie van de Association for Research in visie en oogheelkunde (ARVO) en de daarmee verband houdende verordeningen van de gouvernementele autoriteiten respecteren.
 1. dieren <ol><li>TgBAC handhaven (gfap:gfap-GFP) zebrafish 167 (AB) spanning tussen 6-9 maanden onder standaardomstandigheden in water met een temperatuur van 26,5 ° C en een licht/donker cyclus 14/10 h 18.</li>
	<li>Volg de richtlijnen van de verzorging van de dieren van de betrokken instellingen voor de dierproeven na goedkeuring door de regeringsautoriteiten.</li>
</ol> 2. Omkeerbare systemische verdoving <ol><li>voorbereiden de stockoplossing ethyl 3-aminobenzoaat methanesulfonate zout (tricaïne) door het oplossen van 400 mg tricaïne poeder in 97.9 mL tank water en 2,1 mL 1 M van Tris gebufferde zoutoplossing (TBS). Aanpassen op pH 7,0 met 1 M Tris (pH 9) en winkel bij 4 ° C in het donker tot één maand. 
	Opmerking: Tricaïne moet worden voorbereid op het water als de natuurlijke leefomstandigheden van het dier, bij voorkeur oorspronkelijke tank water dient.</li>
	<li>De stamoplossing 1:25 in tank water verdunnen en direct gebruiken.</li>
	<li>Plaats van de zebravis in een 10 cm petrischaal met 50 mL verdoving oplossing totdat ze immobiel worden en niet op externe prikkels (ongeveer 2-5 minuten, afhankelijk van gewicht en leeftijd reageren).</li>
	<li>Overbrengen in elke vis met de hand een op maat gemaakte siliconen pin houder voor laserbehandeling ( figuur 1A). 
	LET OP! De vis kan blijven buiten de tank gedurende maximaal 10 minuten alleen narcose.</li>
	<li>Als u wilt omkeren verdoving na de behandeling en/of imaging, plaats u de zebravis in container met tank water.</li>
	<li>Ter ondersteuning van herstel, maken een stroom van verse tank water over de kieuwen door het bewegen van de zebravis heen en weer in het water.</li>
</ol> 3. Laser Focal letsel op netvlies Opmerking: A 532 nm diodelaser is gebruikt voor het maken van focal lichte schade op het netvlies van de zebravis. De experimentele opzet van de laser kan de oprichting van een reproduceerbare focal retinale blessure in volwassen zebrafish.
<ol><li>Het vermogen van de laser instellen: 70 mW; luchtfoto diameter: 50 µm; impulstijd: 100 ms. Let op! Het gebruik van laserlicht vereist passende persoonlijke bescherming en etikettering van het gebied.</li>
	<li>1-2 druppels 2% hydroxypropylmethylcellulose topisch in het oog vóór de behandeling van toepassing en een 2.0 mm lens van de laser van de fundus te richten van de straal van laser-gericht op het netvlies. 
	LET OP! Hydroxypropylmethylcellulose druppels visceus en kan problemen veroorzaken in de ademhaling als het gaat over de kieuwen.</li>
	<li>Plaats vier laser plekken rond de oogzenuw aan de linkerkant van het oog en gebruik van de juiste, onbehandelde oog als interne controle.</li>
</ol> 4. In vivo Beeldvorming van de morfologie van de retinale <ol><li>op dag 0, visualiseren het netvlies zebrafish direct na de inductie van de laser zonder hen heropleving van anesthesie. Op alle andere tijdstippen, dienst algemene anesthesie (zie paragraaf 2: omkeerbare systemische verdoving). Plaats de geïmmobiliseerdet zebravis op een op maat gemaakte siliconen pin houder ( Figuur 1 B, B.1).</li>
	<li>Voor optimale beelden, Knip een verkrijgbare hydrogel contactlenzen aan het oog van de zebravis (Ø = 5.2 mm, r = 2.70 mm, dikte van het centrum = 0,4 mm) door middel van een perforator. Vul het concaaf oppervlak van de lens met methylcellulose en plaats deze over het hoornvlies.</li>
	<li>De OCT-systeem met een 78D contactloze gleuf lamp lens uitrusten.</li>
