Name: Een universeel Protocol voor grootschalige gRNA bibliotheek productie uit elke bron van DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Leer de CORALINA-methode voor grootschalige gRNA-bibliotheekproductie door enzymatische digestie van DNA. Dit kosteneffectieve protocol biedt een alternatief voor traditionele oligonucleotidesynthese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs zou willen van Prof. Dr. Stephan Beck en Prof. Dr. Magdalena Goetz bedanken voor hun inbreng, te helpen en te ondersteunen bij de ontwikkeling van de CORALINA-methode, Maximilian Wiessbeck en Valentin Baumann voor nuttige opmerkingen. Het werk werd ondersteund door DFG (STR 1385/1-1).

<ol><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+profiles+to+function+in+epigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">From profiles to function in epigenomics.</a> Nat Rev Genet. 18 (1), 51-66 (2017).</li>
<li>Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+editing%3A+repurposing+CRISPR-Cas9+for+precision+genome+regulation+and+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (1), 5-15 (2016).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li>
<li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 267-273 (2014).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li>
<li>Koferle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORALINA%3A+a+universal+method+for+the+generation+of+gRNA+libraries+for+CRISPR-based+screening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening.</a> BMC Genomics. 17 (1), 917-940 (2016).</li>
<li>Lane, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatically+Generated+CRISPR+Libraries+for+Genome+Labeling+and+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening.</a> Dev Cell. 34 (3), 373-378 (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+DNA+fragments+from+polyacrylamide+gels+by+the+crush+and+soak+method%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method.</a> CSH Protoc. (1), (2006).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Elsaesser, R., Paysan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+gel+amplification+of+complex+plasmid+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Liquid gel amplification of complex plasmid libraries.</a> Biotechniques. 37 (2), 200-202 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

CORALINA kan worden gebruikt voor het genereren van grootschalige gRNA bibliotheken door gecontroleerde nuclease spijsvertering van DNA van het doel en bulk klonen van resulterende dubbele gestrande fragmenten. Statistische inferentie geeft aan dat veel meer dan 107 individuele gRNA sequenties hebben al met succes gekloond met behulp van het protocol op9van de hand. CORALINA kan op meerdere manieren worden aangepast. De keuze van de sjabloon DNA definieert de doel-regio en de maximale complexiteit van de gegenereerde bibliotheek. Met behulp van dit protocol, CORALINA bibliotheken zijn eerder gegenereerd van mens en muis genomic DNA9. Representatieve resultaten die hier gepresenteerd verbeelden de generatie van de bibliotheek van een CORALINA uit gezuiverde BAC DNA. Verdere aanpassingen kan worden bereikt door de keuze van vector- en linker opeenvolgingen van gRNA expressie. Wij hebben drie verschillende paren van linker lengtes voor Gibson montage met kleine variaties in efficiëntie9eerder beproefd.
Als gevolg van hun oorsprong uit bulk verteerd DNA, protospacer van CORALINA gRNAs zijn meestal niet precies 20 bp in lengte, maar de show een lengte-verdeling met een gemiddelde dat beide hangt af van de parameters van de MNase spijsvertering en de grootte van de besnijdenis gemaakt van de pagina gel s. de representatief voorbeeld weergegeven in figuur 2B en C, toont fragmenten met een gemiddelde lengte tussen 19 en 27 bp. In onze ervaring, is de lengte van de fragmenten getrouw bewaard door de gegenereerde gRNA protospacer9. Terwijl fragmenten korter dan 20 bp dient vermeden te worden als gevolg van hogere af-streefpercentage van resulterende gRNAs, langere fragmenten zijn waarschijnlijk veel minder een probleem voor downstream toepassingen, sinds het aangetoond dat gRNAs met protospacers, zolang 45 bp zijn nog steeds functionele9.
De twee belangrijkste stappen in het CORALINA-protocol zijn de selectie van de grootte van fragmenten MNase-verteerd en klonen stappen. Generatie van fragmenten die te kort zijn (bijvoorbeeld de gemiddelde onder 18 bp) of opneming van teveel lege gRNA expressievectoren zal de bibliotheek maken nutteloos. Het is dus belangrijk om te optimaliseren de MNase spijsvertering stap (figuur 2A), volgen van excisie (figuur 2B, C), controleren voor volledige spijsvertering van de ruggengraat van de vector gRNA en inclusief geen fragment besturingselementen in het gehele protocol. Speciale zorg moet ook worden gehouden voor het behoud van de vertegenwoordiging van de gRNA-bibliotheek. Één gemeenschappelijke knelpunt van bibliotheek generatie is in het algemeen de efficiënte omzetting van plasmiden in bacteriën voor versterking. Dus zijn grote hoeveelheden bacteriën met uitstekende bekwaamheid en een groot aantal individuele electroporation gebeurtenissen noodzakelijk voor het bereiken van een groot aantal gRNA klonen.
Nieuwe strategieën voor de productie van de bibliotheek van de gRNA zal men moeten oogsten van het volledige potentieel van screening CRISPR gebaseerde benaderingen in de komende decennia. Er is een significante vraag naar aanpasbare, kosteneffectieve en eenvoudige methoden voor het genereren van grote bibliotheken, een eerste vereiste om screening vatbaar voor een groter aantal modelsystemen en verschillende CRISPR gebaseerde engineering benaderingen. CORALINA is het verstrekken van een eerste stap naar dit. De mogelijke toepassingen zijn divers, met name voor de productie van uitgebreide bibliotheken van genomen, cDNA bibliotheken van minder voorkomende modelsystemen, zeer gerichte bibliotheken en experimentele opstellingen in welke verschillende eiwitten van de CRISPR (met verschillende PAM afgeleid Requirements) worden gebruikt in combinatie.
In tegenstelling tot andere methoden, CORALINA genereert alle mogelijke gRNAs van de ingang DNA. Een nadeel van de methode is echter dat gRNAs ontbreekt de vereiste volgorde van de PAM zijn ook opgenomen in de bibliotheek, een functie die hij met een tweede enzymatische methode voor gRNA bibliotheek generatie, CRISPR-eten (tabel 1 deelt). De keuze van de ideale methode voor gRNA bibliotheek generatie is afhankelijk van de specificaties van de geplande screening experimenteren, met name de aard (genenreservoir, regelgevende, intergenic) en de grootte van de doel-regio (single locus, meerdere regio's, genoom-brede). We zien een speciale kop in met behulp van CORALINA wanneer een groot aantal niet-coderende of regelgevende regio's moeten worden geanalyseerd, als er onvolledig of onbetrouwbaar opeenvolgingsinformatie is (exotische modelsystemen, zaadmengsels van soorten (bijvoorbeeld microbiomes) of experimenteel verkregen input), verschillende CRISPR enzym worden gecombineerd of verzadigen van de analyse wordt uitgevoerd op een korte en gedefinieerde locus (bijvoorbeeld vertegenwoordigd door BACs).

