Voorbereiding van injecteerbare Hydrogels Chitosan gebaseerde en de toepassing ervan in de 3D-celkweek
29 september 2017
Hier beschrijven we een facile voorbereiding van chitosan gebaseerde injecteerbare hydrogels met behulp van dynamische imine chemie. Methoden om aan te passen van de hydrogel mechanische sterkte en de toepassing ervan in de 3D-celkweek worden gepresenteerd.
Het algemene doel van dit protocol is om een injecteerbaar chitosan-hydrogel voor driedimensionale celcultuur te bereiden om uiteindelijk te gebruiken in therapeutische behandelingen. Deze methode kan vragen beantwoorden op het gebied van zelfherstellende hydrogels, zoals hoe een zelfherstellende hydrogel te maken door volledige immersie en hoe deze te gebruiken voor 3D-celcultuur. Het voordeel van deze techniek is dat een compatibele zelfherstellende hydrogel op een zeer eenvoudige manier kan worden bereid en het gebruik van een 3D-celcultuur.
Deze hydrogel is ook injecteerbaar, dus het kan worden gebruikt als drager voor celtherapie. Nu zal de heer Yongsan Li u laten zien hoe u de hydrogel maakt en hoe u de 3D-celcultuur met deze hydrogel uitvoert. Yongsan Li is onze afgestudeerde student van ons lab.
Om de hydrogels te maken, synthetiseer eerst DF PEG. Weeg in een afzuigkap vier gram PEG met een molecuulgewicht van 4.000 af in een rondbodemkolf en voeg 100 milliliter tolueen toe. Verwarm vervolgens de oplossing om de polymeren op te lossen.
Nadat alle polymeren zijn opgelost, gebruikt u een verdamper om alle oplosmiddelen te verwijderen. Herhaal vervolgens het proces van mengen in tolueen en verdampen het nog twee keer om de droge PEG-polymeren te bereiden. Gebruik vervolgens een magnetische roerder en 100 milliliter DHF om de polymeren op te lossen.
Los vervolgens 0,9 gram 4-Carboxybenzaldehyde op in de oplossing. Los vervolgens 0,07 gram dimethylaminopyrimide op in de oplossing. Voeg nu 1,25 gram DCC toe aan een droogbuis gevuld met watervrij calciumchloride.
Laat de reactie nu ongeveer 12 uur op kamertemperatuur roeren. De volgende dag gebruikt u 500 milliliter koude di-ethylether om de witte vaste stoffen te bezinken en gebruikt u vacuümfiltratie om de vaste stoffen te verzamelen. Gooi het opgeloste middel weg en droog de vaste stoffen onder goede ventilatie.
Los vervolgens de witte vaste stoffen op in 100 milliliter THF. Eventuele onoplosbare witte vaste stoffen moeten worden gefilterd voordat verder wordt gegaan. Precipiteer nu de opgeloste vaste stoffen met vers koude di-ethylether.
Gebruik vervolgens vacuümfiltratie om de vaste stoffen te verzamelen en laat ze opnieuw drogen. Herhaal dit proces twee tot drie keer en plaats vervolgens de witte vaste stoffen in een vacuümdroger om ze volledig te drogen. Het resulterende witte poeder is het eindproduct: benzaldehyde-getermineerde DF PEG.
Om de cellen in de hydrogel voor cultivatie in te kapselen, lost u eerst 0,44 gram DF PEG op in twee milliliter celgroeimedia in een buis van vier milliliter. Vortex de mengsel tot een 20% gewichtsoplossing. Steriliseer vervolgens de oplossing.
Laad het in een spuit van 10 milliliter en druk het door een 0,22-micron bacteriënretentief filter. Meng nu 0,165 gram van de glycol-chitosan met vier milliliter celkweekmedium, gebruik een vortex om een 4% chitosanoplossing te maken. Steriliseer vervolgens de oplossing met een ander 0,22-micron bacteriënretentief filter.
Verzamel vervolgens de cellen, zoals L929-cellen met trypsine. Was de verzamelde cellen en suspendeer ze opnieuw in medium bij 3,75 miljoen cellen per milliliter. In de volgende stap worden de cellen in een 3D-matrix geplant.
Volg deze stappen precies om succes te behalen. Meng nu 0,4 milliliter van de celsuspensie met 0,4 milliliter chitosanoplossing met een vortex. Pipet dit mengsel in het midden van een petrischaal met een diameter van twee centimeter en pipet 0,2 milliliter van de DF PEG-oplossing in het schaaltje.
Gebruik vervolgens zachtjes pipetten om de vorming van de hydrogel te induceren. Beoordeel de vorming van de hydrogel door de schaal te kantelen en de viscositeit van de oplossing te observeren. Om de injecteerbaarheid van de ingekapselde cellen te testen, maakt u dezelfde voorbereiding in een spuit van 10 milliliter.