	<li>Concentreren het infrarood (IR)-beeld in de IR + OCT modus ( figuur 2A) visualiseren van de fundus van het oog en nemen de IR foto's door te klikken op de &#34; verwerven &#34; knop ( figuur 2B) te lokaliseren de Laser vlekken op het netvlies met behulp van het systeem &#39; s software.</li>
	<li>Visualiseren een driedimensionale gedeelte van het netvlies lagen in de IR + OCT modus en neem de foto's door te klikken op de &#34; verwerven &#34; knop ( figuur 2B). Observeren van de ernst van het letsel in de nucleaire buitenlaag (ONL) (zie paragraaf 3: Laser focal letsel op netvlies) in deze beelden.</li>
	<li>Om te keren van anesthesie, na de behandeling en/of imaging plaatst de zebravis in een container met tank water.</li>
	<li>Ter ondersteuning van herstel, maken een stroom van verse tank water over de kieuwen door het bewegen van de zebravis heen en weer in het water.</li>
	<li>Uitvoeren van soortgelijke in vivo imaging van retinale morfologie op dag 1, 3, 7, 14 en week 6.</li>
</ol> 5. De Haematoxyline &#38; eosine (H &#38; E) Staining <ol><li>euthanaseren zebrafish door onderdompeling in koud (4 ° C) verdoving oplossing in de ijskast voor minstens 10 min en enucleate de ogen onmiddellijk door middel van kleine gebogen verlostang.</li>
	<li>De hele ogen in 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C gedurende 20 uur vast te stellen en vervolgens het uitdrogen van de monsters in een gesorteerde alcohol-reeks (xyleen 100% voor 5 min tweemaal, ethanol 100% voor 5 min tweemaal, ethanol 96% gedurende 3 minuten tweemaal en ethanol 70% 3 mi n keer). 
	LET OP! PFA kunnen irriterend voor de ogen, neus en bovenste luchtwegen. PFA is een bekend menselijk carcinogeen en een verdachte reproductieve gevaar.</li>
	<li>De monsters inbedden in paraffine, gesneden 5 µm secties op het niveau van de kop van de oogzenuw en bevestig ze op glas dia's.</li>
	<li>Vlek in de deparaffinized secties met 0,1% zuur Haematoxyline oplossing voor 5 min en dompel de dia's twee keer in gedistilleerd water na het dompelen van dia's in zoutzuur mix (2 mL 25% HCl in 250 mL gedestilleerd water) en ammoniak mix (2 mL 25% ammoniak in 250 mL gedestilleerd water). De secties met waterige oplossing van eosine G 0,5% gedurende 3 minuten na de ontwikkeling van de Haematoxyline door leidingwater voor ten minste 10 min. kleuring vlekken</li>
	<li>Mount gedehydrateerde dia's in acryl hars montage medium en observeren van de dia's onder de lichte Microscoop.</li>
</ol> 6. Immunohistochemistry voor de activering van de MC <ol><li>Heat van de deparaffinized secties in antigeen ophalen buffer (Tris-EDTA + 0,05% niet-ionogene wasmiddel, pH 9.0) gedurende 3 minuten in een passende stoomboot of een magnetron voor 10-15 minuten en spoel driemaal met TBS voor 5 minuten elk.</li>
	<li>Cirkel de secties met een siliconen pen en voeg 100 µL blokkeren oplossing (TBS + 10% geit normale serum + 1% bovien serumalbumine, pH 7,6) bij kamertemperatuur voor 1 h.</li>
	<li>Vlek met anti-gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) konijn polyclonal antilichaam en anti-glutamine synthetase (GS) muis monoklonaal antilichaam, zowel in een 1:200 verdunning (40 µL per monster). Incubeer de dia in een bevochtigde ruimte bij 4 ° C's nachts. Wassen drie keer met TBS + 0,1% Tween 20 voor 5 minuten elk.</li>
	<li>Afwerking visualisatie met de passende secundaire antilichamen. Dit protocol gebruikt een geit anti-konijn IgG H &#38; L groene secundair antilichaam voor GFAP en een geit-antimuis IgG H &#38; L knalrood voor GS, zowel in de verdunning van een 1:500 bij kamertemperatuur voor 1 h.</li>
	<li>Monteren van de dia's met montage medium dat DAPI en observeren van de dia's onder de fluorescentie Microscoop.</li>
</ol>