De aanpassing van het bacteriële CRISPR/Cas9-systeem als een moleculaire targeting instrument veroorzaakt de meest recente revolutie in moleculaire biologie. Nooit eerder is het zo gemakkelijk te manipuleren van de chromatine op gedefinieerde genomic locaties geweest. Gemeenschappelijke toepassingen van CRISPR omvatten gerichte gen mutaties1, genoom engineering2, epigenome3, transcriptionele activering en gene silencing4bewerken. Een bijzonder voordeel van het CRISPR-systeem is dat de toepassingen niet beperkt tot goed bestudeerde kandidaat-sites zijn, zoals gRNA bibliotheken een minder vooringenomen schermen mogelijk maken. Dit vergemakkelijkt de ontdekking van functionele loci in het genoom zonder enige voorkennis van de experimentele. Echter gRNA bibliotheek bouw is momenteel grotendeels gebaseerd op oligo-nucleotide synthese, en er zijn beperkte opties voor de aankoop van gRNA Bibliotheken, die niet van de mens of muis oorsprong of doel gebieden buiten open lezen van frames. Dus, hoewel CRISPR schermen hebben bewezen ongelooflijk krachtig5,6,7,8, hun volledige potentieel heeft nog niet is geëxploiteerd.
Om te overwinnen de beperking van de klassieke gRNA generatie methoden twee strategieën zijn onlangs ontwikkeld. Beide zijn gebaseerd op de gecontroleerde enzymatische spijsvertering van DNA van het doel in plaats van te vertrouwen op aangepaste oligonucleotide synthese. Terwijl CORALINA9 werkzaam micrococcal nuclease, de enige momenteel beschikbare alternatieve methode, CRISPR-eten10, maakt gebruik van beperkingsenzymen (HpaII, ScrFI, Bfaik en Mmeik). Nog belangrijker is, kunnen beide technieken worden toegepast op elke input DNA, die als de bron van de opeenvolgingen van de protospacer van de gRNA fungeert. Terwijl de CRISPR-EATING methode maakt gebruik van een strategie om het aantal gekloonde gRNAs waarvan de targeting sites niet worden gevolgd door de vereiste S.pyogenes-PAM (protospacer aangrenzende motief) te verlagen, het slechts een klein deel van alle mogelijke functionele gRNAs voor genereert een bepaald gebied. CORALINA, aan de andere kant, kan voor het genereren van alle potentiële gRNAs voor de reeks van de bron, maar bevat ook een hogere Fractie van niet-functionele gidsen. gRNA bibliotheek generatie via gecontroleerde nuclease activiteit mogelijk maakt de productie van uitgebreide gRNA bibliotheken voor elke soort, elk Cas9-eiwit of -effector systeem op een eenvoudige en kosteneffectieve manier. CORALINA is bovendien aangepast aan aanpassen, zoals de juiste keuzes voor invoer- en vector definiëren de soort bibliotheek, de grootte en de inhoud. Hier, een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd dat kan worden gebruikt voor de generatie van uitgebreide gRNA bibliotheken uit verschillende bronnen van DNA (Figuur 1), met inbegrip van bacteriële kunstmatige chromosomen (BACs) of genomic DNA9. De representatieve resultaten bij dit protocol zijn afgeleid door de toepassing van het protocol van CORALINA tot DNA dat BAC.

