Name: Voorbereiding van injecteerbare Hydrogels Chitosan gebaseerde en de toepassing ervan in de 3D-celkweek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Leer hoe je injecteerbare chitosan-hydrogels bereidt met dynamische iminechemie voor 3D-celkweek. Deze methode maakt zelfhelende biomaterialen met verstelbare mechanische eigenschappen voor celtherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door de National Science Foundation of China (21474057 en 21604076).

Let op: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) vóór gebruik. Gebruik de juiste veiligheidspraktijken bij het uitvoeren van experimenten van de chemie, met inbegrip van het gebruik van een zuurkast en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, beschermende handschoenen, laboratoriumjas, enz.). Het protocol vereist standaard cel behandeling technieken (steriliseren, herstel van de cel, cel passaging, bevriezing van de cel, cel kleuring, etc.).
 1. voorbereiding van de Hydrogels <ol><li>synthese van benzaldehyde beëindigd di-matiemaatschappij polyethyleenglycol (PEG DF) <ol><li>pre desiccation PEG polymeer <ol><li>Weeg 4.00 g PEG (MW 4.000, 1.00 mmol) Breng dit in een kolf met ronde bodem (250 mL), en het toevoegen van tolueen (100 mL). 
			Opmerking: Andere pinnen met verschillende molecuulgewichten kan werken voor de hydrogel vorming maar zal leiden tot verschillende stijfheid.</li>
			<li>Verwarm de oplossing door een warmte-pistool (of een warmhoudplaat ongeveer 40 ° C) mild om te helpen met het oplossen van alle de polymeren. Nadat alle de polymeren ontbinden, gebruiken een verdamper te verwijderen van alle de oplosmiddelen. Herhaal deze los en droog proces tweemaal om de gedroogde PEG polymeren. 
			Let op: Dit moet worden uitgevoerd in een zuurkast met uiterste zorg. Tolueen is ontvlambaar.</li>
		</ol></li> <li>Benzaldehyde beëindiging reactie van PEG <ol><li>een magneetroerder en tetrahydrofuraan (THF, 100 mL) Voeg aan de maatkolf en ontbinden van PEG met behulp van een roerder. 4-carboxybenzaldehyde (0.90 g, 6,0 mmol) en 4-dimethylaminopyridine (0.07 g, 0,6 mmol) opeenvolgend toevoegen aan de oplossingen voor alle de lichamen volledig ontbinden.</li>
			<li>Toevoegen N, N &#39;-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6,0 mmol) aan de oplossing, en een droogrek buis dat gevuld is met watervrij CaCl 2 aan de maatkolf toe te voegen. De reactie onder roeren houden bij kamertemperatuur (~ 20 ° C) voor ongeveer 12 h.</li>
		</ol></li> <li>Na reactie proces <ol><li>uitfilteren van de wit-lichamen in de oplossing door vacuüm gegenereerd nadat de reactie is voltooid. Giet de oplossing in koude diethylether (500 mL) onder roeren om het neerslaan van de witte lichamen. Verzamelen van alle de witte lichamen door filter en droog de lichamen in een zuurkast.</li>
			<li>De witte lichamen in THF weer los, uitfilteren van eventuele onoplosbare witte vaste stoffen, giet de oplossing in verse koude diethylether neerslaan van de witte lichamen en droog het. Herhaal dit proces twee tot drie keer, en plaats dan de witte lichamen in een vacuüm drogen oven (20 ° C, 0.1 mbar) hen volledig drogen. Het witte poeder als het eindproduct verzamelen: benzaldehyde beëindigd DF PEG.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Voorbereiding van hydrogels <ol><li>wegen van verschillende hoeveelheden DF PEG (0.11 g, 0.028 mmol 0,22 g, 0.055 mmol; 0.44 g, 0.110 mmol) in een buis (10 mL), Voeg gedeïoniseerd water (5,0 mL) en een vortex of magneetroerder gebruiken om te helpen Los van het polymeer.</li>
		<li>Los glycol chitosan (0.495 g, 6.18 x 10 -3 mmol) in gedeïoniseerd water (15,0 mL) in een buis (50 mL), en een draaikolk voor een paar minuten kunt meng de chitosan oplossing (3 wt %).</li>
		<li>Voeg de glycol chitosan oplossing (0,2 mL, 3 wt %) en DF PEG oplossingen (0,2 mL) opeenvolgend in een buis (2,0 mL). Gebruik een draaikolk te mengen de oplossingen homogeen voor formulier hydrogels in enkele minuten. Volg de ratio's in tabel 1 te maken van verschillende mechanische voordelen hydrogels. 
		Opmerking: Gebruik de buis-inverterende methode om te bepalen of de hydrogel reeds heeft gevormd.</li>
	</ol></li> <li>Reologie analyses <ol><li>reologie analyses op een roterende rheometer met een parallelle staalplaat uitvoeren (diameter: 20 mm). Verspreid voor de gelering test, glycol chitosan oplossing (0,2 mL, 3 wt %) op een lagere plaat. Vervolgens Voeg DF PEG waterige oplossingen (0,2 mL, 2 wt %) ontkleuring gelijkmatig over het oppervlak van de oplossing chitosan en meng met een pipet snel. Lager naar beneden de bovenste plaat en beginnen te test</li>
		<li>Voor hydrogel &#39; s stijfheid test, snijd een hydrogel in een cirkel (diameter: 20 mm) en het meten van de opslag-modulus (G &#39;) waarden versus frequentie analyses op 1% belasting. Typische G &#39; waarden op 6.3 rad s &#8722; 1 zijn vermeld in tabel 1. 
		Opmerking: De reologie analyses van de hydrogel 0.5 h uitvoeren na de vorming van de hydrogel om dynamische binding stabilisatie van de hydrogel.</li>
		<li>Voor de hydrogel &#39; s zelf healable eigenschap testen, een hydrogel in stukken gehakt en de stukken bij elkaar komen om te self-heal naar een integraal stuk. Knip het stuk hydrogel zodat een cirkel (diameter: 20 mm) en zet het op de rheometer voor het uitvoeren van de analyse van de reologie.</li>
	</ol></li></ol> 2. 3D cel teelt in Hydrogels <ol><li>voorbereiding van hydrogel gelering oplossingen <ol><li>wegen DF PEG (0.44 g, 0.11 mmol) in een steriele buis (4,0 mL), toevoegen in cel voedingsbodems (RPMI-1640, 2.0 mL), en met een vortex of roerder helpen ontbinden van het polymeer om te verkrijgen van de polymeeroplossing (20% van de wt). Laden van de oplossing in een injectiespuit (10,0 mL) en vervolgens het steriliseren door het passeren van een micron bacteriën-nulspanningsveilig filter (0,22 µm).</li>
		<li>Wegen de glycol chitosan (0.165 g, 2.06 x 10 -3 mmol) in een steriele buis (15,0 mL), Voeg in cel kweekmedia (RPMI-1640, 4,0 mL) en vortex te helpen oplossen van het polymeer om te verkrijgen van de glycol chitosan oplossing (4.0 wt %). Laden van de oplossing in een injectiespuit (10,0 mL) en filteren met een bacteriën-nulspanningsveilig filter van 0,22 µm.</li>
	</ol></li> <li>Cel teelt in hydrogels Let op: voeren alle celopmaak verwante procedures in de kap van een weefselkweek. Basiskennis van steriele techniek wordt verwacht.
	<ol><li>Voorbereiding van celsuspensie <ol><li>cultuur L929 cellen in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FBS, 5% penicilline (10 mL) in een Petri schotel (diameter 10 cm), en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2. Het medium veranderen elke dag vóór gebruik.</li>
			<li>Oogst de L929 cellen met PBS met trypsine (0,025 w/v %) en EDTA (0,01% w/v), vervolgens centrifugeren (70 x g, 5 min) en resuspendeer de cellen in het RPMI-1640 medium (1,0 mL). De cel tellen met behulp van de standaardwerking van bloed-tellen van bestuur uitvoeren Resuspendeer de cellen zo aanpassen van de concentratie van de cel op ~ 3,75 × 10 6 cellen/mL.</li>