<ol><li>Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+age-related+macular+degeneration%3A+a+review+of+progress+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date.</a> Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).</li>
<li>Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+Pigmentosa%3A+Genes+and+Disease+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms.</a> Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).</li>
<li>Berson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa.+The+Friedenwald+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).</li>
<li>Strettoi, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4688370/">A Survey of Retinal Remodeling.</a> Front Cell Neurosci. 9, 494(2015).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17113430">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368, 1795-1809 (2006).</li>
<li>Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+mutations+in+retinitis+pigmentosa+and+their+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications.</a> Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).</li>
<li>Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+to+photoreceptor+cell+death+in+inherited+retinal+degenerations%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations.</a> BioEssays. 23, 605-618 (2001).</li>
<li>Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muller+cell+activation%2C+proliferation+and+migration+following+laser+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury.</a> Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).</li>
<li>Newman, E., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M%C3%BCller+cell%3A+a+functional+element+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Müller cell: a functional element of the retina.</a> Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).</li>
<li>Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+neurogenesis+in+the+retinal+ciliary+marginal+zone+of+homeothermic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates.</a> Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).</li>
<li>Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+M%C3%BCller+cells+occurs+during+retinal+degeneration+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats.</a> Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).</li>
<li>DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+Regeneration+Following+OCT-Guided+Laser+Injury+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model visual system.</a> Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).</li>
<li>Fausett, B. V., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+alpha1+tubulin-expressing+M%C3%BCller+glia+in+regeneration+of+the+injured+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina.</a> J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).</li>
<li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+M%C3%BCller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li>
<li>Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+neurogenic+potential+of+M%C3%BCller+gial+cells+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).</li>
<li>Xia, X., Ahmad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+Neurogenic+Potential+of+Mammalian+M%C3%BCller+Glia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia.</a> Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).</li>
<li>Riepe, R. E., Norenburg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cell+localisation+of+glutamine+synthetase+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina.</a> Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).</li>
<li>Derouiche, A., Rauen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coincidence+of+L-glutamate%2FL-aspartate+transporter+%28GLAST%29+and+glutamine+synthetase+%28GS%29+immunoreactions+in+retinal+glia%3A+evidence+for+coupling+of+GLAST+and+GS+in+transmitter+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance.</a> J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).</li>
<li>Bignami, A., Dahl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+radial+glia+of+M%C3%BCller+in+the+rat+retina+and+their+response+to+injury.+An+immunofluorescence+study+with+antibodies+to+the+glial+fibrillary+acidic+%28GFA%29+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein.</a> Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).</li>
<li>Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).</li>
<li>Cameron, D. A., Carney, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mosaic+patterns+in+the+native+and+regenerated+inner+retina+of+zebrafish%3A+implications+for+retinal+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly.</a> J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).</li>
<li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> BMC Dev Biol. 6, 36(2006).</li>
<li>Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral-domain+optical+coherence+tomography+as+a+noninvasive+method+to+assess+damaged+and+regenerating+adult+zebrafish+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).</li>
<li>Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+with+OCT+and+histology+of+photocoagulation+lesions+in+patients+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits.</a> Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).</li>
<li>Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+regeneration+of+photoreceptor+from+M%C3%BCller+glia+after+retinal+degeneration+in+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat.</a> Vision Res. (2), 223-234 (2008).</li>
<li>Thomas, J. L., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+light+damage+paradigm+for+use+in+retinal+regeneration+studies+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (80), e51017(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Netvlies regeneratie/degeneratie in de zebravis is onderzocht door verschillende benaderingen zoals cytotoxin-gemedieerde cel dood22, mechanische schade23en thermische schade24. We een 532 nm diodelaser om schade aan het netvlies zebrafish in dienst. Daarmee is ons model biedt diverse voordelen. Bijvoorbeeld, we snel gemaakt een welomschreven gebied van verwonding gelokaliseerd in de buitenste retina, specifiek in de PRs-laag. Bovendien, deze experim...