<table><tbody><tr><td>500 mM EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03777-10G</td><td>1.4., Inactivatie van Mnase</td></tr><tr><td>Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6678</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&reg; TBE Gels, 20%, 10 well</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6315BOX</td><td>2.1., voorgevormde 20 % PAGE-gel</td></tr><tr><td>O'RangeRuler 5 bp DNA Ladder,</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1303</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&reg; TBE Running Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6675</td><td>2.1., PAGE-gel-running buffer</td></tr><tr><td>Steriele wegwerp-scalpel</td><td>VWR&nbsp;</td><td>233-5363&nbsp;</td><td>2.3., andere equivalenten kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>SYBR Green I nucleïnezuurkleurmiddel (1000x concentraat in DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td> S9430</td><td>2.3. +2.5., ook verkrijgbaar bij Thermo Fisher Scientific (S7563)</td></tr><tr><td>UltraPure Fenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593-031</td><td>3.6.1. + 4.3., andere equivalenten kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Sigma</td><td>10901393001</td><td>3.6.4., andere equivalenten kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>3M Natriumacetaat, pH5.2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; R1181</td><td>3.6.4., andere equivalenten kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp;</td><td></td><td></td><td>3.6.4. + 9.1.8., moleculaire biologie-kwaliteit</td></tr><tr><td>Quick blunting kit&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E1201</td><td>4.1.</td></tr><tr><td>ammoniumacetaat</td><td>Sigma</td><td> A1542</td><td>3.1., andere equivalenten kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>magnesiumacetaat</td><td>Sigma</td><td> M5661</td><td>3.1., andere equivalenten kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>VWR</td><td>&nbsp; MOLEM37465520 (of Promega V4231)</td><td>2.2. + 3.1., andere equivalenten kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Beckman coulter</td><td>A63881</td><td>5.3. + 6.5.</td></tr><tr><td>Gel extractiekit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>5.7.+ 7.1. +8.4., andere equivalenten kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>geconcentreerde T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>&nbsp;M0202T</td><td>6.1.+ 8.1.2.</td></tr><tr><td>Long Amp Taq 2X Master Mix&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0287S</td><td>6.3.</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix met HF Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>5.1. + 6.6., andere equivalenten kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104S</td><td>5.4.1.&nbsp;</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>5.4.2.</td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td>8.2.1.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>2M MgCl</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>dGTP,dATP, dCTP, dTTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigam</td><td> DTT-RO</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>PEG-8000&nbsp;</td><td>Sigma</td><td> P5413</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma</td><td> N6522</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>T5 exonuclease</td><td>New England Biolabs</td><td>M0363S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Phusion DNA polymerase&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Taq DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208L</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>rSAP</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td>8.3.1.</td></tr><tr><td>TG1 competent cellen</td><td>Lucigen</td><td>60502-1</td><td>9.1.</td></tr><tr><td>1mm gap elektroporatiecuvet</td><td>VWR</td><td>732-2267&nbsp;</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DIS-988-010M&nbsp;</td><td>9.4.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653&nbsp;</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Bacto-tryptone</td><td>BD</td><td>211705</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>BD</td><td>212750</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td> A1296</td><td>9.4.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td> G5516</td><td>9.17.</td></tr><tr><td>MNAse</td><td>New England Biolabs</td><td>M0247S</td><td>1.1.</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>doorheen</td></tr><tr><td>Micropulser</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>Elektroporatiecuvet</td><td>Biorad</td><td>732-2267&nbsp;</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>250 ml centrifugebuizen</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>9.1-9.9.</td></tr></tbody></table>

een universeel protocol voor grootschalige grna bibliotheek productie uit elke bron van dna

