Name: In Vivo Assay voor detectie van antigeen-specifieke T-cel cytolytische functie met behulp van een vaccinatie-Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Leer een in vivo-assay voor antigeen-specifieke T-cel cytolytische functie met een muizen vaccinatiemodel. Deze methode maakt snelle evaluatie van immuunresponsen mogelijk zonder afhankelijkheid van tumorgroei.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door de NIH onderzoek (A1R03AI120027 (RN) en 1R21AI20012 (RN)), institutionele onderzoek Grant (RN), start-up verlenen (RN) en MD Anderson CIC zaad verlenen (RN).

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de University of Texas MD Anderson Cancer Center.
1. voorbereiding van Peptide van het vaccin
<ol><li>Los van het gelyofiliseerd peptide met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om de juiste concentratie en vortex voor 30 s. Opmerking: Voor hgp10025-33, de eindconcentratie is 1 mg/mL en voor eicellen257-264, de eindconcentratie is 0,5 mg/mL. Peptide vóór injectie te reconstrueren. Bewaar niet na reconstitutie.</li>
</ol>2. isolatie van Splenocytes van transgene muis
Opmerking: Cel los van de milt moet worden uitgevoerd in een steriele wijze.
<ol><li>
De OT-1 transgene muis met behulp van de goedgekeurde CO2 verstikking methode euthanaseren en verwijderen van de milt. Opmerking: Passende transgene muis wordt gebruikt in deze stap specifiek voor de peptide van keuze.<ol>
<li>Leg de muis op de rechterkant. Spray de linkerzijde van de muis met 70% ethanol (EtOH). Trek de huid met behulp van Tang en knippen van de huid met behulp van chirurgische schaar; de milt zullen zichtbaar zijn binnen de peritoneale holte. Voorzichtig opengesneden de peritoneale holte voor toegang tot de milt. Het verwijderen van de milt met pincet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De milt gedesag door te plaatsen het in een 70 µm filter in een petrischaal met 2 mL medium A (PBS met 1% foetale runderserum (FBS)) en smashing de milt met het einde van een zuiger.
	<ol>
<li>Het verzamelen van de splenocytes van de petrischaal en de plaats in een conische tube van 50 mL. Wassen van de petrischaal met 5 mL medium A tweemaal om te verzamelen van alle cellen. Medium een up toevoegen aan 25 mL en de cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 475 x g centrifugeren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De cellen gecombineerd en resuspendeer in 1 mL / per milt rode bloedcellen (RBC) lysis-buffermengsel. Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. Voeg toe 10 mL medium A centrifuge bij kamertemperatuur op 475 x g. resuspendeer de pellet in 10 mL medium A en verwijderen van vuil door het filteren van de celsuspensie door een 70 µm filter in een schone 50 mL kegelvormig.</li>
	<li>
Cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometer tellen. Resuspendeer de cellen in PBS om een eindconcentratie van 106 - 1006 cellen/mL. Voor eicellen257-doden,264 specifieke resuspendeer bij 106 cellen/mL en voor hgp10025-33 specifieke doden, resuspendeer bij 1006 cellen/mL.
	<ol>
<li>Draai de resterende cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op 475 x g. gecombineerd het supernatant en resuspendeer in 15 mL koude PBS te wassen van de cellen. Herhaal de wassen stap nog eens. Draai de cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op 475 x g. gecombineerd het supernatant en resuspendeer in koude PBS volgens het eindvolume bepaald in stap 2.4.</li>
		<li>Enkele celsuspensie overbrengen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge en houd op ijs tot injectie in ontvangende C57/BL6 muis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. injectie van Splenocytes van transgene muizen
<ol><li>Plaats de ontvanger C57/BL6 muis in een afdekking met de dorsale zijde omhoog. Spray injectie tail basisareaal met 70% isopropyl alcohol. 100 µL van eencellige schorsing (sectie 2) intraveneus beheren in de ader van de staart een 27 G naald met de schuine kant naar boven.</li>
</ol>4. Covax-administratie
Opmerking: Als de cellen geïnjecteerd in de middag, moet aan covax de volgende ochtend binnen 18 h van cel injectie worden toegediend.
<ol><li>Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een duidelijke anesthesie-doos met 1-3% Isofluraan. Nadat muizen zijn volledig verdoofd, de muizen naar de neus kegels gekoppeld aan de variëteit in de anesthesie-zaal overbrengen. Muizen terughoudend met de dorsale zijde omhoog houden. Opmerking: Afstomping wordt bevestigd door een korte teen snuifje om te controleren of dat een intrekking reactie niet wordt opgewekt. Federale wet beperkt Isofluraan gebruik op voorschrift van een erkende dierenarts.</li>