Visie is waarschijnlijk de meest essentiële betekenis van de mens en zijn bijzondere waardevermindering heeft een hoge sociaal-economische gevolgen. In de geïndustrialiseerde wereld goed retinale degeneratieve ziekten voor de meerderheid van gezichtsverlies en blindheid onder de volwassen bevolking1. Retinitis pigmentosa (RP) is de meest voorkomende erfelijke oorzaak van blindheid bij mensen tussen de leeftijden van 20 en 60, die ongeveer 1,5 miljoen mensen wereldwijd2,3. Het is een heterogene familie van overgenomen retinale aandoeningen gekenmerkt door progressieve verlies van de researchdieren (PRs) gevolgd door degeneratie van het retinale pigment epitheel en, vervolgens, gliosis en remodeling van innerlijke neuronen4. Het verloop van de ziekte kan worden verklaard door de incrementele verlies van de twee PR celtypes, meestal beginnend met staven, die verantwoordelijk zijn voor Achromatische visie in het schemerige licht en kegels, die essentieel zijn voor kleur visie en gezichtsscherpte5. Een enkel gen-defect is voldoende om het veroorzaken van RP. Tot nu toe zijn meer dan 130 mutaties in meer dan 45 genen geassocieerd met de ziekte6. Dit leidt tot verschillende fenotypes van de ziekte en is een van de redenen dat gentherapie niet-gegeneraliseerd is en dus een ingewikkelde therapeutische aanpak. Daarom is er dringend behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe algemene therapeutische benaderingen voor de behandeling van retinale degenerations in verblindende ziekten.
Retina degeneratie vaak gaat om PR verlies; Dus, de dood van de cel van de PR is een kenmerk van de degeneratieve processen in de retina-7. Het is al gebleken dat de dood van de cel van de PR Müller glia cellen (MC) activering en proliferatie8 stimuleert. MCs, het grote gliale celtype in het netvlies van gewervelde, werden ooit beschouwd als niets meer dan een "lijm" tussen retinale neuronen. In de afgelopen jaren hebben veel studies aangetoond dat MCs fungeren als meer dan louter structurele steun9. Onder de verschillende functies, MCs ook deelnemen aan de neurogenese en repareren van10. Inderdaad, in antwoord op diffusible factoren van de degenererende netvlies, MCs aanzienlijk verhogen gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) expressie. GFAP etikettering kan dus worden gebruikt als een marker voor MC activering als een secundaire reactie op netvlies letsel en degeneratie11.
Onlangs, ontwikkelden we een nieuwe aanpassing van focal letsel met behulp van een laser voor het opwekken van Retina degeneratie in zebrafish (Danio rerio). Focal letsel is voordelig voor de studie van bepaalde biologische processen zoals de migratie van de cellen in de plaats van de gewonden en de precieze timing van gebeurtenissen die tijdens de retinale regeneratie12 plaatsvinden. Bovendien, de zebravis belangrijker geworden in het visuele onderzoek vanwege de overeenkomsten tussen het visuele systeem en dat van andere gewervelde dieren. Bruto morfologische en histologische kenmerken van menselijke en teleost retinae weer enkele verschillen. Dienovereenkomstig, mens en zebrafish retinae bevatten de dezelfde grote cel klassen georganiseerd in gelaagde hetzelfde patroon, waar licht-sensing researchdieren de buitenste laag, bezetten terwijl het netvlies projectie neuronen, de peesknoopcellen, bevinden zich in het binnenste veld neuronale laag, proximale aan de lens. Het netvlies interneuronen, amacrine, bipolaire, en horizontale cellen, localiseren tussen de fotoreceptor en de ganglion cel lagen13. Bovendien is het netvlies zebrafish kegel gedomineerde en dus dichter bij het menselijke netvlies dan, bijvoorbeeld, het intensief bestudeerde knaagdier netvlies. Een fascinerende verschil tussen teleost en zoogdieren is de aanhoudende neurogenese in vis netvlies en netvlies regeneratie na beschadiging. MCs kunnen zebrafish, dedifferentiate en bemiddelen van regeneratie in benadeelde netvlies14,15. In kip hebben MCs sommige capaciteit ook tot Re-Enter de celcyclus en dedifferentiate. Na retinale letsel in volwassen vis, MCs nemen bepaalde kenmerken van voorlopercellen en stamcellen, migreren naar het beschadigde retinale weefsel en produceren van nieuwe neuronen16. Onverwachte overeenkomsten met retinal progenitoren gen expressie profilering van zoogdieren MCs geopenbaard en bewijs voor intrinsieke neurogene potentieel voor MCs in kip, knaagdieren, en zelfs menselijke netvlies groeit17. Echter is waarom de regeneratieve reactie in vogels en zoogdieren is beduidend goedkoper in vergelijking met de robuuste reactie in vis nog niet begrepen. Daarom begrijpen de endogene herstelmechanismes in zebrafish kan stellen voor strategieën voor stimulerende retinale regeneratie bij zoogdieren en mensen. Met betrekking tot de regeling van de endogene reparatie voor MCs als een therapeutisch instrument voor de behandeling van patiënten met Retina degeneratie zou een uitstekende gevolgen voor onze maatschappij hebben.
Hierin bieden we de stappen die nodig zijn om het model van de degeneratie/regeneratie in ophthalmic onderzoek in dienst. We gericht eerst op inducerende focal schade in de hormoonfuncties retina, dan op de beeldvorming van gebeurtenissen op de site van de schade, en ten slotte visualiseren betrokkenheid van de aangrenzende MCs te ontwikkelen. Het algemene protocol is relatief gemakkelijk uit te voeren en een breed scala aan mogelijkheden voor de evaluatie van het netvlies daarna opent.