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

De populariteit van het systeem van de CRISPR/Cas9 voor zowel de genoom en de epigenome techniek komt voort uit haar eenvoud en aanpassingsvermogen. Een effector (de nuclease Cas9 of een fusieproteïne nuclease-dode dCas9) is gericht op een specifieke site in het genoom door een kleine synthetische RNA Absorbtion gids RNA, gRNA. De bipartiete aard van het CRISPR-systeem kan het gebruik ervan bij bevolkingsonderzoek benaderingen sinds plasmide bibliotheken met expressie cassettes van duizenden afzonderlijke gRNAs kunnen worden gebruikt om vele verschillende plaatsen in een enkele experiment ondervragen.
Tot op heden zijn gRNA sequenties voor de bouw van bibliotheken bijna uitsluitend gegenereerd door oligonucleotide synthese, die de grenzen van het haalbare complexiteit van sequenties in de bibliotheek en is relatief kostenintensieve. Hier zijn een gedetailleerd protocol voor CORALINA (uitgebreide gRNA bibliotheek generatie via gecontroleerde nuclease activiteit), een eenvoudige en kosteneffectieve methode voor het genereren van zeer complexe gRNA bibliotheken gebaseerd op enzymatische spijsvertering van DNA input, is beschreven. Aangezien CORALINA bibliotheken kunnen worden gegenereerd vanaf een willekeurige bron van DNA, bestaat overvloed van opties voor aanpassingen, waardoor een grote verscheidenheid aan CRISPR gebaseerde schermen.