	<li>Spray injectie tail basisareaal met 70% isopropyl alcohol. 100 µL van peptide oplossing (van sectie 1) subcutaan injecteren met behulp van een 27 G naald met de spuit doordringing van 4-5 mm in de staart basis regio, de naald schuine zijde naar boven. Opmerking: Muizen zijn ingeënt in Eén flank met subcutane injectie aan de voet van de staart10.</li>
	<li>Breng 100 µL anti-interactie CD40 antilichaam (0,5 mg/mL stockoplossing) lateral aan de injectieplaats vaccin.</li>
	<li>Breng zorgvuldig imiquimod crème 50 mg/muis op de sites van de vaccinatie. Wrijf imiquimod crème op het oppervlak, totdat de room niet meer zichtbaar is en volledig geabsorbeerd wordt.</li>
	<li>Injecteren van 100 µL van 100.000 IE/mL rhIL-2 eiwit intraperitoneally (i.p.) bij de lagere abdominale regio. Observeren muizen gedurende 5 min. nadat ze volledig van anesthesie herstellen. Opmerking: Experiment is onderbroken op dit punt voor 3 dagen.</li>
</ol>5. isolatie van Target Splenocytes voor het labelen met CFSE
Opmerking: Cel los van de milt moet worden uitgevoerd in een steriele wijze.
<ol><li>De C57BL/6 muizen volgens goedgekeurde CO2 verstikking methode euthanaseren. Verwijderen van spleen(s) zoals in stap 2.1.1. Gedesag van de milt en wassen van splenocytes zoals in stappen 2.2.1 - 2.2.3. Lyse van rode bloedcellen zoals in stap 2.3 - 2.3.2.</li>
	<li>Verwijderen van de cellen voor het tellen van de met behulp van een hemocytometer en berekenen voor een eindconcentratie van cellen op 106 cellen/mL in CFSE-labeling oplossing (beschreven in stap 7). Spin resterende cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op 475 x g. Aspirate supernatant.</li>
</ol>6. peptide pulserende van Target Splenocytes
Opmerking: Peptide pulserende moet worden uitgevoerd in een steriele wijze.
<ol><li>Resuspendeer de cellen bij 106 cellen/mL in volledige media (RPMI 1640 media met 10% FBS, 1% L-glutamine (L-Gln), 1% penicilline/streptomycine (Pen/Strep)). Verdeel de cellen in 2 buizen (15 mL conicals). Label elke buis als gepulseerde of unpulsed.</li>
	<li>
Peptide aan de buis met het label gepulseerde toevoegen Voor eicellen257-264 pulserende, voeg 1 µg/mL en voor hgp10025-33 pulserende, voeg 2 µg/mL. Opmerking: De unpulsed cellen ondergaan de dezelfde incubatie als de gepulste cellen maar wel zonder de toevoeging van de peptide.<ol>
<li>Incubeer de cellen + peptide bij 37 ° C gedurende 1 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 10 mL van de volledige media (RPMI 1640 media met 10% FBS, 1% L-glutamine (L-Gln), 1% penicilline/streptomycine (Pen/Strep)) aan elke buis te wassen zowel gepulseerde en unpulsed van de doelcellen. Spin resterende cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op 475 x g. Aspirate supernatant.</li>
</ol>7. bereiding van CFSE voor het labelen van de Target Splenocytes
<ol><li>
CFSE-labeling oplossing gedurende de cel wassen in stap 6.3; voorbereiden de gepulste cellen zal worden aangeduid als CFSEHallo en de unpulsed als CFSElo. 1 mL van CFSE-labeling oplossing voorbereiden 106 cellen. Opmerking: CFSE is licht gevoelig en moet worden beschermd tegen licht te allen tijde.<ol>
<li>Voorbereiden CFSEhi -media labelen door toevoeging van 1 uL/mL CFSE (stockoplossing 5 mM) voor een eindconcentratie van 5 µM/mL in RPMI media 1640 met 2% FBS.</li>
		<li>Voorbereiden CFSElo -media labelen door toevoeging van 1 uL/mL CFSE (stockoplossing 0,5 mM) voor een eindconcentratie van 0,5 µM/mL RPMI media 1640 met 2% FBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. etikettering van de Target Splenocytes met CFSE
Opmerking: CFSE etikettering moet worden uitgevoerd in een steriele wijze.
<ol><li>Resuspendeer de gepulste en unpulsed doelcellen (uit stap 6.3) bij 106 cellen/mL CFSE-labeling media. Resuspendeer de gepulste cellen met bereid CFSEhi-media en de unpulsed cellen met benoemen bereid CFSElo-labeling van media.</li>
	<li>Mix-cellen en CFSE-labeling media door zachte inversie of zwenken. Meng geen door vortexing. Incubeer de cellen en CFSE-labeling media bij 37 ° C gedurende 15 min. Remix de cellen om 5 min.</li>
	<li>Voeg 10 mL van de volledige media aan elke cel schorsing en spin cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten bij 475 x g.</li>
	<li>Gecombineerd supernatant en resuspendeer de cellen in 10 mL koude PBS. Spin cellen bij 4 ° C gedurende 5 minuten bij 475 x g.</li>
	<li>Herhaal stap 8.4.</li>
	<li>Tellen van de cellen en meng peptide-gepulseerde, CFSEhi-aangeduid met unpulsed, CFSElo-label van cellen op een 1:1 verhouding voor injectie in ontvangende muizen. Houd een aliquoot gedeelte van 1 x 106 gemengde cellen te gebruiken voor een stroom cytometry nulmeting (paragraaf 11). Let op: Het eindvolume voor injectie is 100 µL per muis. De laatste cel telling is 10e6 cellen. Verlies van volume in de spuit en de naald moet rekening worden gehouden en moet worden geschat op 500 µL.</li>