<table><tbody><tr><td>Acid hematoxylin solution</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>2852</td><td></td></tr><tr><td>Albumine</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>A07030</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Denemarken</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DAPI-montagemedium</td><td>Vector Labs, Burlingame, CA, VS</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eosine G waterige oplossing 0,5%</td><td>Carl Roth, Arlesheim, Zwitserland</td><td>X883.2</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleen diamine tetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Geitenanti-konijn IgG H&L Alexa Fluor&reg; 488</td><td>Life Technologies, Zug, Zwitserland</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Geitenanti-muis IgG H&L Alexa Fluor&reg; 594</td><td>Life Technologies, Zug, Zwitserland</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>Geiten normaal serum</td><td>Dako, Glostrup, Denemarken</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogel contactlens</td><td>Johnson & Johnson AG, Zug, Zwitserland</td><td>n.a.</td><td>1-Day Acuvue Moist</td></tr><tr><td>Hydroxypropylmethylcellulose 2%</td><td>OmniVision, Neuhausen, Zwitserland</td><td>n.a.</td><td>Methocel 2%</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>A5040</td><td>Tricaine, MS-222</td></tr><tr><td>Visulas 532s</td><td>Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Duitsland</td><td>n.a.</td><td>532 nm laser</td></tr><tr><td>Muis anti-GS monoklonaal antilichaam</td><td>Millipore, Billerica, MA, VS</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>HRA + OCT-beeldvormingssysteem</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Duitsland</td><td>n.a.</td><td>Spectralis</td></tr><tr><td>Heidelberg Eye Explorer</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Duitsland</td><td>n.a.</td><td>Versie 1.9.10.0</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-GFAP polyklonaal antilichaam</td><td>Invitrogen, Waltham, MA, VS</td><td>180063</td><td></td></tr><tr><td>Siliconen pinhouder</td><td>Huco Vision AG Zwitserland</td><td>n.a.</td><td>Handmatig gesneden uit siliconen pinmat van de sterilisatielade dienovereenkomstig.</td></tr><tr><td>Spleetlamp BM900</td><td>Haag-Streit AG, Koeniz, Zwitserland</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Spleetlampadapter</td><td>Iridex Corp., Mountain View, CA, VS</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus glasplaatjes</td><td>Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Duitsland</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) stam</td><td>KIT, Karlsruhe, Duitsland</td><td>15204</td><td>http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3</td></tr><tr><td>Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>78D non-contact spleetlamplens</td><td>Volk Optical, Mentor, OH, VS</td><td>V78C</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Zwitserland</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Oculair fundus laserlens</td><td>Ocular Instruments, Bellevue, WA, VS</td><td>OFA2-0</td><td></td></tr><tr><td>2100 Retriever</td><td>Aptum Biologics Ltd., Southampton, Verenigd Koninkrijk</td><td>R2100-EU</td><td>Steamer</td></tr></tbody></table>