		</ol></li> <li>Cel inkapseling in hydrogels <ol><li>de L929 cel schorsingen (0.4 mL, 3,75 x 10 6 cellen mL -1) mengen met glycol chitosan oplossing (0.4 mL) in een buis (4,0 mL) door vortex. Pipetteer van de L929/glycol chitosan oplossing (0,8 mL) in het midden van een confocal petrischaal (diameter 2,0 cm). Pipetteer de DF PEG oplossingen (0,2 mL) in de dezelfde schotel, en zachtjes Pipetteer Meng de oplossing te induceren hydrogel vorming. 
			Opmerking: De hydrogel vorming beoordelen door het kantelen van de petrischaal.</li>
			<li>Voor directe celcultuur, voegt u extra hoeveelheden RPMI-1640 voedingsbodems (1,0 mL) op de top van de hydrogel. Zet de cel ingesloten hydrogels (1,0 mL 1.5 wt % glycol chitosan, 4.0 wt % DF PEG, 1,5 × 10 6 cellen mL -1) in een incubator (37 ° C, 5% CO 2) en het medium veranderen elke dag. Voorbereiden van cel imaging op dag 1, 3, 5 en 7 na cel inkapseling.</li>
		</ol></li> <li>Voor de 3D na celcultuur in hydrogels na injectie, bereiden cel geladen hydrogel (1,0 mL, zie stap 2.2.2) in een injectiespuit (10,0 mL, 48 G naald). Na de hydrogel vormen, injecteren de hydrogel langzaam in een petrischaal voor confocal imaging. Voeg een extra bedrag van voedingsbodems (1,0 mL) op de top van de hydrogel en wijzig het elke dag. Zet de petrischaal in een incubator (37 ° C, 5% CO 2) en voor te bereiden voor imaging daarna. 
		Let op: Controleer en volg het protocol inzake werking van een injectiespuit.</li>
	</ol></li> <li>Cel rentabiliteit <ol><li>Confocal observatie <ol>
			<li>Spoel de hydrogels met PBS (1,0 mL) voor twee keer. Vlek de hydrogels met fluoresceïne DIACETAAT (FDA, 0,5 mL, 0,05 mg/mL) en propidium jodide (PI, 0,5 mL, 0,08 mg/mL) oplossingen voor 15 min. Na kleuring, het verwijderen van alle de oplosmiddelen.</li>
			<li>Observeren de hydrogels met behulp van een confocal microscoop onder excitatie golflengten van 488 nm en 543 nm te visualiseren levende en dode cellen, respectievelijk. Z-stacks via elke 2 µm-diepte van de hydrogels voor het valideren van een gelijkmatige verdeling van de cellen in de hele nemen. 
			Opmerking: FDA vlekken levende cellen terwijl PI dode cellen vlekken.</li>
		</ol></li> <li>Degraderen de hydrogel (1,0 mL) met azijnzuur (HAc, 3% van de v, 1,0 mL) voor 5 min en Pipetteer in een buis (4,0 mL). Verzamelen van cellen door centrifuge (70 x g, 5 min) en resuspendeer de cellen in het kweekmedium cel van RPMI-1640 (1,0 mL). Uitvoeren van cel tellen met behulp van een bloed tellen bestuur.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliver.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).</li>
<li>Seliktar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+cell-compatible+hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications.</a> Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-mediated+Formation+and+Patterning+of+Hydrogels+for+Cell+Culture+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications.</a> J. Vis. Exp. (115), (2016).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+a+review+of+current+approaches+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%223D+Cell+Culture%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).</li>
<li>Breslin, S., O’Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+the+missing+link+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/255762985_Facilely_prepared_inexpensive_and_biocompatible_self-healing_hydrogel_A_new_injectable_cell_therapy_carrier">Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier.</a> Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+multiresponsive+and+dynamic+chitosan-based+hydrogels+for+controlled+release+of+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2015/TB/c4tb01705f#!divAbstract">An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering.</a> J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).</li>
<li>Ding, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+and+self-crosslinked+polysaccharide+hydrogel+with+autonomous+self-healing+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability.</a> Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-healing+gels+based+on+constitutional+dynamic+chemistry+and+their+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications.</a> Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulus-regulated+3D-cell+proliferation+in+an+injectable+self-healing+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid.+Surface.+B%22%5BJournal%5D)">Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel.</a> Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).</li>
<li>Tseng, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Injectable%2C+Self%E2%80%90Healing+Hydrogel+to+Repair+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System.</a> Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).</li>
<li>Yu, L., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+hydrogels+as+unique+biomedical+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Injectable hydrogels as unique biomedical materials.</a> Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/py/c7py00112f#!divAbstract">Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier.</a> Polym. Chem. , (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2012/CC/c2cc34745h#!divAbstract">A magnetic self-healing hydrogel.</a> Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/py/c6py01704e#!divAbstract">Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation.</a> Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).</li>
<li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).</li>
<li>Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+viscoelastic+behavior+of+subcutaneous+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue.</a> Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+hydrogel+modulus+on+the+proliferation+and+differentiation+of+encapsulated+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells.</a> Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).</li>
<li>Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+functional+groups+for+controlled+differentiation+of+hydrogel-encapsulated+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells.</a> Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hydrogel gepresenteerd in dit protocol (Figuur 1) bestaat uit twee hoofdonderdelen: de natuurlijke polymeer glycol chitosan en een synthetische benzaldehyde beëindigd polymeer gelator DF PEG, die beide biocompatibel materiaal. Synthese van DF PEG wordt gepresenteerd met behulp van een one-step wijziging reactie. PEG met molecuulgewicht 4.000 werd gekozen in dit protocol in de zorgen van de oplosbaarheid, wijziging efficiëntie, evenals hydrogel stijfheid. Een aantal hydrogels met verschill...