</ol>9. injectie van doelcellen
Opmerking: Houd CFSE-geëtiketteerden cellen beschermd tegen licht voorafgaand aan en tijdens de injectie zoveel mogelijk.
<ol><li>Plaats de ontvanger C57BL/6 muizen in een afdekking met de dorsale zijde boven. Spray injectie tail basisareaal met 70% isopropyl alcohol. Beheren 100 µL celsuspensie één intraveneus in de ader van de staart met de schuine kant naar boven.</li>
</ol>10. opnieuw Isolatievan doelcellen
Opmerking: De timing van deze stap is kritisch en afhankelijk van de cytotoxiciteit CTL en de sterkte van het antigeen voor stimulatie. Voor de beoordeling van het doden van een doelwit264 gepulseerde van eicellen257-, moeten de cellen geoogst 4-6 h na injectie. Aangezien CFSE-geëtiketteerden cellen licht gevoelig, proces milt in het donker zijn.
<ol><li>De ontvangende C57BL/6 muizen volgens de goedgekeurde CO2 verstikking methode euthanaseren.</li>
	<li>Verwijderen van spleen(s) zoals in stap 2.1.1. Gedesag van de milt en wassen van splenocytes zoals in stappen 2.2.1 - 2.2.3. Lyse van rode bloedcellen zoals in stap 2.3 - 2.3.2.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 1 mL fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACs) buffer (1% BSA + PBS) voor beoordeling door stroom cytometry.</li>
</ol>11. gating logica om te bepalen van CTL activiteit door Stroom Cytometry
<ol><li>
Beoordeling van CTL activiteit met behulp van een standaard stroom cytometry protocol uit te voeren. Cellen in het FITC-kanaal op een cytometer van de stroom met een 488 nm laser voor excitatie11te verwerven.
	<ol>
<li>Poort op levende lymfocyten met de voorwaartse scatter (FSC) vs kant scatter (SSC) parameters. Subgate binnen de levende lymfocyt-gate voor de totale bevolking van de CFSE-positieve. Opmerking: De ingespoten CFSE-geëtiketteerden cellen zal een kleine ondergroep van de totale lymfocyten aanwezig in de milt make-up. De CSFE-positieve cellen moeten worden weergegeven als twee verschillende populaties op de schaal van het logboek.</li>
		<li>Een histogram-indeling gebruiken voor het bepalen van het percentage van de unpulsed (linker peak, CFSElo) en gepulseerde (juiste peak, CFSEHallo) bevolking. Verlies van het CFSEHallo cellen aangeeft antigeen-specifieke CTL activiteit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+quantification+of+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+cell-permeable+fluorogenic+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates.</a> Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).</li>
<li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+relationship+and+protective+immunity+of+memory+CD8+T+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets.</a> Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627(2014).</li>
<li>Johansson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+education+in+mice+with+single+or+multiple+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules.</a> J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).</li>
<li>Hailemichael, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+antigen+at+vaccination+sites+induces+tumor-specific+CD8%28%2B%29+T+cell+sequestration%2C+dysfunction+and+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion.</a> Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).</li>
<li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+regression+and+autoimmunity+after+reversal+of+a+functionally+tolerant+state+of+self-reactive+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).</li>
<li>Cho, H. I., Celis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+peptide+vaccines+eliciting+extensive+CD8+T-cell+responses+with+therapeutic+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects.</a> Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).</li>
<li>Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+for+pre-clinical+study+of+human+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy.</a> Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel dit protocol eenvoudig is, zijn er een paar essentiële stappen die moeten zorgvuldig worden uitgevoerd. De covax-priming na injectie van de antigeen-specifieke T-cel wordt getest is noodzakelijk om te zien alle doden van de gepulseerde doelstellingen. Hoewel het mogelijk is dat de vaccinatie watergedragen covax een acute inflammatoire aandoening, voor de chronische inflammatoire fase creëert, kan de kortstondige waterbasis formulering te vervangen door een langzaam-antigeen release olie gebaseerde aanpak leiden to...

