Een universeel Protocol voor grootschalige gRNA bibliotheek productie uit elke bron van DNA
6 december 2017
Methoden voor het opwekken van grootschalige gRNA bibliotheken moet eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief zijn. Beschrijven we een protocol voor de productie van gRNA bibliotheken gebaseerd op enzymatische spijsvertering van DNA van het doel. Deze methode, CORALINA (uitgebreide gRNA bibliotheek generatie via gecontroleerde nuclease activiteit) presenteert een alternatief voor dure aangepaste oligonucleotide synthese.
Het algemene doel van deze methode is om uitgebreidere guide RNA-bibliotheken te construeren vanuit gezuiverd DNA van elke bron. gRNA-bibliotheken zijn plasmidecollecties die worden gebruikt in CRISPR-gebaseerde screenings. De CORALINA-methode gebruikt enzymatische vertering van gezuiverd DNA om de resulterende fragmenten in een guide RNA-bibliotheekbackbone te klonen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het alle mogelijke guide RNA's produceert vanuit de invoersequentie en het is zeer kosteneffectief. Hoewel deze video de bescherming van een CORALINA-bibliotheek van een bacterieel kunstmatig chromosoom demonstreert, kan deze methode in principe worden toegepast op elk type invoer-DNA van elk organisme. Een optimalisatie van micrococcinale nuclease-vertering moet worden uitgevoerd voor elke nieuwe batch van micrococcinale nuclease.
Stel het volgende op voor elke reactie. Eén microliter van 10x micrococcinale nucleasebuffer, 1x bovijn serumalbumine, één microgram doel-DNA, één microliter micrococcinale nuclease en water tot 10 microliter. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius.
Inactiveer het enzym onmiddellijk door één microliter van 500 millimolair EGTA toe te voegen. Voeg monsterbuffer met gel-ladingenkleurstof toe aan de DNA-monsters en laad één microgram DNA per put in een 20% polyacrylamide-gel. Laad een geschikte DNA-ladder voor groottebepaling.
Laat de gel draaien in 1x TBE-loopbuffer bij 150 volt gedurende ongeveer 1,5 uur of totdat de lagere kleurstoffront het onderste uiteinde van de gel bereikt. Kleur de gel met een ultragevoelige nucleïnezuurkleurstof en visualiseer onder UV-licht. In dit voorbeeld was de optimale concentratie van micrococcinale nuclease voor het verteren van het DNA tot 20 tot 30 basenparen 10 eenheden.
Gebruik deze optimale concentratie van micrococcinale nuclease om 10 tot 12 microgram doel-DNA op dezelfde manier te verteren als gedemonstreerd voor de optimalisatiereacties. Na het scheiden van de DNA-fragmenten door PAGE, gebruik een steriele scalpel om de gel naast de markerbaan te snijden en kleur alleen het deel van de gel dat de ladder bevat met vers 1x TBE-loopbuffer met een ultragevoelige nucleïnezuurkleurstof. Visualiseer de DNA-ladder en gebruik een scheermes om micrococcinale nuclease-verteerde DNA-fragmenten in de groottebereik tussen ongeveer 18 tot 30 basenparen uit te snijden.
Breng de gelplak over naar een microcentrifugebuisje. Kleur de rest van de gel met nucleïnezuurkleurstof zoals eerder getoond. Stel de gel bloot aan UV-licht en verwerf een afbeelding als record van de gel-excisie stap.
Begin deze procedure door een steriele pipettentip te gebruiken om de uitgesneden gelplak tegen de wand van de microcentrifugebuis te drukken. Voeg twee gelvolumes PAGE-solubilisatiebuffer toe en incubeer bij 37 graden Celsius op een roterend platform gedurende 16 uur. Breng de volgende dag het monster over in een microcentrifuge bij maximale snelheid gedurende één minuut.
Breng de supernatanten over naar een nieuw microcentrifugebuisje zorgvuldig zonder om gewonde gelstukken over te brengen. Voeg 0,5 volumes PAGE-solubilisatiebuffer toe aan het gelpellet, vortex en herhaal de centrifugatie. Combineer de supernatanten en extraheer de DNA-fragmenten met behulp van een standaard fenol-chloroform-extractiemethode zoals beschreven in het tekstprotocol.
Parallel met de isolatie van DNA-fragmenten, versterk linkers van de guide RNA-expressievector met behulp van standaard PCR. Om directionele klonen te waarborgen, worden de linkers vervolgens gedigest met de juiste restrictie-enzymen zoals beschreven in het tekstprotocol. Laat de restrictie-enzymdigest van de linkers lopen op een een procent agarose-gel.
Snij de juiste banden uit en zuiver het DNA van de uitgesneden gelplakken met behulp van een gel-extractiekit. Een DNA-bluntingkit wordt gebruikt voor de endherstelreactie. Voeg het volgende toe aan een microfugebuisje.