Met behulp van het protocol bij de hand, zijn CORALINA gRNA bibliotheken gegenereerd van mens en muis genomic DNA9 en BAC DNA (Figuur 1). Voor de productie van fragmenten van input DNA geschikt voor klonen in gRNA expressievectoren, moeten optimale omstandigheden voor gecontroleerde nuclease spijsvertering worden bepaald. Een typisch resultaat voor de optimalisatie van de micrococcal nuclease spijsvertering is afgebeeld in figuur 2A. Onvoldoende hoeveelheid nuclease (0,1, 2, 3, 4, 4,5 of 5 eenheden) produceert geen merkbare producten in het assortiment van de vereiste grootte (10-100 bp) en 5,5-7,5 eenheden nog steeds geproduceerd fragmenten die gemiddeld te lang zijn. Grotere hoeveelheden enzym (50 eenheden) leiden tot excessieve afbraak van input DNA na 10 min. Bijgevolg werd een tussenliggende bedrag (10 eenheden) gekozen. De digest werd opgeschaald te produceren genoeg verteerd fragmenten voor verdere reiniging en klonen (figuur 2B). Terwijl het is aanbevolen om blindelings DNA-fragmenten selecteren door grootte en alleen vertrouwen op de DNA-ladder voor oriëntatie te minimaliseren Gasbedwelming met behulp van DNA-fragmenten UV-licht, kunnen de gels daarna voor kwaliteitscontrole van de spijsvertering en snijden worden gekleurd. Figuur 2B toont een representatief voorbeeld van een pagina-gel uit waarin DNA fragmenten tussen 20 en 30 bp hebben is weggesneden. Gel gezuiverd MNase fragmenten werden geladen op een 20% pagina gel om succesvolle maat keuze en zuivering van MNase-verteerd fragmenten (figuur 2C) te controleren. Het protocol bij de hand is compatibel met het gebruik van aangepaste linker sequenties, toe te staan om een kloon van de MNase-verteerd fragmenten in gRNA expressievectoren van keuze. GRNA-PLKO-9 werd hier gebruikt als ruggengraat. De linkers worden versterkt uit de gRNA expressie vector gebruikt Standaardpcr. Figuur 2D beeldt een representatief voorbeeld van versterkte linker sequenties verstoken van extra, onjuiste of geen sjabloon waarbij. Vervolgens zijn linker waarbij verteerd met enzymen van de beperking om linkers op de MNase-verteerd fragmenten in de juiste richting als ligatuur zijn verbonden. Figuur 2D toont agarose gel van 5' en 3' linkers vóór en na de spijsvertering met HindIII en SacII respectievelijk, met vermelding van volledige spijsvertering van de linkers de voorspelde 637 en 295 bp. Het rechter gedeelte van de afbeelding van de gel documenteert de excisie van de verteerd linker fragmenten. Volgende gel extractie van verteerd linkers, de volgende stap in het protocol is de afbinding van linkers op de einde-gerepareerd MNase-verteerd fragmenten. Omdat het linker sequenties worden gegenereerd door PCR gebruikend unphosphorylated inleidingen, moet zelf Afbinding van linkers niet plaatsvinden. Alleen het einde herstelde MNase-verteerd DNA-fragmenten de fosfaat groepen nodig zijn voor de afbinding leveren. Na nick de vertaling, het product van de Afbinding wordt versterkt door PCR. Ter vermijding van buitensporige PCR versterking vooroordeel dat de vertegenwoordiging van de opeenvolgingen van het gRNA in de bibliotheek kan scheeftrekken, is versterking beperkt tot minder dan 20 cycli in totaal. Na PCR zijn de versterking producten moeilijk te visualiseren op agarose gel. Afzonderlijke schakelaar PCRs met 32 cycli worden daarom uitgevoerd om de producten te detecteren (maar niet worden gebruikt voor de voorbereiding van de bibliotheek). Resultaten van deze controle PCR worden weergegeven in figuur 2E. Hierdoor te optimaliseren de afbinding reacties en reacties zijn verstoken van PCR artefacten, die soms in "geen fragmenten controls voorkomen" (NFC). 2E figuur ziet u de gewenste amplicon (5' linker + fragment van DNA van 3' linker, lengte: 869 bp) volgende versterking van afbinding reacties met mengsel (1:1) verhoudingen tussen fragmenten en linker sequenties.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg"> Figuur 1 : Voorgesteld tijdlijn voor het voorbereiden van een bibliotheek gRNA. CORALINA biedt een eenvoudige en kosten-efficiënte strategie voor de generatie van uitgebreide gRNA bibliotheken van een overvloed aan verschillende DNA-bronnen van elk organisme. Het protocol bij de hand kan worden gebracht tot voltooiing tijdens een werkweek. Linker generatie kan worden uitgevoerd in parallel met DNA einde-reparatie. Voorbereiding van electrocompetent bacteriën duurt twee dagen en omvat een overnachting groei stap en moet daarom worden gestart voordat de vergadering reacties zijn ingesteld. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg"> Figuur 2 : Kritische stappen tijdens het protocol. (A) gecontroleerde spijsvertering van DNA van BAC kunt generatie van fragmenten van verschillende grootte. Hier afgebeeld is de optimalisatie van de MNase spijsvertering. Gezuiverde BAC DNA werd behandeld met verschillende hoeveelheden MNase voor 10 min. 10 U van MNase DNA-fragmenten van de gewenste lengte (20-30 bp) genereren. (B) het formaat van de selectie van fragmenten tussen 20 en 30 bp met behulp van excisie van polyacrylamide gels. Gezuiverde BAC DNA werd behandeld met 10 U van MNase gedurende 10 minuten. Het beeld werd opgenomen na excisie. (C) de controle van de kwaliteit van de gel-gezuiverd fragmenten. Na gel-zuivering, 1/6e van het gezuiverde MNase fragmenten pagina gel om succesvolle maat keuze en zuivering te controleren op een 20% werd geladen. (D) versterking van linker sequenties voor vergadering en restrictie-enzym vertering van linkers om directionele klonen. 5' en 3' linkers werden versterkt en snijd met HindIII en SacII, respectievelijk. No-template besturingselementen (NTC) werden opgenomen naar besturingselement voor PCR artefacten en verontreiniging van het DNA. Links: analytische voorbeeldtoepassing; rechts: preparatieve voorbeeldtoepassing. Beeld werd opgenomen na excisie van de gel. (E) succesvol Afbinding van linkers om DNA-fragmenten kan worden geanalyseerd met behulp van PCR met een toenemend aantal cycli van PCR (32) en gecontroleerd door controles, geen sjabloon met H2O (NTC) of met behulp van de NTC uit de voorgaande nick vertaling stap als input (NTC NT)). Het is belangrijk om op te nemen van een fragment oncontroleerbaar (NFC), wat een versterking van een afbinding en nick vertaling reactie waaruit de MNase fragmenten werden weggelaten. Alleen monsters in welke MNase fragmenten worden gecombineerd met linker DNA de verwachte amplicon produceren (869 bp). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Methoden voor het opwekken van grootschalige gRNA bibliotheken moet eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief zijn. Beschrijven we een protocol voor de productie van gRNA bibliotheken gebaseerd op enzymatische spijsvertering van DNA van het doel. Deze methode, CORALINA (uitgebreide gRNA bibliotheek generatie via gecontroleerde nuclease activiteit) presenteert een alternatief voor dure aangepaste oligonucleotide synthese.