Er zijn meerdere protocollen om te kunnen beoordelen cytolytische (CTL) of een CD8+ of CD4+ T-cel. Deze beoordeling kan gemakkelijk worden gedaan in vitro onder gecontroleerde omstandigheden1,2,3. Daarnaast infectieziekte modellen, zoals LCMV, klassiek CTL functie met behulp van differentieel CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein DIACETAAT succinimidyl ester) label doelcellen hebben onderzocht waar de CFSEhi-gelabelde cellen zijn Pulsed met een peptide en CFSElo-gelabelde target cellen zitten unpulsed. De cellen vervolgens geïnjecteerd in een 1:1 verhouding en beoordeeld voor verlies van de CFSEhi-label gepulseerde doelstellingen door stroom cytometry4. Vaccin en afwijzing modellen hebben ook soortgelijke strategieën gebruikt voor beoordeling van het in vivo doden door beide CD8+ en CD4+ T cellen evenals NK cellen5,6. Dit is een krachtige test, maar vereist het gebruik van besmettelijke agentia die prime het immuunsysteem voorafgaand aan target injectie.
Dit protocol, aan de andere kant, vereist geen voorafgaande infectie van de gastheer en in plaats daarvan maakt gebruik van een vaccinatiestrategie te prime het immuunsysteem voorafgaand aan target injectie. Deze vaccinatie bestaat uit een watergedragen formulering van peptide vaccin waarvoor bepaling van een immunostimulerende cocktail genaamd covax7, bestaande uit een Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist (imiquimod crème), een agonistic anti-interactie CD40 antilichaam en interleukin-2 (IL-2) leidt tot synergetische combinatie van immunostimulerende agenten voor de verdieping van peptide-specifieke priming en robuuste immuunrespons. Als zodanig biedt deze test een snelle uitlezing van CTL functie zoals het vaccin wordt toegediend samen met de cellen voor de beoordeling van de functie slechts drie dagen vóór injectie van de doelcellen. Bovendien, is de covax-priming sterk genoeg dat de capaciteit van de doden van de primer antigeen-specifieke T cel worden tussen 4 en 24 uur na de injectie gezien kan.
De belangrijkste beperking van dit protocol is het identificeren van de tijdlijn in vivo voor de detectie van doel doden die geschikt is om zowel het antigeen en de hypothese wordt getest. Zorgvuldige beoordeling moet worden uitgevoerd, als variaties in antigeen sterkte, alsmede genetische wijzigingen wordt getest in T-cellen kan leiden tot differentiële CTL-functie die een andere timing detectie van het doden van de doelgroep vereisen zou. Bovendien, terwijl de juiste concentratie van peptide voor vaccinatie is geoptimaliseerd voor menselijke melanoom antigeen glycopeptide 100 (hgp10025-33) en ovoalbumine257-264 (eicellen257-264)8,9 , gebruik van een ander model van het antigeen die meer geschikt voor een bepaalde studie wellicht zou vereisen verdere validatie. Vanwege verwachte verschillen in een doel antigenen capaciteit ter stimulering van CTL effector functie in combinatie met de covax als adjuvans, kan optimalisatie van IL-2 dosis concentratie en dosis frequentie zijn essentieel om het gewenste doel te bereiken. Globaal, is dit protocol voorziet in een snelle beoordeling van het doden van functie in vivo en kan worden aangepast aan een bepaald antigeen.