10 microliter gezuiverd DNA, 1,5 microliter van 10x blunting buffer, 1,5 microliter van een millimolair dNTP-mengsel, 1,4 microliter van water en 0,6 microliter van blunting enzym. Incubeer gedurende 30 minuten bij 22 graden Celsius en activeer vervolgens het enzym door incubatie bij 70 graden Celsius gedurende 10 minuten. Voeg 85 microliter water toe en voer een reactie-opruiming uit zoals beschreven in het tekstprotocol.
Stel een 14 microliter ligatiereactie op met gelijke molaar aantallen micrococcinale nuclease-geverteerde en gerepareerde fragmenten en linkersequenties zoals beschreven in het tekstprotocol. Na nick-translatie wordt het ligatieproduct versterkt door PCR. Om micrococcinale nuclease-fragmenten met de correct gehechte vijf prime en drie prime linker te scheiden van fragmenten met twee vijf prime of twee drie prime linkers, combineer alle 15 cyclus PCR-reacties, voeg DNA-ladingenkleurstof toe en laat lopen op een 0,8% agarose-gel.
Snij de prominente band op 869 basenparen uit en zuiver DNA met behulp van een gel-extractiekit. Kwantificeer de hoeveelheid DNA met behulp van een spectrofotometer. Cloneer vervolgens de PCR-versterkte fragmenten in de guide RNA-expressievector door Gibson-samenvoeging zoals beschreven in het tekstprotocol.
Om deze procedure te beginnen, verdeel gezuiverd vector-insertconstruct in steriele en voorgekoelde PCR-buisjes en bewaar op ijs. Koel een millimeter-gap elektroporatiecuvette op ijs. Voeg 25 microliter vers bereid TG1-cellen toe aan één DNA-aliquot en breng onmiddellijk het mengsel over in een elektroporatiecuvette.
Flik of tik op de cuvette om ervoor te zorgen dat de cellen en DNA-mix langs de lengte van de cuvettekamer wordt verdeeld zonder vastgehouden lucht of bubbels. Plaats de cuvette in de glijkamer en start het geschikte elektroporatieprogramma. Voeg onmiddellijk 475 microliter kamertemperatuur 2TY toe aan de cuvette.
Breng de elektroporeerde bacteriën over naar een 50 milliliterbuisje. Herhaal de individuele elektroporaties, verzamel alle cellen getransformeerd met één bibliotheek in één 50 milliliterbuisje en documenteer het totale volume. Om het totale aantal kolonies voor de hele bibliotheek te schatten, plate
Overzicht
Dit artikel presenteert de CORALINA-methode voor het genereren van uitgebreide gids-RNA-bibliotheken via enzymatische digestie van gezuiverd DNA. Dit kostenefficiënte protocol biedt een alternatief voor traditionele methoden voor oligonucleotdensynthese.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- CRISPR-technologie
Achtergrond
- Guide RNA-bibliotheken zijn essentieel voor CRISPR-gebaseerde screenings.
- Traditionele methoden voor het genereren van bibliotheken kunnen kostbaar en complex zijn.
- De CORALINA-methode vereenvoudigt dit proces.
- Het kan worden toegepast op elk type input-DNA van diverse organismen.
Doel van de studie
- Om een eenvoudige en efficiënte methode te ontwikkelen voor het genereren van gRNA-bibliotheken.
- Om de toepassing van enzymatische digestie voor het kloneren van DNA-fragmenten aan te tonen.
- Om een kosteneffectief alternatief te bieden voor de synthese van op maat gemaakte oligonucleotiden.
Gebruikte methoden
- Enzymatische digestie van gezuiverd DNA met behulp van micrococcal nuclease.
- Kloneren van DNA-fragmenten in een gids-RNA-bibliotheek-backbone.
- Optimalisatie van de digestiecondities voor een effectieve fragmentgrootte.
- Gebruik van PCR en gelextractie voor DNA-zuivering en amplificatie.
Belangrijkste resultaten
- De CORALINA-methode produceert met succes alle mogelijke guide-RNA's uit inputsequenties.
- Aangetoonde efficiëntie bij het genereren van gRNA-bibliotheken uit diverse DNA-bronnen.
- Kosteneffectiviteit in vergelijking met traditionele methoden.
- Potentieel voor brede toepassing in CRISPR-onderzoek.
Conclusies
- De CORALINA-methode is een levensvatbaar alternatief voor het genereren van gRNA-bibliotheken.
- Het vereenvoudigt het proces en verlaagt de kosten die verbonden zijn aan de constructie van de bibliotheek.