Een universeel Protocol voor grootschalige gRNA bibliotheek productie uit elke bron van DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Het algemene doel van deze methode is het construeren van uitgebreide guide RNA-bibliotheken vanuit gezuiverd DNA van elke gewenste bron. gRNA-bibliotheken zijn plasmidencollecties die worden gebruikt in CRISPR-gebaseerde screens. De CORALINA-methode maakt gebruik van enzymatische digestie van gezuiverd DNA om de resulterende fragmenten te kloneren in een guide RNA-bibliotheekbackbone.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het alle mogelijke gids-RNA's uit de inputsequentie produceert en dat het zeer kosteneffectief is. Hoewel deze video de bescherming van een CORALINA-bibliotheek uit een bacterieel kunstmatig chromosoom demonstreert, kan deze methode in principe worden toegepast op elk type input-DNA van elk organisme. Voor elke nieuwe batch micrococcale nuclease moet een optimalisatie van de digestie met micrococcale nuclease worden uitgevoerd.Stel het volgende samen voor elke reactie: 1 µL 10x micrococcal nucleasebuffer, 1x bovine serumalbumine, 1 µg target-DNA, 1 µL micrococcal nuclease en water tot een totaalvolume van 10 µL. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.Inactiveer het enzym onmiddellijk door één µL 500 mM EGTA toe te voegen. Voeg monsterbuffer met gellaadkleurstof toe aan de DNA-monsters en breng één µg DNA per put aan in een 20% polyacrylamidegel. Breng een geschikte DNA-ladder aan voor groottebepaling.Run de gel in 1x TBE-runbuffer bij 150 volt gedurende ongeveer 1,5 uur of totdat het onderste kleurfront het onderste uiteinde van de gel bereikt. Kleur de gel met een ultrasensitieve nucleïnezuurkleurstof en visualiseer deze onder UV-licht. In dit voorbeeld was de optimale concentratie micrococcal nuclease voor het verteren van het DNA tot een grootte van 20 tot 30 baseparen 10 units.Gebruik deze optimale concentratie van micrococcaal nuclease om 10 tot 12 micrograms target-DNA te verteren op dezelfde wijze als gedemonstreerd bij de optimalisatiereacties. Na het scheiden van de DNA-fragmenten via PAGE, gebruikt u een steriel scalpel om de gel naast de markerbaan door te snijden en kleurt u alleen het deel van de gel dat de ladder bevat met verse 1x TBE-loopbuffer die een ultrasensitieve nucleïnezuurkleurstof bevat. Visualiseer de DNA-ladder en gebruik een scheermesje om de met micrococcaal nuclease verteerde DNA-fragmenten uit te snijden in het groottebereik tussen ongeveer 18 en 30 basenparen.Breng de gelplak over naar een microcentrifugebuisje. Kleur het resterende deel van de gel met een nucleïnezuurkleurstof zoals eerder beschreven. Stel de gel bloot aan UV-licht en maak een afbeelding als bewijs van de stap van de gelexcisie.Begin deze procedure door met een steriele pipetpunt de uitgesneden gelplak tegen de wand van de microcentrifugebuis te pletten. Voeg twee gelvolumes PAGE-solubilisatiebuffer toe en incubeer 16 uur bij 37 °C op een roterend plateau. Centrifugeer de monster op de volgende dag in een microcentrifuge gedurende één minuut op maximale snelheid.Breng de supernatvloeistoffen over naar een nieuwe microcentrifugebuis, waarbij u erop let dat er geen verbrijzelde gelstukjes worden overgebracht. Voeg 0,5 volumes PAGE-solubilisatiebuffer toe aan het gelpellet, vortex en herhaal de centrifugatie. Combineer de supernatvloeistoffen en extraheer de DNA-fragmenten met behulp van een standaard fenol-chloroformextractiemethode zoals beschreven in het tekstprotocol.Amplificeer, parallel aan de isolatie van de DNA-fragmenten, de linkers van de gids-RNA-expressievector met behulp van standaard PCR. Om directionele klonering te waarborgen, worden de linkers vervolgens verteerd met de passende restrictie-enzymen zoals beschreven in het tekstprotocol. Analyseer de restrictie-enzymvertering van de linkers op een agarosegel van één procent.Snij de juiste banden uit en zuiver het DNA uit de uitgesneden gelstukken met een gel-extractiekit. Een DNA-bluntingkit wordt gebruikt voor de end-reparatiereactie. Voeg het volgende toe aan een microcentrifugebuisje.10 µL gezuiverd DNA, 1,5 µL 10x blunting-buffer, 1,5 µL 1 mM dNTP-mix, 1,4 µL water en 0,6 µL blunting-enzym. Incubeer 30 minuten bij 22 °C en verwarm vervolgens het enzym om het te activeren door incubatie bij 70 °C gedurende 10 minuten. Voeg 85 µL water toe en voer een reactiereiniging uit zoals beschreven in het tekstprotocol.Stel een ligatiereactie van 14 µL op met gelijke molaire