<table><tbody><tr><td>6 tot 12 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen&nbsp;</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>C57 Black 6 muizen</td></tr><tr><td>OT-1 6-12 weken oude vrouwelijke muizen&nbsp;</td><td>Jackson Labs</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>hgp10025&ndash;33&nbsp;</td><td>CPCScientific</td><td>834139</td><td>KVPRNQDWL</td></tr><tr><td>OVA 257&ndash;264&nbsp;</td><td>CPCScientific</td><td>MISC-012</td><td>SIINFEKL</td></tr><tr><td>Imiquimod crème 5%&nbsp;</td><td>Fougera</td><td>51672-4145-6</td><td>Aldara Cream</td></tr><tr><td>CD40-specifiek mAb&nbsp;</td><td>BioXcell</td><td>BE0016-2</td><td>clone FGK4.5</td></tr><tr><td>rhIL-2-eiwit&nbsp;</td><td>Hoffman LaRoche Inc</td><td>136</td><td>Recombinant humaan IL-2-eiwit</td></tr><tr><td>70% isopropyl alcohol Prep&nbsp;</td><td>Kendall</td><td>S-17474</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>Fosfaat Buffered Saline</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td>foetaal bovien serum</td></tr><tr><td>RBC-lyse buffer&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td>rode bloedcel lyse buffer</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>penicilline/streptomycine</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Life Technologies</td><td>C34554</td><td>5-(en 6)-Carboxyfluorescein diacetaat succinimide ester</td></tr><tr><td>Bovien serum albumine (BSA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL MCT gradueleerde natuurlijke&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>microcentrifugebuis</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP8201500</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Trypan blauwe oplossing, 0,4%&nbsp;&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>27 gauge naald</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>1 mL spuit</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo assay voor detectie van antigeen-specifieke t-cel cytolytische functie met behulp van een vaccinatie-model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Huidige methoden voor het doden van antigeen-specifieke zijn beperkt tot in vitro gebruik of gebruikt in modellen van besmettelijke ziekten. Er is echter niet een protocol dat specifiek bestemd voor de meting van antigeen-specifieke doden zonder een infectie. Dit protocol is ontworpen en een beschrijving van de methoden om deze beperkingen te overwinnen doordat voor de opsporing van antigeen-specifieke doden van een doelcel door CD8+ T cellen in vivo. Dit wordt bereikt door het samenvoegen van een vaccinatie-model met een traditionele CFSE-geëtiketteerden doel assay doden. Deze combinatie zorgt ervoor dat de onderzoeker te beoordelen van het potentieel van antigeen-specifieke CTL direct en snel als de test niet afhankelijk van de tumorgroei of een infectie is. Bovendien, de uitlezing is gebaseerd op stroom cytometry en dus moet gemakkelijk toegankelijk zijn voor de meeste onderzoekers. De belangrijkste beperking van de studie is het identificeren van de tijdlijn in vivo die past bij de hypothese wordt getest. Variaties in de sterkte van het antigeen en mutaties in de T-cellen die leiden differentiële cytolytische functie tot kunnen moeten zorgvuldig worden beoordeeld om te bepalen van de optimale tijd voor de oogst van de cel en beoordeling. De juiste concentratie van peptide voor vaccinatie is geoptimaliseerd voor hgp10025-33 en eicellen257-264, maar verdere validatie nodig zou zijn voor andere peptiden die meer geschikt voor een bepaalde studie wellicht. Globaal, is dit protocol maakt een snelle evaluatie van het doden van functie in vivo en kan worden aangepast aan een bepaald antigeen.