müller glia cel activatie in een laser-geïnduceerde retina degeneratie en regeneratie model in de zebravis

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Een fascinerende verschil tussen teleost en zoogdieren is het levenslang potentieel van het teleost netvlies voor retinale neurogenese en regeneratie na ernstige schade. Onderzoeken van de regeneratie-trajecten in zebrafish zou brengen nieuwe inzichten te ontwikkelen innovatieve strategieën voor de behandeling van retinale degeneratieve ziekten bij zoogdieren. Hierin zijn we gericht op de inductie van een focal laesie aan het buitenste netvlies in volwassen zebrafish door middel van een 532 nm diodelaser. Een gelokaliseerde blessure kunt onderzoek naar biologische processen die tijdens de retina degeneratie en regeneratie rechtstreeks op het gebied van schade plaatsvinden. Met behulp van niet-invasieve optische coherentie tomografie (OCT), konden we de locatie van het beschadigde gebied en monitor volgende regeneratie definiëren in vivo. Inderdaad, OCT imaging produceert met hoge resolutie, transversale beelden van het netvlies van de zebravis, het verstrekken van informatie die eerder alleen beschikbaar met histologische analyses was. Om te bevestigen de gegevens uit real-time LGO, histologisch secties werden uitgevoerd en regeneratieve reactie na de inductie van de retinale schade werd onderzocht door immunohistochemie.

Real-time OCT: om het analyseren van de rol van MCs in netvlies reparatie, gebruikten we een laser letsel model inducerende een goed afgebakende zone van schade in de zebravis retina. De site van schade was beeld door middel van in vivo OCT voor de eerste keer (dag 0) binnen 60 minuten na het letsel (Figuur 3). Om te compenseren voor de optica van de fish eye, werd een op maat gemaakte contactlens gelegd op het hoornvlies. Onmiddelli...

De zebravis is een populaire diermodel te bestuderen van de mechanismen van Retina degeneratie/regeneratie in gewervelden. Dit protocol beschrijft een methode om gelokaliseerde letsel verstoren het buitenste netvlies met minimale schade aan het innerlijke netvlies veroorzaken. Vervolgens controleren we in vivo de retinale morfologie en de reactie hierop van Müller, glia hele netvlies regeneratie.

Müller Glia cel activatie in een Laser-geïnduceerde Retina degeneratie en regeneratie Model in de zebravis