hoeveelheden van met micrococcaal nuclease verteerde en gerepareerde fragmenten en linkersequenties, zoals beschreven in het tekstprotocol. Na de nick-translatie wordt het ligatieproduct geamplificeerd via PCR. Om micrococcaal nuclease-fragmenten met de correct aangehechte 5'- en 3'-linkers te scheiden van fragmenten met twee 5'- of twee 3'-linkers, worden alle PCR-reacties van 15 cycli gecombineerd, waarna DNA-laadkleurstof wordt toegevoegd en deze op een 0,8% agarosegel worden gerund.Snijd de prominente band bij 869 basenparen uit en zuiver het DNA met een gel-extractiekit. Kwantificeer de DNA-hoeveelheid met een spectrofotometer. Clone vervolgens de PCR-geamplificeerde fragmenten in de guide RNA-expressievector via Gibson-assemblage, zoals gedetailleerd in het tekstprotocol.Om met deze procedure te beginnen, verdeelt u het gezuiverde vector-insert-construct in aliquoten in steriele en vooraf gekoelde PCR-buisjes en bewaart u deze op ijs. Koel electroporatiecuvetten met een tussenruimte van één millimeter op ijs. Voeg 25 µL vers bereide TG1-cellen direct toe aan één aliquot DNA en breng het mengsel onmiddellijk over in een electroporatiecuvette.Tik of schud de cuvette kort om ervoor te zorgen dat het mengsel van cellen en DNA over de gehele lengte van de cuvettekamer is verdeeld, zonder ingesloten lucht of bellen. Plaats de cuvette in de sleuven en start het juiste elektroporatieprogramma. Voeg onmiddellijk 475 µL kamertemperatuur 2TY toe aan de cuvette.Breng de geëlektroporeerde bacteriën over naar een buis van 50 milliliter. Herhaal de individuele elektroporaties, verzamel alle cellen die zijn getransformeerd met één library in één buis van 50 milliliter en noteer het totale volume. Om het totale aantal kolonies voor de gehele library te schatten, wordt een gedefinieerde kleine hoeveelheid bacteriën die zijn getransformeerd met de library uitgeplaat op een agarplaat van 10 centimeter met de passende antibiotische selectie.Om het volume van de resterende bacteriën te verminderen, centrifugeert u bij ongeveer 4.000 g gedurende 10 minuten of totdat er een zichtbare pellet is gevormd en het supernatant helder oogt. Verwijder al het supernatant, behalve enkele milliliters, en resuspendeer de cellen. Plaats de bacteriën op met 2TY-agar gecoate bioassay-schalen die de juiste antibioticaselectie bevatten.Verdeel een geschikt volume van de pUC19-controlevloeistof van de elektroporatiereactie over een extra agarplaat van 10 centimeter met de juiste antibiotische selectie. Incubeer de agarplaten gedurende een nacht bij 37 °C. Tel de volgende dag het aantal koloniën op de controleplaten om het aantal colony forming units per µg DNA voor de bacteriën en de complexiteit van de library te schatten.Schraap tot slot de bacteriën van de plaat voor plasmid-DNA-extractie. Na gelzuivering werd 1/6 van de gezuiverde micrococcaal nuclease-fragmenten op een 20%PAGE-gel geladen om de succesvolle selectie van de grootte en de zuivering te bevestigen. Linker-amplicons werden verteerd met restrictie-enzymen om te controleren of de linkers in de juiste oriëntatie aan de met micrococcaal nuclease verteerde fragmenten zijn geligeerd.De linkerkant van deze representatieve gelafbeelding toont 5'- en 3'-linkers vóór en na digestie met respectievelijk HindIII en SacII, wat duidt op volledige digestie van de linkers tot de voorspelde 637 basenparen en 295 basenparen. De rechterkant van de gelafbeelding documenteert de excisie van de gedigesteerde linkerfragmenten. De succesvolle ligatie van linkers aan DNA-fragmenten werd geanalyseerd middels PCR met een verhoogd aantal PCR-cycli.De gebruikte controles waren een controle zonder template, waarbij de controle zonder template uit de vorige stap van de nick-translatie als input diende, en een controle met fragmenten zonder micrococcaal nuclease. Alleen in de monsters waarin micrococcaal nuclease-fragmenten waren gecombineerd met linker-DNA werd het verwachte amplicon van 869 baseparen geproduceerd. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in vijf dagen worden uitgevoerd als dit correct wordt gedaan.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de complexiteit van de bibliotheek te behouden en andere controle-reacties uit te voeren. Na het bekijken van deze video zou u nu een goed begrip moeten hebben van hoe u een gids-RNA-bibliotheek genereert voor CRISPR-gebaseerde screens door DNA in kleine stukjes te knippen en deze in de vector-backbone van de bibliotheek te kloneren.