Vóór injectie van CFSE-label doelcellen, wordt het 1:1 cel mengsel uitgevoerd op een cytometer van de stroom bepalen de frequenties van de basislijn van het CFSEHallo én CFSElo doelcellen. Figuur 1 A toont de gating strategie voor de opsporing van wijzigingen in de CFSE bevolking, een eerste poort is gemaakt met behulp van FSC en SSC parameters. De totale CFSE-positieve cellen zijn vervolgens subgated voorafgaand aan de ...

Het doel van dit protocol is dat voor de opsporing van in vivo antigeen-specifieke doden van een cel in een lymfkliertest model.

In Vivo Assay voor detectie van antigeen-specifieke T-cel cytolytische functie met behulp van een vaccinatie-Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Het algemene doel van dit experiment is om de in vivo antigeenspecifieke doding van een doelcel in een muizenmodel te kunnen detecteren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen binnen het vakgebied van de immunologie, zoals de voldoendeheid en detectie van antigeenspecifieke cytolytische doding van doelcellen in een aangevallen immuunsysteem, en hoe dit kan worden beïnvloed door manipulatie van de T-cellen om de functie in vivo te verbeteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de onderzoeker het antigeenspecifieke cytolytische potentieel direct en snel kan beoordelen, aangezien de assay niet afhankelijk is van tumorgroei of infectie.Deze procedures zullen worden gepresenteerd door Cara Haymaker en Yared Hailemichael van de Department of Melanoma Medical Oncology. Nadat de muizen zijn geanestheseerd volgens het tekstprotocol, wordt 70% isopropylalcohol gebruikt om het gebied aan de basis van de staart voor de injectie te bespuiten. Gebruik een naald van 27 gauge bevestigd aan een spuit en penetreer, met de schuine zijde naar boven, vier tot vijf millimeter in de regio van de staartbasis om 100 µL van de eerder bereide peptide-oplossing te injecteren.Inject vervolgens, zijdelings van de plek van de vaccinatie-injectie, 100 µL anti-CD4D antilichaam. Breng voorzichtig 50 mg per muis imiquimodcrème aan op de vaccinatieplaatsen. Wrijf de crème in het oppervlak tot de crème niet meer zichtbaar is en volledig is geabsorbeerd.Inject vervolgens 100 µL van 100.000 IU/mL recombinant humaan rhIL-2 protein intraperitoneaal in de onderste buikregio. Nadat de splenocyten uit de muizen zijn geïsoleerd en de rode bloedcellen zijn gelyseerd volgens het tekstprotocol, wordt de peptide-pulsing uitgevoerd door de cellen eerst opnieuw te suspenderen op 10⁶ cellen/mL in compleet medium. Verdeel de cellen over twee conische buizen van 15 mL en label deze als gepulst of niet-gepulst.Voeg voor het pulseren met OVA 257 tot 264 één microgram per milliliter peptide toe aan de buis die is gelabeld als 'gepulst'. Incubeer vervolgens de gepulste en niet-gepulsede cellen gedurende één uur bij 37 °C. Voeg 10 ml volledig medium toe aan zowel de gepulste als de niet-gepulsede buizen om de doelcellen te wassen.Centrifuge vervolgens de resterende cellen gedurende vijf minuten bij 475 x g en kamertemperatuur, alvorens het supernatant af te zuigen. Bereid een CSFE-medium voor hoge labeling door 1 µL per ml CSFE toe te voegen aan RPMI 1640 met 2% FBS, voor een uiteindelijke concentratie van 5 µM per ml. Bereid vervolgens een CSFE-medium voor lage labeling door 1 µL per ml CSFE toe te voegen aan RPMI 1640 met 2% FBS, voor een