Hydrogels zijn kruisverwijzende polymeermaterialen met grote hoeveelheden water en zachte mechanische eigenschappen, en zij zijn gebruikt in vele toepassingen van de bio-medische1,2. Hydrogels kan bieden een zachte en natte omgeving, die zeer vergelijkbaar met de fysiologische omgeving voor cellen in vivo is. Daarom, hydrogels uitgegroeid tot een van de meest populaire steigers voor 3D cel cultuur3,4. Vergeleken met de cultuur van de cel van de petrischaal 2D, 3D-celkweek beschikt over geavanceerde snel om aan te bieden dat een extracellulaire matrix (ECM) geïmiteerd communicatie voor cellen te contacteren en te assembleren voor de proliferatie en differentiatie doeleinden5. Daarnaast kon hydrogels die natuurlijke polymeren bevatten bio-compatibel en bevordering van omgevingen voor cellen vermenigvuldigen en onderscheiden3bieden. Hydrogels afgeleid van synthetische polymeren hebben de voorkeur voor hun eenvoudige en duidelijke onderdelen, welke uitsluiten van complexe invloeden zoals eiwitten van dierlijke oorsprong of virussen. Hydrogels die gemakkelijk worden voorbereid en hebben een consistente eigenschap hebben onder alle hydrogel kandidaten voor 3D-celkweek, altijd de voorkeur. De faciliteit aan te passen van de hydrogel eigenschappen aanpassen aan verschillende onderzoek eisen is belangrijk als goed6.
Hier introduceren we een facile voorbereiding van een glycol chitosan gebaseerde hydrogel met behulp van dynamische imine chemie, die een veelzijdige hydrogel platform voor 3D cel cultuur7wordt. Bij deze methode worden bekende bio-compatibele glycol chitosan gebruikt om frames van de hydrogel van netwerken. De amino groepen zijn reageerde met een polyethyleenglycol benzaldehyde beëindigd als het polymeer gelator dynamische imine obligaties vormen als crosslinkages van hydrogels8. Dynamische imine obligaties kunnen vormen en ontleden omkeerbaar en servicegerichte omgeving, waarmee de hydrogels met mechanisch verstelbare kruisverwijzende netwerken9,10,11. Vanwege de hoge water inhoud, bio-compatibele materialen, en instelbare mechanische krachten, is de hydrogel met succes toegepast als een steiger voor L929 cellen in 3D cel cultuur12,13. Het protocol hier een overzicht van de procedures, met inbegrip van polymeer gelator synthese, hydrogel voorbereiding cel insluiten en 3D cel kweken.
De hydrogel toont ook verschillende andere functies als gevolg van de dynamische imine-crosslinkages, met inbegrip van haar multi inspelen op verschillende bio-stimuli (zuur/pH, vitamine B6 afgeleide pyridoxal, eiwit papaïne, enz.), wat erop duidt dat de hydrogel kon worden geïnduceerde te ontleden onder fysiologische omstandigheden8. De hydrogel is ook zelf healable en injecteerbare, wat betekent de hydrogel kan worden beheerd via een minimaal invasieve injectie-methode en een voordeel in drugs- en cel leveringen14,15. Door toevoeging van functionele additieven of specifieke vooraf ontworpen polymeer gelators, de hydrogel compatible bij het verkrijgen van specifieke eigenschappen zoals magnetische, temperatuur, pH responsieve, etc.16,17, die kan voldoen aan een breed scala van onderzoek eisen. Deze eigenschappen onthullen de potentiële capaciteit van de hydrogel als een injectable meerdere vervoerders voor drugs en cellen in zowel in vitro en in vivo biomedisch onderzoek en toepassingen.

