Voorbereiding van injecteerbare Hydrogels Chitosan gebaseerde en de toepassing ervan in de 3D-celkweek
September 29th, 2017
Hier beschrijven we een facile voorbereiding van chitosan gebaseerde injecteerbare hydrogels met behulp van dynamische imine chemie. Methoden om aan te passen van de hydrogel mechanische sterkte en de toepassing ervan in de 3D-celkweek worden gepresenteerd.
Het algemene doel van dit protocol is om een injecteerbaar chitosan-hydrogel voor driedimensionale celcultuur te bereiden om uiteindelijk te gebruiken in therapeutische behandelingen. Deze methode kan vragen beantwoorden op het gebied van zelfherstellende hydrogels, zoals hoe een zelfherstellende hydrogel te maken door volledige immersie en hoe deze te gebruiken voor 3D-celcultuur. Het voordeel van deze techniek is dat een compatibele zelfherstellende hydrogel op een zeer eenvoudige manier kan worden bereid en het gebruik van een 3D-celcultuur.
Deze hydrogel is ook injecteerbaar, dus het kan worden gebruikt als drager voor celtherapie. Nu zal de heer Yongsan Li u laten zien hoe u de hydrogel maakt en hoe u de 3D-celcultuur met deze hydrogel uitvoert. Yongsan Li is onze afgestudeerde student van ons lab.
Om de hydrogels te maken, synthetiseer eerst DF PEG. Weeg in een afzuigkap vier gram PEG met een molecuulgewicht van 4.000 af in een rondbodemkolf en voeg 100 milliliter tolueen toe. Verwarm vervolgens de oplossing om de polymeren op te lossen.
Nadat alle polymeren zijn opgelost, gebruikt u een verdamper om alle oplosmiddelen te verwijderen. Herhaal vervolgens het proces van mengen in tolueen en verdampen het nog twee keer om de droge PEG-polymeren te bereiden. Gebruik vervolgens een magnetische roerder en 100 milliliter DHF om de polymeren op te lossen.
Los vervolgens 0,9 gram 4-Carboxybenzaldehyde op in de oplossing. Los vervolgens 0,07 gram dimethylaminopyrimide op in de oplossing. Voeg nu 1,25 gram DCC toe aan een droogbuis gevuld met watervrij calciumchloride.
Laat de reactie nu ongeveer 12 uur op kamertemperatuur roeren. De volgende dag gebruikt u 500 milliliter koude di-ethylether om de witte vaste stoffen te bezinken en gebruikt u vacuümfiltratie om de vaste stoffen te verzamelen. Gooi het opgeloste middel weg en droog de vaste stoffen onder goede ventilatie.
Los vervolgens de witte vaste stoffen op in 100 milliliter THF. Eventuele onoplosbare witte vaste stoffen moeten worden gefilterd voordat verder wordt gegaan. Precipiteer nu de opgeloste vaste stoffen met vers koude di-ethylether.
Gebruik vervolgens vacuümfiltratie om de vaste stoffen te verzamelen en laat ze opnieuw drogen. Herhaal dit proces twee tot drie keer en plaats vervolgens de witte vaste stoffen in een vacuümdroger om ze volledig te drogen. Het resulterende witte poeder is het eindproduct: benzaldehyde-getermineerde DF PEG.
Om de cellen in de hydrogel voor cultivatie in te kapselen, lost u eerst 0,44 gram DF PEG op in twee milliliter celgroeimedia in een buis van vier milliliter. Vortex de mengsel tot een 20% gewichtsoplossing. Steriliseer vervolgens de oplossing.
Laad het in een spuit van 10 milliliter en druk het door een 0,22-micron bacteriënretentief filter. Meng nu 0,165 gram van de glycol-chitosan met vier milliliter celkweekmedium, gebruik een vortex om een 4% chitosanoplossing te maken. Steriliseer vervolgens de oplossing met een ander 0,22-micron bacteriënretentief filter.
Verzamel vervolgens de cellen, zoals L929-cellen met trypsine. Was de verzamelde cellen en suspendeer ze opnieuw in medium bij 3,75 miljoen cellen per milliliter. In de volgende stap worden de cellen in een 3D-matrix geplant.