uiteindelijke concentratie van 0,5 µM per ml.Om de doel-splenolocyten te labelen, resuspendeert u 10⁶ cellen per milliliter gepulste cellen in het voorbereide CSFE medium voor hoge labeling, en 10⁶ cellen per milliliter ongepulste cellen in CSFE medium voor lage labeling. Meng de celsuspensies door voorzichtig om te keren of te wervelen. Incubeer de cellen vervolgens gedurende 15 minuten bij 37 °C, waarbij u de cellen elke vijf minuten opnieuw mengt.Voeg vervolgens 10 milliliters compleet medium toe aan elke celsuspensie en centrifugeer de cellen bij 475 x g en kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Aspireer daarna het supernatant en gebruik 10 milliliters koud PBS om de cellen opnieuw te suspenderen. Centrifugeer de cellen bij 475 x g en 4 graden Celsius gedurende vijf minuten, alvorens de PBS-was te herhalen.Tel de cellen en meng peptide-gepulste CFSE high-gelabelde cellen met niet-gepulste CFSE low-gelabelde cellen in een verhouding van 1:1 voor injectie in recipientmuizen. Bewaar een aliquot van 1 x 10⁶ gemengde cellen voor een baseline flowcytometrie-beoordeling. Na injectie en herisolatie van de doelcellen, volgens het tekstprotocol, wordt de CTL-activiteit beoordeeld met een standaard flowcytometrie-protocol, waarbij cellen worden verworven via het FITC-kanaal met een 488 nanometer laser voor excitatie.Voorafgaand aan de injectie van de met CFSE gelabelde doelcellen werd het cellengemeng in een verhouding van 1:1 door een flowcytometer gehaald om de basisFrequenties van zowel de CFSE-high als de CFSE-low doelcellen te bepalen. Hier wordt de gating-strategie getoond om veranderingen in de CFSE-populaties te detecteren. Er werd een eerste gate gemaakt met behulp van FSC- en SSC-parameters.De totale CSFE-positieve cellen werden vervolgens ondergesegmenteerd voordat de veranderingen in frequentie werden beoordeeld, aangezien deze populatie relatief klein is in vergelijking met de ongelabelde endogene splenocyten. Een voorbeeld van de relatieve frequentie van de CSFE-populaties vóór injectie wordt hier getoond en zou dicht bij één-op-één moeten liggen. De noodzaak van de covex-priming is zichtbaar in dit paneel, waar geen doding van de antigeen-gepulseerde CSFE-high-doelcellen werd waargenomen 24 uur na injectie.Deze figuur demonstreert de effectieve doding van de antigeen-gepulste CFSE high-gelabelde doelcellen, aangezien de piek die vóór de injectie werd waargenomen vrijwel niet meer detecteerbaar was en de ratio drastisch verschoof van 50% naar 1% detectie. Ten slotte toont de figuur ook de kinetiek van de doding van antigeen-gepulste CFSE high-label doelcellen door het verlies van deze populatie te beoordelen op zowel 6 als 24 uur na injectie. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee tot drie dagen worden uitgevoerd, afhankelijk van de antigeen- en T-celfunctie.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de CSFE-labeling uniform moet zijn en dat de kinetiek van de CTL-respons moet worden beoordeeld voordat de assay wordt uitgevoerd. Na deze procedure kunnen ook andere methoden zoals ELISA, ELISPOT en intracellulaire flowcytometrie-kleuring worden uitgevoerd om veranderingen in de effectorfunctie te beoordelen en andere aanvullende vragen te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de in vivo CTL-functie kan worden beoordeeld in afwezigheid van een infectie of tumor.