Nadat de hydrogel is gevormd, drukt u het hydrogel langzaam door een naald van 48 gauge in de petrischaal. Voeg vervolgens één milliliter kweekmedium toe aan het hydrogel-celmengsel in de plaat en breng de plaat over naar een incubator voor cultivatie. Om de andere dag ververst u het medium en overdekt u de 3D-hydrogelcelcultuur.
Om de in hydrogels ingekapselde cellen voor beeldvorming voor te bereiden, spoelt u de hydrogels twee keer met één milliliter PBS. Vervolgens kleurt u de hydrogels met fluoresceïne-diacetaat-oplossing en propidiumjodide-oplossing. Leg 0,5 milliliter van beide oplossingen op de hydrogel en incubeer de hydrogel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
Na de korte incubatie met de kleuroplossingen, aspireer alle oplosmiddelen weg. Observeer nu de hydrogels met behulp van confocale microscopie, met excitatie bij 488 nanometer om levende cellen te bekijken en excitatie bij 543 nanometer om dode cellen te bekijken. Verzamel beeldstacks met sneden van twee micron om de verdeling van cellen in de hydrogel te valideren.
L929-cellen. Een typische muisglasvezelcellijn met een in-vivo omgevingweefselstijfheid van ongeveer 5.600 Pascal werd ingekapseld in een hydrogel. Hun levensvatbaarheid was extreem hoog gedurende het hele kweekproces en ze bereikten een opmerkelijke celdichtheid.
Na zeven dagen kweek in de hydrogel was het aantal cellen met 200% toegenomen. Hydrogels die door een naald van 48 gauge op hun celkweekschaal werden gespoten, konden zichzelf herstellen om na ongeveer een uur een geïntegreerd hydrogel te herstellen. Na zeven dagen kweek proliferaeerden deze cellen ook dramatisch. Er werd bewijs gevonden van celdeling, waarbij sommige cellen in tweeen leken te zijn verdeeld.
De live-dood-test toonde een zeer hoge levensvatbaarheid, wat de succesvolle celproliferatie in de 3D-hydrogel na injectie aantoonde. Deze celproliferatiesnelheid was ongeveer 3/4 van die van niet-geïnjecteerde cellen na zeven dagen kweek. Dus, hoewel de schuifkracht tijdens injectie een meetbare negatief effect heeft, waren de geïnjecteerde cell
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het bereiden van injecteerbare hydrogels op basis van chitosan met behulp van dynamische iminechemie. De focus ligt op het aanpassen van de mechanische sterkte van de hydrogel voor toepassingen in driedimensionale celcultuur.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Biomaterialen
- Hydrogels
- Celkweek
Achtergrond
- Chitosan is een biopolymeer met potentieel voor biomedische toepassingen.
- Injecteerbare hydrogels kunnen minimaal invasieve therapieën faciliteren.
- 3D-celcultuurmodellen zijn cruciaal voor het bestuderen van cellulair gedrag.
- Zelfhelende eigenschappen verbeteren de functionaliteit van hydrogels.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een eenvoudige methode voor het creëren van injecteerbare chitosan-hydrogels.
- Het verkennen van de toepassing van deze hydrogels in 3D-celcultuur.
- Het onderzoeken van de zelfherstellende eigenschappen van de hydrogels.
Gebruikte methoden
- Dynamische iminechemie voor de bereiding van hydrogels.
- Aanpassingen van de mechanische sterkte door wijzigingen in de formulering.
- Toepassing van hydrogels in 3D-celcultuuropsettingen.
- Demonstratie van het bereidingsproces door een promovendus.
Belangrijkste resultaten
- De hydrogels vertoonden aanpasbare mechanische eigenschappen.
- Een succesvolle toepassing in 3D-celkweek werd aangetoond.
- Zelfhelende eigenschappen werden bevestigd.
- De methode bleek eenvoudig en effectief te zijn.
Conclusies
- Chitosan-gebaseerde hydrogels kunnen eenvoudig worden bereid voor biomedisch gebruik.
- Deze hydrogels zijn geschikt voor toepassingen in celtherapie.