Volg deze stappen precies om succes te behalen. Meng nu 0,4 milliliter van de celsuspensie met 0,4 milliliter chitosanoplossing met een vortex. Pipet dit mengsel in het midden van een petrischaal met een diameter van twee centimeter en pipet 0,2 milliliter van de DF PEG-oplossing in het schaaltje.
Gebruik vervolgens zachtjes pipetten om de vorming van de hydrogel te induceren. Beoordeel de vorming van de hydrogel door de schaal te kantelen en de viscositeit van de oplossing te observeren. Om de injecteerbaarheid van de ingekapselde cellen te testen, maakt u dezelfde voorbereiding in een spuit van 10 milliliter.
Nadat de hydrogel is gevormd, drukt u het hydrogel langzaam door een naald van 48 gauge in de petrischaal. Voeg vervolgens één milliliter kweekmedium toe aan het hydrogel-celmengsel in de plaat en breng de plaat over naar een incubator voor cultivatie. Om de andere dag ververst u het medium en overdekt u de 3D-hydrogelcelcultuur.
Om de in hydrogels ingekapselde cellen voor beeldvorming voor te bereiden, spoelt u de hydrogels twee keer met één milliliter PBS. Vervolgens kleurt u de hydrogels met fluoresceïne-diacetaat-oplossing en propidiumjodide-oplossing. Leg 0,5 milliliter van beide oplossingen op de hydrogel en incubeer de hydrogel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
Na de korte incubatie met de kleuroplossingen, aspireer alle oplosmiddelen weg. Observeer nu de hydrogels met behulp van confocale microscopie, met excitatie bij 488 nanometer om levende cellen te bekijken en excitatie bij 543 nanometer om dode cellen te bekijken. Verzamel beeldstacks met sneden van twee micron om de verdeling van cellen in de hydrogel te valideren.
L929-cellen. Een typische muisglasvezelcellijn met een in-vivo omgevingweefselstijfheid van ongeveer 5.600 Pascal werd ingekapseld in een hydrogel. Hun levensvatbaarheid was extreem hoog gedurende het hele kweekproces en ze bereikten een opmerkelijke celdichtheid.
Na zeven dagen kweek in de hydrogel was het aantal cellen met 200% toegenomen. Hydrogels die door een naald van 48 gauge op hun celkweekschaal werden gespoten, konden zichzelf herstellen om na ongeveer een uur een geïntegreerd hydrogel te herstellen. Na zeven dagen kweek proliferaeerden deze cellen ook dramatisch. Er werd bewijs gevonden van celdeling, waarbij sommige cellen in tweeen leken te zijn verdeeld.
De live-dood-test toonde een zeer hoge levensvatbaarheid, wat de succesvolle celproliferatie in de 3D-hydrogel na injectie aantoonde. Deze celproliferatiesnelheid was ongeveer 3/4 van die van niet-geïnjecteerde cellen na zeven dagen kweek. Dus, hoewel de schuifkracht tijdens injectie een meetbare negatief effect heeft, waren de geïnjecteerde cell
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het bereiden van injecteerbare chitosan-gebaseerde hydrogels met behulp van dynamische imine chemie. De focus ligt op het aanpassen van de mechanische sterkte van de hydrogel voor toepassingen in driedimensionale celcultuur.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Biomaterialen
- Hydrogels
- Celcultuur
Achtergrond
- Chitosan is een biopolymeer met potentieel in biomedische toepassingen.
- Injecteerbare hydrogels kunnen minimaal invasieve therapieën vergemakkelijken.
- 3D celcultuur modellen zijn cruciaal voor het bestuderen van cellulair gedrag.
- Zelfherstellende eigenschappen verbeteren de functionaliteit van hydrogels.
Doel van het onderzoek
- Om een eenvoudige methode te ontwikkelen voor het creëren van injecteerbare chitosan hydrogels.
- Om de toepassing van deze hydrogels in 3D celcultuur te verkennen.
- Om de zelfherstellende capaciteiten van de hydrogels te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Dynamische imine chemie voor de bereiding van hydrogels.