<table><tbody><tr><td>Glycol chitosan</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>39280-86-9</td><td>90% deacetyleringsgraad</td></tr><tr><td>4-Carboxybenzaldehyde</td><td>Shanghai Aladdin&nbsp;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td><td>619-66-9</td><td>99%</td></tr><tr><td>N, N'-dicyclohexylcarbodiimide</td><td>Shanghai Aladdin&nbsp;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td><td>538-75-0</td><td>99%</td></tr><tr><td>Calcium chloride anhydrous</td><td>Shanghai Aladdin&nbsp;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td><td>10043-52-4</td><td>96%</td></tr><tr><td>4-dimethylamiopryidine</td><td>Shanghai Aladdin&nbsp;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td><td>1122-58</td><td>99%</td></tr><tr><td>Polyethyleneglycol</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>5254-43-7</td><td>99%</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>109-99-9</td><td>99%</td></tr><tr><td>Tolueen</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>108-88-3</td><td>99%</td></tr><tr><td>Ethyl ether</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>60-29-7</td><td>99%</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>64-19-7</td><td>99%</td></tr><tr><td>Watervrij CaCl2</td><td>Sino-pharm Chemical Reagent</td><td>10043-52-4</td><td>99%</td></tr><tr><td>Fluoresceïnediacetaat</td><td>Sigma</td><td>596-09-8</td><td>99%</td></tr><tr><td>Propidiumjodide&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>25535-16-4</td><td>94%</td></tr><tr><td>RPMI-1640 kweekmedium</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td></td><td>0.25%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td></td><td>0.01 M</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine-oplossing</td><td>Hyclone</td><td></td><td>10.000 U/ml</td></tr><tr><td>Reometer</td><td>TA Instrument</td><td></td><td>AR-G2</td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>710-3kanaals</td></tr><tr><td>L929-cellen</td><td>ATCC</td><td></td><td>NCTC clone 929; L cell, L929, afgeleid van Strain L</td></tr><tr><td>Verdamper</td><td>EYELA</td><td></td><td>N-1100</td></tr><tr><td>48-gauge naald</td><td>ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD</td><td></td><td>48-gauge</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Leica</td><td></td><td>DM3000 B</td></tr><tr><td>Microscoopsoftware</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warmtepistool</td><td>Confu</td><td></td><td>KF-5843&nbsp;</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>NEST</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van injecteerbare hydrogels chitosan gebaseerde en de toepassing ervan in de 3d-celkweek

Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

Het protocol presenteert een facile, efficiënte en veelzijdige methode ter voorbereiding van de chitosan gebaseerde hydrogels met behulp van dynamische imine chemie. De hydrogel is bereid door oplossingen van glycol chitosan mengen met een gesynthetiseerde benzaldehyde beëindigd polymeer gelator en hydrogels efficiënt in enkele minuten bij kamertemperatuur worden verkregen. Door verschillende verhoudingen tussen glycol chitosan, polymeer gelator en water inhoud, zijn veelzijdige hydrogels met verschillende gelering tijden en stijfheid verkregen. Wanneer beschadigd zijn, kan de hydrogel zijn optredens en modulus, als gevolg van de omkeerbaarheid van de dynamische imine obligaties als crosslinkages terugkrijgen. Deze zelfstandige healable eigenschap kunt de hydrogel als injecteerbare omdat het zichzelf genezen van geperste stukken aan een integraal bulk hydrogel na de injectie proces worden kan. De hydrogel is ook multi inspelen op veel bio-actieve prikkels als gevolg van verschillende evenwichtsinstelling statussen van de dynamische imine obligaties. Deze hydrogel werd bevestigd als bio-compatibel, en L929 muis fibroblast cellen waren ingesloten volgende standaardprocedures en de celproliferatie was gemakkelijk beoordeeld door een kweekproces 3D cel. De hydrogel kan bieden een verstelbare platform voor verschillende onderzoek waar een fysiologische nabootsen van een 3D-omgeving voor cellen is geprofiteerd. Samen met haar multi responsieve, zelf healable en injecteerbare eigenschappen, de hydrogels potentieel toepasbaar als meerdere dragers voor drugs en cellen in toekomstige bio-medische toepassingen.