- De studie draagt bij aan het vakgebied van zelfhelende materialen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Dit protocol maakt de snelle bereiding van injecteerbare, zelfherstellende chitosan-hydrogels voor 3D-celkweek mogelijk en biedt een instelbaar platform dat de stijfheid van fysiologisch weefsel nabootst. De dynamische iminechemie maakt aanpasbare gelatieringskinetiek en mechanische eigenschappen mogelijk, wat een reproduceerbare inkapseling van cellen, zoals L929-fibroblasten, ondersteunt. Deze aanpak pakt uitdagingen in de beginfase van biomateriaalontwerp aan door een veelzijdig, biocompatibel systeem te bieden voor het evalueren van celgedrag in een gecontroleerde 3D-micro-omgeving.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroegtijdige ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om cellulaire responsen te onderzoeken in een instelbare 3D-matrix die de stijfheid van natuurlijk weefsel (~5.600 Pa) nabootst, wat bijdraagt aan het mechanistische minimaliseren van risico's bij therapeutische hypothesen.
- Operationele waarde: Faciliteert snelle hydrogelvorming bij kamertemperatuur binnen enkele minuten, wat hoogdoorvoerse preparatie van gestandaardiseerde 3D-culturesystemen mogelijk maakt.
- Voorspellende waarde: Zelfherstellende en injecteerbare eigenschappen maken de beoordeling van celresilience onder mechanische stress mogelijk, wat relevant is voor targetvalidatie gericht op toediening.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaar voor analyse: Hydrogels ondersteunen live/dead-kleuring en confocale beeldvorming, wat kwantitatieve metingen van viabiliteit en proliferatie in 3D mogelijk maakt.
- Reproduceerbaarheid: Consistente gelering via gedefinieerde ratio's van glycolchitosan ten opzichte van benzaldehyde-getermineerde PEG waarborgt uniformiteit tussen batches voor de standaardisatie van analyses.
- Schaalbaarheid: Eenvoudige menging en preparatie via vortexing maakt aanpassing aan multi-well-formaten mogelijk voor compound-screening in 3D-omgevingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: De aangetoonde compatibiliteit met inkapseling van L929-fibroblasten en de aanhoudende proliferatie ondersteunen het gebruik in preklinische modellen voor weefselherstel.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Zelfherstel na injectie (herstel binnen ~1 uur) vermindert zorgen over schade door toediening, wat het vertrouwen in het translationele potentieel vergroot.
- Biomateriaalplatform: Aanpasbare stijfheid en responsiviteit op bioactieve stimuli maken het mogelijk om ziekterelevante micro-omgevingen te modelleren voor preklinische screening.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor vroege evaluatie van cel-materiaalinteracties mogelijk is voordat men overgaat naar in vivo-modellen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot celproliferatie en viabiliteit in een gedefinieerd 3D-hydrogelsysteem met instelbare mechanische signalen.
- Screening: De hydrogelvorming is snel en reagens-efficiënt, wat de preparatie van gestandaardiseerde 3D-matrices mogelijk maakt voor screenings van verbindingen of genetische perturbaties.
- Analytica: Compatibel met live/dead-assays en confocale beeldvorming, wat kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste read-outs van celdistributie en viabiliteit oplevert.
- Translationeel onderzoek: Aangetoonde celproliferatie na injectie ondersteunt de evaluatie van afleveringsstrategieën in de context van regeneratieve geneeskunde.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: Het hydrogelplatform is herbruikbaar over verschillende celtypen en stimuli, en dient als een modulaire tool voor meerdere projecten in onderzoek naar biomaterialen en celtherapie.
Operationele & Ondernemingsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een instelbare, biomimetische 3D-omgeving die de afhankelijkheid van kunstmatige 2D-cultuursystemen vermindert, waardoor de fysiologische relevantie wordt verbeterd.
- Operationele waarde: Gelering bij kamertemperatuur, eenvoudig mengen en sterilisatie via filtratie maken een snelle, GMP-aanpasbare bereiding mogelijk zonder complexe apparatuur.
- Strategische waarde: Maakt vroege beoordeling van celstress gerelateerd aan de toediening mogelijk, wat go/no-go-beslissingen voor celtherapiekandidaten informeert.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door celoverleving en -functie te valideren in injecteerbare, zelfhelende matrices voordat er wordt geïnvesteerd in in vivo onderzoek.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in polymeerchemie en steriele techniek voor de synthese van benzaldehyde-getermineerde PEG en de formulering van de hydrogel.
- Toegang tot standaard laboratoriumapparatuur is noodzakelijk: vortexmixer, spuitfilters, centrifuge en confocale microscopie voor validatie.
- Standaardisatie van de verhoudingen tussen glycolchitosan en DF PEG is cruciaal voor een reproduceerbare gelatietijd en stijfheid tussen verschillende batches.
- Aanpassing aan andere celtypen kan optimalisatie van de encapsulatiedichtheid en crosslinking-kinetiek vereisen.
- Hoewel injecteerbaar, kunnen schuifkrachten tijdens de toediening de celviabiliteit beïnvloeden, wat empirische validatie voor elk therapeutisch celtype noodzakelijk maakt.