- Aanpassingen van de mechanische sterkte door formuleringen te veranderen.
- Toepassing van hydrogels in 3D celcultuur opstellingen.
- Demonstratie van het bereidingsproces door een afstudeerstudent.
Belangrijkste resultaten
- De hydrogels vertoonden instelbare mechanische eigenschappen.
- Succesvolle toepassing in 3D celcultuur werd aangetoond.
- Zelfherstellende kenmerken werden bevestigd.
- De methode bleek eenvoudig en effectief te zijn.
Conclusies
- Chitosan-gebaseerde hydrogels kunnen eenvoudig worden bereid voor biomedisch gebruik.
- Deze hydrogels zijn geschikt voor toepassingen in celtherapie.
- De studie draagt bij aan het veld van zelfherstellende materialen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables the rapid preparation of injectable, self-healing chitosan hydrogels for 3D cell culture, offering a tunable platform that mimics physiological tissue stiffness. The dynamic imine chemistry allows for adjustable gelation kinetics and mechanical properties, supporting reproducible encapsulation of cells such as L929 fibroblasts. This approach addresses early-stage challenges in biomaterial design by providing a versatile, biocompatible system for evaluating cell behavior in a controlled 3D microenvironment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular responses in a tunable 3D matrix that mimics native tissue stiffness (~5,600 Pa), supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Facilitates rapid hydrogel formation at room temperature within minutes, allowing high-throughput preparation of standardized 3D culture systems.
- Predictive Value: Self-healing and injectable properties enable assessment of cell resilience under mechanical stress, relevant for delivery-focused target validation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Hydrogels support live/dead staining and confocal imaging, enabling quantitative viability and proliferation readouts in 3D.
- Reproducibility: Consistent gelation via defined glycol chitosan to benzaldehyde-terminated PEG ratios ensures batch-to-batch uniformity for assay standardization.
- Scalability: Simple mixing and vortex-based preparation allows adaptation to multi-well formats for compound screening in 3D environments.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Demonstrated compatibility with L929 fibroblast encapsulation and sustained proliferation supports use in preclinical models of tissue repair.
- Risk-Adjusted Advancement: Self-healing after injection (recovery within ~1 hour) reduces concerns about delivery-induced damage, improving confidence in translational potential.
- Biomaterial Platform: Adjustable stiffness and responsiveness to bioactive stimuli allow modeling of disease-relevant microenvironments for preclinical screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling early evaluation of cell-material interactions before advancing to in vivo models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell proliferation and viability in a defined 3D hydrogel system with tunable mechanical cues.
- Screening: Hydrogel formation is rapid and reagent-efficient, enabling preparation of standardized 3D matrices for compound or genetic perturbation screens.
- Analytics: Compatible with live/dead assays and confocal imaging, providing quantitative, spatially resolved readouts on cell distribution and viability.
- Translational Research: Demonstrated cell proliferation post-injection supports evaluation of delivery strategies in regenerative medicine contexts.
- Enterprise Reuse: The hydrogel platform is reusable across cell types and stimuli, serving as a modular tool for multiple projects in biomaterials and cell therapy research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides a tunable, biomimetic 3D environment that reduces reliance on artificial 2D culture systems, improving physiological relevance.
- Operational Value: Room-temperature gelation, simple mixing, and sterilization via filtration enable rapid, GMP-adaptable preparation without complex equipment.
- Strategic Value: Enables early assessment of delivery-related cell stress, informing go/no-go decisions for cell therapy candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by validating cell survival and function in injectable, self-healing matrices before in vivo investment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polymer chemistry and sterile technique for synthesis of benzaldehyde-terminated PEG and hydrogel formulation.
- Needs access to standard lab equipment: vortex mixer, syringe filters, centrifuge, and confocal microscopy for validation.
- Standardization of glycol chitosan and DF PEG ratios is critical for reproducible gelation time and stiffness across batches.
- Adaptation to other cell types may require optimization of encapsulation density and crosslinking kinetics.
- While injectable, shear forces during delivery may affect cell viability, necessitating empirical validation for each therapeutic cell type.