a-universal-protocol-for-large-scale-grna-library-production-from-any

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

De genetische reportertest is een goed gevestigd en krachtig hulpmiddel voor het ontleden van de relatie tussen DNA-sequenties en hun gen-regulerende activiteiten. Het koppelen van kandidaat-regulerende elementen aan reportergenen die identificerende sequentietags dragen, maakt massale parallelisatie van deze tests mogelijk.

Massively Parallel Reporter Testen in gekweekte zoogdiercellen

gDNA-verrijking voor NGS-sequencing is een eenvoudig en krachtig hulpmiddel voor de studie van constitutionele mutaties. In dit artikel presenteren we de procedure om eenvoudig de volledige sequentie van 11 genen te analyseren die betrokken zijn bij DNA-schadeherstel.

gDNA Verrijking door een-Transposase gebaseerde technologie voor NGS analyse van de hele reeks van BRCA1, BRCA2, En 9 genen betrokken bij DNA-schade te herstellen

Dit manuscript beschrijft een geautomatiseerde aanpak voor gelgrootteselectie voor het zuiveren van DNA-fragmenten voor next-generation sequencing. De Ranger-technologie biedt volledige automatisering van het gehele proces van agarose gel laden, elektroforetische analyse en herstel van gerichte DNA-fragmenten, waardoor high-throughput en hoge kwaliteit next-generation sequencing bibliotheken mogelijk zijn.

Geautomatiseerde Gel Size Selectie om de kwaliteit van next-generation sequencing bibliotheken Bereid uit Environmental watermonsters Verbeteren

Dit artikel demonstreert een gedetailleerd protocol voor DNA isolatie en hoge gegevensdoorvoer sequencing bibliotheek bouw van herbarium materiaal met inbegrip van de redding van uitzonderlijk slechte kwaliteit DNA.

Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens

Gel-seq kan onderzoekers gelijktijdig bereiden bibliotheken voor beide DNA - en RNA-seq op de te verwaarlozen extra kosten vanaf 100-1000 cellen met behulp van een eenvoudige hydrogel-apparaat. Dit document stelt een gedetailleerde aanpak voor de fabricage van zowel het apparaat als het biologische protocol voor het genereren van gepaarde bibliotheken.

Gel-seq: Een methode voor de voorbereiding van de bibliotheek van de gelijktijdige Sequencing van DNA en RNA met Hydrogel Matrices

Besmetting tijdens de genomic sequencing van microscopische organismen blijft een groot probleem. Hier, laten we een methode om het genoom van een beerdiertjes uit een enkel exemplaar met zo weinig als 50 pg van genomic DNA zonder het hele genoom versterking om te minimaliseren van het risico van besmetting.

Ultralow Input genoom Sequencing bibliotheek bereiding op basis van een enkel exemplaar van de Tardigrade

Hier presenteren we tekenreeks vergadering gRNA klonen (STAgR), een methode om gemakkelijk multiplex gRNA vectoren voor CRISPR/Cas9 benadert. STAgR maakt gRNA multiplex eenvoudig, efficiënt en klantgericht.

Een aanpasbare Protocol voor String vergadering gRNA klonen (STAgR)

In dit artikel presenteren en bespreken we nieuwe ontwikkelingen in de synthese en toepassingen van nucleïnezuur micro arrays die in situ zijn gefabriceerd. Concreet laten we zien hoe de protocollen voor DNA-synthese kunnen worden uitgebreid naar RNA en hoe micro arrays kunnen worden gebruikt om opvraagbaar nucleïnezuur bibliotheken te creëren.

High-density DNA en RNA micro arrays-Photolithografische synthese, hybridisatie en voorbereiding van grote nucleïnezuur bibliotheken

Dit manuscript beschrijft een genoom-schaal celgebaseerde screening benadering om extracellulaire receptor-ligand interacties te identificeren.

Celoppervlakreceptoridentificatie met genoomschaal CRISPR/Cas9 genetische schermen

We presenteren een protocol voor CRISPR-gebaseerde modulaire assemblage (CRISPRmass), een methode voor high-throughput constructie van UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek in Drosophila met behulp van openbaar beschikbare cDNA/ORF-bronnen. CRISPRmass kan worden toegepast op het bewerken van verschillende plasmidebibliotheken.

Op CRISPR gebaseerde modulaire assemblage voor high-throughput constructie van een UAS-cDNA/ORF-plasmidebibliotheek

Dit protocol biedt een methode voor de systematische wereldwijde optimalisatie van genetisch gecodeerde biosensoren door middel van geautomatiseerde generatie en beoordeling van genetische bibliotheken. Dit gaat gepaard met ontwerp-van-experimentmethodologieën om experimenten te stroomlijnen en de selectie van genetische componenten mogelijk te maken om biosensoren af te stemmen op specifieke ontwerpresultaten.

Efficiënte bemonstering van genetisch gecodeerde biosensorontwerpruimte mogelijk gemaakt met een ontwerp- en automatiseringsworkflow

Leer de CORALINA-methode voor grootschalige gRNA-bibliotheekproductie door enzymatische digestie van DNA. Dit kosteneffectieve protocol biedt een alternatief voor traditionele oligonucleotidesynthese.

Een universeel Protocol voor grootschalige gRNA bibliotheek productie uit elke bron van DNA

Meer video's verkennen