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Het algemene doel van deze video is om te laten zien hoe cellulaire veranderingen in vivo kunnen worden gemonitord na focale, laser-geïnduceerde retinale beschadiging bij zebravisjes. Dit model kan u helpen bij het beantwoorden van kernvragen over retinale regeneratie, zoals morfologische veranderingen, kinetiek en de betrokken celtypen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat biologische processen direct op de plaats van de beschadiging kunnen worden onderzocht door een focale letselplek te induceren.Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in de regeneratie van het netvlies van de zebravis, kan deze ook worden toegepast om het herstelmechanisme in verschillende diermodellen te bestuderen. Bereid een voorraadoplossing van het anestheticum door 400 milligrams tricaine-poeder op te lossen in 97.9 millimeters aquariumwater en 2.1 millimeters één molar TBS. Stel de pH bij naar pH 7.0 met één molar tris bij pH 9.Om de werkoplossing te maken, verdun dan de tricaine-stockoplossing 1 op 25 in tankwater en breng 50 milliliter over naar een petrischaal. Plaats de Zebrafish vervolgens gedurende twee tot vijf minuten in de anesthesie-oplossing totdat ze immobiel worden en niet meer reageren op externe stimuli. Verplaats elke vis handmatig naar een op maat gemaakte siliconen pinnenhouder voor laserbehandeling.Geschikte anesthesie is essentieel voor het welzijn van het dier en het succes van de procedure. Daarom is een vers bereide tricaine-oplossing van cruciaal belang, en de tijd buiten het water mag 10 minuten niet ruim overschrijden. Stel het uitgangsvermogen van de 532 nanometer regelbare laser in op 70 milliwatts, de pulsduur op 100 milliseconden en de straaldiameter op 50 microns.Breng vervolgens één tot twee druppels 2% hydroxypropylmethylcellulose aan in het oog. Zorg bij het aanbrengen van methylcellulose in het oog dat de viskeuze oplossing niet in de kieuwen terechtkomt. Gebruik daarna een funduslaserlens van 2 millimeter om de laserrichtbundel op het netvlies te focussen.Plaats vier laserspots rond de oogzenuw van het linker-oog en gebruik het rechter, onbehandelde oog als interne controle. Plaats de nog onder narcose zijnde Zebrafish direct na de laserinductie op een op maat gemaakte siliconen pinhouder in het beeldvormingsgebied. Om optimale beelden te verkrijgen, knipt u met een ponsgatenmaker een commercieel verkrijgbare hydrogel contactlens op maat voor het oog van de Zebrafish.Vul het concave oppervlak van de lens met methylcellulose en plaats deze vervolgens over het hoornvlies. Rust het optische coherentietomografiesysteem uit met een 78D non-contact spleetlamplens. Stel de infraroodafbeelding in IR plus OCT-modus scherp om het oogfundus te visualiseren.Maak vervolgens IR-opnamen door op de acquisitieknop te klikken om de laserplekken op het netvlies te lokaliseren. Visualiseer daarna een driedimensionale sectie van de netvlieslagen in IR-plus-OCT-modus en maak de opnamen door op de acquisitieknop te klikken. Observeer de ernst van het letsel in de buitenste nucleaire laag in deze beelden.Om de anesthesie na de behandeling en beeldvorming ongedaan te maken, plaatst u de zebravis in een bak met aquariumwater. Om het herstel te ondersteunen, creëert u een stroom van vers aquariumwater over de kieuwen door de zebravis heen en weer in het water te bewegen. Direct na de laserbehandeling werd een diffuus hyperreflectief signaal gelokaliseerd in het buitenste deel van het netvlies.Het strekte zich uit van het retinaal pigmentepitheel tot de buitenste plexiforme laag. Het diffuse hyperreflectieve signaal is afwezig in het netvlies van het onbeschadigde controle-oog. Een vergelijkbaar diffuus hyperreflectief signaal werd gedetecteerd op dag één na het letsel.Na dag drie werd dit diffuse signaal georganiseerder en dichter. Het was consistent zichtbaar in de buitenste nucleaire laag en strekte zich uit tot in de fotoreceptorlaag. Na de eerste week was er een significante afname van de gemiddelde laesiegrootte en werd er slechts een klein hyperreflectief signaal gedetecteerd.Vanaf dag 14 tot aan het laatste onderzochte tijdspunt waren de laserspots niet langer zichtbaar op de IR- en OCT-beelden, en is de morfologie van het netvlies vergelijkbaar met die van de controlezijde, hier getoond. H&E-kleuring werd gebruikt om de omvang en kinetiek van de degeneratie en regeneratie van het netvlies te onderzoeken. Deze afbeelding toont de controlesectie.Deze afbeelding toont H&E-kleuring drie dagen na het letsel, wanneer het maximale verlies aan fotoreceptoren zichtbaar is. Er is immunohistochemie uitgevoerd om de gliale celmarkers te visualiseren: glutaminesynthetase in het rood en gliaal fibrillair zuur proteïne in het groen. Deze afbeelding toont een controleretina met zeer weinig groene fluorescentie, wat indicatief is voor GFAP.Het GFAP-signaal was opreguleerd op dag drie na de beschadiging, terwijl het rode glutamine-synthetase-signaal ongewijzigd bleef. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals tweefotonmicroscopie evenals cellulaire en moleculaire analyse, worden uitgevoerd om de betrokkenheid van moleculaire cellen bij endogene herstelmechanismen te bestuderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u focale schade aan het netvlies van de zebravis kunt induceren en hoe u de daaropvolgende degeneratieve en regeneratieve processen in vivo kunt monitoren.

mller-glia-cell-activation-laser-induced-retinal-degeneration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates a procedure to induce retinal degeneration in adult zebrafish using laser injury. The laser targets photoreceptor cells in the retina, triggering cell death and a degenerative process. This damage activates Müller glia (MG) cells, leading to their dedifferentiation into stem cell progenitors that aid in retinal regeneration.

Modeling Retinal Degeneration and Regeneration in Zebrafish Using a Focal Laser Injury

Source: Lahne, M., et.al. Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates live-cell imaging of Muller glial nuclear migration in agarose-embedded zebrafish retinal explants following light-induced photoreceptor damage. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) released by damaged photoreceptors activates Muller glial cells, triggering nuclear migration through the inner and outer nuclear layers for...

Live Cell Imaging of Muller Glial Nuclear Migration During Zebrafish Retinal Regeneration

Hoewel het perifere zenuwstelsel (PNS) in staat is om significant herstel na een blessure, is weinig bekend over de cellulaire en moleculaire mechanismen die dit fenomeen regeren. Met behulp van levende, transgene zebravis en een reproduceerbare zenuw doorsnijding test, kunnen we dynamische gliacel gedrag te bestuderen tijdens zenuw degeneratie en regeneratie.