In Figuur 1is een schematische presentatie van dit protocol betreffende hydrogel voorbereiding en het gebruik ervan als 3D-celkweek aangeboden. Informatie van de inhoud en de ratio's bereid met verschillende mechanische sterkte van de hydrogel is samengevat in tabel 1. De hydrogel's zelf healable en reologie eigenschap presenteert de hydrogel van stijfheid van opslag modulus versus frequentie test in Figuur 2. De confocal beelden van de cel en d...

Hier beschrijven we een facile voorbereiding van chitosan gebaseerde injecteerbare hydrogels met behulp van dynamische imine chemie. Methoden om aan te passen van de hydrogel mechanische sterkte en de toepassing ervan in de 3D-celkweek worden gepresenteerd.

Voorbereiding van injecteerbare Hydrogels Chitosan gebaseerde en de toepassing ervan in de 3D-celkweek

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

Het algemene doel van dit protocol is het bereiden van een injecteerbare chitosan-hydrogel voor driedimensionale celcultuur, om deze uiteindelijk in therapeutische behandelingen toe te passen. Deze methode kan vragen beantwoorden in het vakgebied van zelfhelende hydrogels, zoals hoe men op een eenvoudige manier een zelfhelende hydrogel kan maken en hoe deze kan worden gebruikt voor 3D-celcultuur. Het voordeel van deze techniek is dat er op een zeer eenvoudige wijze een compatibele zelfhelende hydrogel kan worden bereid en dat deze geschikt is voor 3D-celcultuur.Deze hydrogel is bovendien injecteerbaar, waardoor hij als drager voor celtherapie kan worden gebruikt. De heer Yongsan Li zal u nu laten zien hoe u de hydrogel maakt en hoe u 3D-celcultuur uitvoert met behulp van deze hydrogel. Yongsan Li is een promovendus in ons laboratorium.Om de hydrogels te maken, moet eerst DF PEG worden gesynthetiseerd. Weeg in een zuurkast vier gram PEG met een molecuulgewicht van 4.000 af in een rondbodemkolf en voeg 100 milliliter tolueen toe. Verwarm vervolgens de oplossing om de polymeren op te lossen.Nadat alle polymeren zijn opgelost, wordt een verdamper gebruikt om alle oplosmiddelen te verwi

preparation-chitosan-based-injectable-hydrogels-its-application-3d

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Een belangrijke hindernis in de huidige stamceltherapie is het bepalen van de meest effectieve methode om deze cellen te leveren aan gastheer weefsels. Hier beschrijven we een chitosan-gebaseerde levering methode die is efficiënt en eenvoudig in aanpak, terwijl vet-afgeleide stamcellen om hun multipotent te behouden.

De bouw van een Collageen Hydrogel voor de levering van Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Een bioprinter werd gebruikt om gevormde hydrogelen gebaseerd op een offer mal maken. De poloxamer mal werd opgevuld met een tweede hydrogel en vervolgens geëlueerd, waardoor holtes die gevuld waren met een derde hydrogel. Deze methode maakt gebruik van snelle elutie en goede bedrukbaarheid van poloxameer om complexe architecturen uit biopolymeren genereren.