in-vivo-assay-for-detection-antigen-specific-t-cell-cytolytic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Veel infecties roepen een sterke CTL-respons, maar af en toe, de hoeveelheid cellen die reageren niet correleren met de controle van de...

Antigen Specifieke In Vivo Killing Assay met behulp van CFSE Labeled doelcellen

This video demonstrates a monocyte-derived dendritic cell, MoDC-based assay to measure the immunogenicity of commercially available vaccines. MoDC assays investigate dendritic cell responses to antigens, pathogens, or treatments and can provide insights into immune responses, vaccine development, and immunotherapy research.

A Vaccine-Pulsed Dendritic Cell-Based In Vitro Assay to Induce Lymphocyte Proliferation

The video demonstrates an immunological method to monitor in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte or CTL production. A mouse is pre-injected with genetically engineered, proliferative dye-stained donor CD8+ T lymphocytes. Subcutaneous injection of ovalbumin with adjuvants generates cytotoxic CD8+ T lymphocytes that are identified post-harvesting through immunostaining and flow cytometry.

An Immunological Technique to Monitor Adjuvant-Mediated Cytotoxic T Lymphocyte Generation

We ontwikkelden een in vitro assay om de rol van immuunregulerende trajecten in de regulatie van cytokine secretie door HIV-specifieke CD4 T-cellen te onderzoeken.

In vitro onderzoek naar de impact van immunoregulatoire Pathways op HIV-specifieke CD4 T-cellen Effectorfunctiemanipulatie Evalueer

Het vermogen om T-cel responsen in detail volgen in vivo is belangrijk voor de ontwikkeling van ons begrip van de immuunrespons. Hier beschrijven we het gebruik van fluorescerende doel arrays (FTA's) in een in vivo T-cel test die&gt; 250 parameters beoordeelt gelijktijdig door flowcytometrie.

Het gebruik van TL-Target Arrays voor het beoordelen van de T-cel responsen<em&gt; In vivo</em

We beschrijven beeldvorming van het hele dier en op flowcytometrie gebaseerde technieken voor het bewaken van de uitbreiding van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen als reactie op immunisatie met nanodeeltjes in een muizenmodel voor vaccinatie.

Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie

Wij presenteren hier een aanvraag voor een standaard immunologische techniek (CFSE gekleurd OT-ik proliferatie) willen snel controleren adjuvans-gemedieerde cytotoxische T lymfocyten (CTL) generatie in vivo. Deze snelle inschatting van CTL capaciteiten is nuttig voor de ontwikkeling van profylactische vaccins tegen intracellulaire pathogenen, alsmede therapeutische kanker vaccins.

Snelle In Vivo beoordeling van adjuvante van cytotoxische T-lymfocyten de mogelijkheden van de generatie voor vaccinontwikkeling

Hier presenteren we een protocol voor de ex vivo kwalitatieve detectie van antigeen-specifieke CD8+ T cellen. Analyse is mogelijk met eencellige schorsingen van organen of van kleine hoeveelheden bloed. Een breed scala van studies vereisen de analyse van de reacties van de cytotoxische T-cel (vaccinatie en kanker immunotherapie studies).

Gelijktijdige kwantificering van anti-vector en Anti-transgenic-specifieke CD8+ T cellen Via MHC ik tetrameer kleuring na vaccinatie met een virale Vector

We beschrijven hier een flow Cytometry-based in vivo doden assay die het mogelijk maakt onderzoek van immunodominance in chemo T lymfocyten (CTL) Reacties op een model tumor antigeen. Wij bieden voorbeelden van hoe deze elegante assay kan worden gebruikt voor mechanistische studies en voor de effectiviteit van geneesmiddelen testen.

Maatwerk in vivo chemo tests om Immunodominance in tumor-specifieke CD8+ T Cell responsen te bestuderen

Dit protocol beschrijft de chirurgische generatie van orthotopic alvleesklier tumoren en de snelle vertering van vers geïsoleerde lymfatische alvleesklier tumoren. Na de spijsvertering kunnen levensvatbare immuuncelpopulaties worden gebruikt voor verdere downstream-analyse, inclusief ex-vivo stimulatie van T-cellen voor intracellulaire cytokine detectie door Flowcytometrie.

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

Dit manuscript beschrijft hoe in vivo immunogeniciteit van tumorcel-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV's) kunnen worden beoordeeld met behulp van flowcytometrie. EV's afgeleid van tumoren die door behandeling geïnduceerde immunogene celdood ondergaan, lijken bijzonder relevant in tumorimmunosurveillance. Dit protocol is een voorbeeld van de beoordeling van door oxaliplatine geïnduceerde immunostimulerende tumor-EV's, maar kan worden aangepast aan verschillende instellingen.

In vivo Immunogeniciteitsscreening van tumor-afgeleide extracellulaire blaasjes door flowcytometrie van milt-T-cellen

Leer een in vivo-assay voor antigeen-specifieke T-cel cytolytische functie met een muizen vaccinatiemodel. Deze methode maakt snelle evaluatie van immuunresponsen mogelijk zonder afhankelijkheid van tumorgroei.

In Vivo Assay voor detectie van antigeen-specifieke T-cel cytolytische functie met behulp van een vaccinatie-Model

Meer video's verkennen