Motor Nerve doorsnijding en Time-lapse beeldvorming van gliacellen Gedrag Live zebravis

Meerdere lichte schade protocollen zijn beschreven schade fotoreceptoren en dientengevolge een netvlies regeneratie respons bij volwassen zebravissen induceren. Dit protocol beschrijft een verbeterde werkwijze die kan worden gebruikt in gepigmenteerde dieren en beschadigt de meeste staafjes en kegeltjes fotoreceptoren over de gehele retina.

A Novel Lichte Schade Paradigm voor gebruik in retinale Regeneration Studies in Adult zebravis

Hierin tonen we kwantificering van retinale de- en regeneratie en de impact ervan op de visuele functie met behulp van N-methyl-N -nitrosourea in de volwassen zebravissen. Verlies van gezichtsscherpte en verminderde fotoreceptor nummers volgde proliferatie in de binnenste kernlaag. Compleet morfologische en functionele regeneratie trad 30 dagen na de eerste behandeling.

Methyl- (MNU) geïnduceerde retinale degeneratie en regeneratie in de zebravis: histologische en functionele kenmerken

Gegevensmanipulaties om gerichte stress of dood in individuele cellen te veroorzaken, zijn relatief moeilijk te bereiken. Hier wordt een ablatie-aanpak met een resolutie van één cel beschreven om selectief stress te veroorzaken en individuele cellen in celkweek en levende dieren te doden, gebaseerd op een standaard confocale UV-laser.

Triggering Cell Stress en Dood met behulp van conventionele uv laser confocale microscopie

Zebravis netvlies regeneratie is meestal onderzocht met behulp van vaste netvliezen. Echter, dynamische processen zoals interkinetic nucleaire migratie optreden tijdens de regeneratieve respons en vereisen voor live-cell imaging om de onderliggende mechanismen te onderzoeken. We beschrijven hier de cultuur en beeldvorming voorwaarden te controleren Interkinetic Nuclear Migratie (INM) in real-time met behulp van multiphoton microscopie.

Cultuur van volwassen transgene zebravis Retina Explantaten voor Live-cell imaging van Multiphoton Microscopy

Laserablatie is een breed toepasbare technologie voor het bestuderen van regeneratie in biologische systemen. Het gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van een standaard laserscanning confocale microscoop voor laserablatie en de daaropvolgende time-lapse beeldvorming van het regenereren van interneuromastcellen in de zebravis laterale lijn.

Confocale Microscoop-gebaseerde Laser Ablatie en Regeneratie Test in Zebrafish Interneuromast Cellen

Het huidige protocol beschrijft een methode om weefselspecifieke en zeer reproduceerbare verwondingen bij zebravislarven te induceren met behulp van een laserlaesiesysteem in combinatie met een geautomatiseerd microfluïdisch platform voor het hanteren van larven.

Gecontroleerde semi-geautomatiseerde lasergeïnduceerde verwondingen voor het bestuderen van spinale regeneratie bij zebravislarven

Het artikel legt uit hoe de ogen chirurgisch kunnen worden verwijderd van levende zebravislarven als de eerste stap om te onderzoeken hoe retinale input de groei en ontwikkeling van het optische tectum beïnvloedt. Daarnaast biedt het artikel informatie over larvale anesthesie, fixatie en hersendissectie, gevolgd door immunohistochemie en confocale beeldvorming.

Oogverwijdering bij levende zebravislarven om innervatie-afhankelijke groei en ontwikkeling van het visuele systeem te onderzoeken

Dit protocol beschrijft de methodologie om het retinale pigmentepitheel (RPE) genetisch te aborteren met behulp van een transgeen zebravismodel. Het aanpassen van het protocol om signaleringsroutemodulatie met behulp van farmacologische verbindingen op te nemen, is uitgebreid gedetailleerd. Een MATLAB-platform voor het kwantificeren van RPE-regeneratie op basis van pigmentatie werd ontwikkeld en wordt gepresenteerd en besproken.

Nitroreductase/metronidazol-gemedieerde ablatie en een MATLAB-platform (RpEGEN) voor het bestuderen van regeneratie van het retinale pigmentepitheel van de zebravis

Leer hoe je focale laserbeschadiging in het zebravisnetvlies induceert en de regeneratie van Müller-glia in vivo monitort met OCT-beeldvorming. Deze methode biedt inzicht in retinale herstelmechanismen.

Müller Glia cel activatie in een Laser-geïnduceerde Retina degeneratie en regeneratie Model in de zebravis

Meer video's verkennen