Afdrukken warmteresponsieve Reverse Mallen voor de schepping van Patterned Hydrogelen Twee-component voor 3D Cell Culture

Kraakbeenherstel vormt een onopgeloste medische uitdaging en cel-gebaseerde benaderingen om menselijk articulair kraakbeen te ontwikkelen zijn een veelbelovende oplossing. Hier beschrijven we driedimensionale (3D) biomimetische hydrogels als een ideaal hulpmiddel voor de uitbreiding en rijping van menselijke articulaire kraakbeencellen.

3D Hydrogel Stellingen voor Articulaire Chondrocyte Cultuur en Kraakbeen Generation

Injecteerbare tissue engineering scaffold uit poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat (PNIPAAm-g-CS) bevattende alginaat microdeeltjes bereid. De hechtsterkte, zwelvermogen en in vitro biocompatibiliteit geanalyseerd in deze studie. De karakterisering technieken die hier ontwikkeld kan van toepassing zijn op andere thermogelling systemen.

Synthese van Thermogelling Poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat Composites met Alginaatmicrodeeltjes voor Tissue Engineering

Dit is een methode om een ​​3-dimensionale celcultuur scaffold aan pulmonale extracellulaire matrix te creëren. Intact long verwerkt tot hydrogelen die de groei van cellen in drie dimensies kan ondersteunen.

Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture

Verschillende methoden voor het manipuleren van driedimensionale architectuur in hydrogels op basis van eiwitten zijn hier geëvalueerd met betrekking tot de eigenschappen van het materiaal. De macroporeuze netwerken zijn matiemaatschappij met een peptide cel-lijm, en hun haalbaarheid in celkweek wordt geëvalueerd met behulp van twee verschillende model cellijnen.

Gemakkelijke manipulatie van platforms in op basis van eiwitten Hydrogels voor cel cultuur toepassingen

Dit protocol beschrijft de fabricage van elastische 3D macroporeuze microcryogels door de integratie van microfabrication met cryogelation-technologie. Bij het laden met cellen, worden 3D-microtissues gegenereerd, die kan gemakkelijk ingespoten in vivo om regeneratieve therapie of geassembleerd tot arrays voor in vitro high-throughput drug screening.

3D Microtissues voor injecteerbare regeneratieve therapie en High-throughput Drug Screening

Hier presenteren we een protocol voor 3D-cultuur systemen bij het zelf monteren van peptide steigers ter bevordering van de differentiatie van dedifferentiated menselijke articulaire chondrocyten in kraakbeen-achtig weefsel.

Kweken van zoogdiercellen in driedimensionale Peptide steigers

Recombinant eiwit-engineered hydrogels zijn voordelig voor 3D-celkweek als ze toe voor volledige tunability van de ruggengraat van het polymeer, en dus de cel communicatie. Hier beschrijven we het proces van recombinante elastine-achtige EiwitReiniging en de toepassing ervan in 3D hydrogel cel inkapseling.

Productie van elastine-achtige eiwitten Hydrogels voor inkapselen en immunokleuring van cellen in 3D

Hier presenteren we protocollen van kweken menselijke parodontitis ligament (PDL) cel sferoïden door Chitosan films. De cultuur van drie-dimensionale (3D) cellulaire sferoïden biedt een alternatief voor conventionele weefselcultuur polystyreen (TCPS) cultuursysteem.

Vorming van menselijke parodontitis ligament Cell Sferoïden op Chitosan films

Het huidige protocol beschrijft een niet-emulsie-gebaseerde methode voor de fabricage van chitosan-genipin microgels. De grootte van deze microgels kan nauwkeurig worden gecontroleerd en ze kunnen pH-afhankelijke zwelling vertonen, in vivo afbreken en worden geladen met therapeutische moleculen die in de loop van de tijd op een duurzame manier vrijkomen, waardoor ze zeer relevant zijn voor tissue engineering-toepassingen.

Fabricage van maatgecontroleerde en emulsievrije Chitosan-Genipin-microgels voor tissue engineering-toepassingen

Leer hoe je injecteerbare chitosan-hydrogels bereidt met dynamische iminechemie voor 3D-celkweek. Deze methode maakt zelfhelende biomaterialen met verstelbare mechanische eigenschappen voor celtherapie.

Voorbereiding van injecteerbare Hydrogels Chitosan gebaseerde en de toepassing ervan in de 3D-celkweek

Meer video's verkennen