- Deze methode kan de onderzoeksfaciliteiten op basis van CRISPR verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Het genereren van uitgebreide guide RNA-bibliotheken uit elke willekeurige DNA-bron maakt schaalbare CRISPR-gebaseerde screening voor targetvalidatie en functionele genomics mogelijk. De CORALINA-methode vermindert de kosten en complexiteit in vergelijking met oligonucleotdensynthese, wat workflows voor vroege ontdekking ondersteunt. Deze benadering vergroot het voorspellend vertrouwen bij het testen van therapeutische hypothesen door onbevooroordeelde gRNA-bibliotheken op genoombrede schaal te leveren.
Strategische Toepassingen in Biofarma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om alle mogelijke genomische locaties van input-DNA te onderzoeken voor onbevooroordeelde hypothese-toetsing van targets.
- Operationele waarde: Elimineert beperkingen in sequentie-ontwerp en synthesekosten die gepaard gaan met de traditionele generatie van gRNA-bibliotheken.
- Predictieve waarde: Ondersteunt functionele target-validatie door fenotypische screening over volledige genomen of aangepaste DNA-bronnen mogelijk te maken.
Screening en assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert gestandaardiseerde gRNA-fragmenten in het bereik van 18–30 bp voor consistente klonering in expressievectoren.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van gelgebaseerde grootte-selectie en fenol-chloroformextractie om de zuiverheid van fragmenten voor downstream ligatie te waarborgen.
- Klaar voor assay: Genereert linker-versterkte fragmenten die zijn gevalideerd via restrictiedigestie en PCR voor directionele klonering in gRNA-backbones.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Maakt de generatie van gRNA-bibliotheken mogelijk vanuit ziekterelevante DNA-bronnen, zoals patiëntafgeleide monsters of genomen van modelorganismen.
- Preklinische Toepassing: Ondersteunt het beperken van risico's bij targets in validatiestudies door uitgebreide gRNA-dekking te bieden voor CRISPR-gebaseerde functionele assays.
- Mechanistische Risicoreductie: Faciliteert de verduidelijking van pathways en targets via onbevooroordeelde screening, waardoor het aantal fout-negatieven bij targetidentificatie wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De CORALINA-methode past binnen de vroege ontdekkingsfase en maakt bibliotheekpreparatie mogelijk voor CRISPR-screeningsworkflows die bijdragen aan de identificatie van lead-verbindingen en de prioritering van preklinische targets.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesevrije targetidentificatie door gRNA's te genereren uit elke genomische of epigenomische DNA-bron.
- Screening: Produceert gezuiverde DNA-fragmenten die klaar zijn voor ligatie in gRNA-expressievectoren, wat schaalbare constructie van bibliotheken mogelijk maakt.
- Analytics: Maakt gebruik van gelelektroforese, spectrofotometrie en kolonietelling om de complexiteit van de bibliotheek en de cloning-efficiëntie te kwantificeren.
- Translational Research: Maakt het gebruik van klinisch relevante DNA-inputs mogelijk om de brug te slaan tussen discovery en preklinische modellen.
- Enterprise Reuse: Het protocol kan worden gestandaardiseerd over teams heen voor herhaaldelijke generatie van gRNA-bibliotheken uit diverse DNA-bronnen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Maakt comprehensieve, onbevooroordeelde generatie van gRNA-bibliotheken mogelijk voor target-validatie met een hoge betrouwbaarheid.
- Operationele waarde: Verlaagt de reagenskosten en vereenvoudigt de workflow in vergelijking met array-gebaseerde oligonucleotide-synthese.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen door de target-dekking te vergroten en biologische fout-negatieven te verminderen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van targets via genoombrede screeningsgegevens vanuit flexibele DNA-inputs.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in moleculaire klonering, gelelektroforese en zuivering van nucleïnezuren.
- Afhankelijk van de optimalisatie van micrococcaal nuclease, PAGE-apparatuur en workflows voor restrictie-enzymen.
- Standaardisatie van gel-excisie, DNA-extractie en ligatiestappen tussen gebruikers en batches is noodzakelijk.
- De kwaliteit en hoeveelheid van het input-DNA moet worden aangepast voor verschillende bronnen (bijv. genomisch, BAC, plasmide).
- Praktische beperking: De complexiteit van de bibliotheek hangt af van de diversiteit van het input-DNA en de effectieve selectie van fragmenten van 18–30 bp.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
0:48
Digestion of DNA with MNase and Separation of DNA Fragments by PAGE
3:05
Isolation of DNA Fragments from PAGE Gels and Linker Generation
4:26
End Repair of Gel-purified Fragments and Linker Ligation
5:32
Size Selection and Assembly of Vector-insert Construct
6:18
Electroporation of TG1 Electrocompetent E. coli Cells
8:38
Results: a gRNA Library can be Generated from and Target DNA
9:56
Conclusion
